Summary
Мы представляем протокол расследовать перекрестных помех между рентген-облученных Како-2 и мононуклеаров периферической крови (МПК). Протокол начинается с Како-2 облучения и настройки культуры совместно с КСДОР; Впоследствии транс эпителиальных электрическое сопротивление измеряется регулярно за 48 h и Западная помарка, в како-2 и КСДОР.
Abstract
Протокол принят в этой работы направлена на распад как рентген возмущают функционирования кишечного барьера, сосредоточив внимание на взаимосвязи между колоректального опухолевых клеток и иммунной системы. Колоректальный рак является среди наиболее распространенный тип рака, обычно лечится хирургии, химиотерапии и лучевой терапии. Преимущества радиотерапии в ориентации опухоли хорошо известны. Однако даже ограниченного воздействия здоровых тканей, вызывает серьезную озабоченность, особенно в отношении воздействия на барьер кишечника и иммунной системы. Принятый установка позволяет изучить взаимосвязь между двумя популяции клеток в состоянии более похожий на физиологические, по сравнению с нормальной клеточной культуры. Для этой цели мы прибегаем к различные методы, и мы использовали в пробирке совместно культуры модель, основанную на како-2 клетки продифференцировано как монослоя и КСДОР, совместного использования той же среде культуры. Этот протокол был разработан сосредоточиться на макроскопические эффекты, т.е. жизнеспособность клеток и транс-эпителиальных электрического сопротивления (ТЕЕР) и через западную помарку, молекулярные изменения, т.е. активации воспалительных пути в иммунные клетки и туго Джанкшен белков в клетках Caco-2. Первоначальная оценка воздействия радиации на жизнеспособность клеток Caco-2 оценивали через 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium бромид (МТТ) и анализов Трипановый синий, в то время как ТЕЕР измерялась в фиксированных временных интервалов через омметр специально для систем совместного культуры. Таким образом может быть продемонстрирована эффекты из-за радиации, присутствие в периферической крови одноядерных клеток (КСДОР) и в конечном итоге их синергетического эффекта. Через этих дополнительных методов мы наблюдали высокой радио сопротивление Како-2 в диапазоне 2-10 гр рентгеновских лучей и повышенной проницаемости монослоя Како-2 когда получения были добавлены. В частности присутствие КСДОР было установлено быть связано с изменением в выражении белки эшафот туго Джанкшен.
Introduction
Методологии, принятой в этой работе был предназначен для исследования взаимосвязи между колоректального рака клеток и иммунной системы, используя настройки физиологического состояния, когда по сравнению с нормальной 2-мерной клеточных культур.
Колоректальные карциномы (CRC) считается третьим наиболее частый тип рака, с более чем одного миллиона случаев во всем мире (Глобальная обсерватория рака, международное агентство по изучению рака, Всемирная организация здравоохранения, http://gco.iarc.fr). Управление КПР обычно выполняется через хирургии, химиотерапии или лучевой терапии-1. По сравнению с инвазивных методов как хирургии или химиотерапии, лучевой терапии во многом избегает типичный ущерб системных реакций, вытекающие из этих клинических подходов, благодаря локализованные доставку дозы радиации. Однако побочные эффекты могут возникнуть в окружающих здоровых тканей, вызывая воспаление с прямой ущерб здоровым клеткам и повреждения при посредничестве непромысловых эффекты2,3,4. Сосредоточив внимание на неблагоприятные последствия из-за облучения во время лечения колоректального рака, два аспекта должны быть расследованы. Во-первых механизмы, отвечающие кишечных герметичности может быть изменена путем доставки излучения, вызывая, в свою очередь, возможность побочных эффектов из-за измененных сдерживания бактериальных населения и параклеточный прохождения молекул и растворенных веществ. Во-вторых присутствие кишечнике связанных лимфатической ткани (GALT) действует как форпост иммунной системы, с функцией контроля роста бактерий и посредническая общий иммунный ответ5,6,7. Для выполнения этих функций, кишечные непроницаемости хранится благодаря функции соединительной комплексов между мембраны клеток. По этим причинам индуцированного пагубные последствия из-за различных доз рентгеновского излучения были исследованы в клетках Caco-2, самостоятельно и в сотрудничестве культур с КСДОР.
Хотя проведение исследований на культурах клеток является первым по расследованию в биомедицинских исследований, отсутствие подробных знаний о механизмах вождения клеток биологии и взаимные взаимодействия различных типов клеток может стать критическим в при приближается к изучению физиологии органов, систем и аппаратов, которые не могут быть воссозданы легко в лаборатории. Таким образом мы решили принять совместное культуры ловушка, позволяя изучение двух клеточных популяций вместе и рассечение аспектов, связанных с межклеточных и внеклеточной механизмов.
Совместное культура — это метод, эксплуатируемых при изучении эпителиальных функции и взаимодействие различных типов клеток. В частности использование такой техники становится обязательным в нашем случае, потому что эпителия состоят из клеток характеризуется полярности. В случае кишечного барьера enterocytes показывают четко определенной поляризации, с апикальной и базолатеральной поляков обычно разделены вследствие наличия жесткой создание соединения молекул адгезии. Эта изолированность необходима для ткани физиологии, избегая параклеточный людьми и позволяя прохождения молекул определяется только. Эта функция, конечно, невозможно воссоздать с нормальной клетки культивирования set-up. Кроме того принятие совместного культуры set-up воспроизводит присутствие иммунных клеток только в базолатеральной поверхности, в то время как апикальной поверхности (соответствующий в просвете кишечника) не является непосредственно в контакте с другими клетками.
Недавно Како-2 клеточных линий получили большее значение как в vitro модель кишечный барьер. Хотя производные от человеческого аденокарциномы толстой кишки, Како-2 клетки поддерживать способность дифференциации и создать функциональный поляризованных монослоя8, который позволяет исследование свойств клеточной мембраны при выращивании в вставке Сопредседатель культуры.
Како-2 культивирования на пористые мембраны является моделью устоявшихся в vitro кишечных монослоя, улучшение пор Сопредседатель культуры между Како-2 и другие клетки. Эта установка была принята часто, чтобы мера перекрестных помех между различными ячейка типы9 и может использоваться для разгадать Како-2 возмущенных ответ на внешние стимулы в совместно культуры, касается Како-2, культивируемых в одиночку.
Многие исследования были рассмотрены Како-2 поведение, когда совместно культивируемых с обеих непатогенные бактерии и периферической крови мононуклеаров, прояснения, в частности уровень помех с иммунной системы10. Посо Рубио и др. 11 изучал выражение ряда цитокинов в како-2/КСДОР культуры совместно с бифидобактериями стимулирование клеток Caco-2. Их работа выделены существенные изменения цитокинов выражение профилей в зависимости от бактериальных стимуляции, в присутствие/отсутствие КСДОР. Их результаты приводят к выводу, что присутствие КСДОР ориентирующей Како-2 бифидобактерий.
Различные ответы на не патогенных и патогенных бактерий клеток Caco-2 были оценены различными исследовательскими группами. Parlesak и др. 12 продемонстрировал иммуносупрессивные последствия Како-2 клетки Escherichia coli-стимулировали КСДОР. Кроме того Халлер и др. 13 ответ Како-2 клетки стимулируется с обеих липополисахарида (LPS) от энтеропатогенные E. coli spp. или не энтеропатогенные бактерии coli i.e.E. spp., изучал Lactobacillus spp., укрепление гипотеза, что ответ Како-2 клетки строго зависит от наличия лейкоцитов в настройке совместного культуры.
Путем выполнения различных дополнительных лабораторных анализов (например Западная помарка, транс эпителиальных электрическое сопротивление, МТТ, и т.д.), помимо анализа различных типов клеток выросли в культуре сотрудничества, обещает весь методологии результаты, которые могут быть рассмотрены более представительным, что действительно происходит в естественных условиях. Кроме того эта настройка включает разделение различных Сопредседатель культуры отсеков, позволяя не только изучение используемых типов клеток, но и межклеточных сигнальных молекул, выпущенный в верхней против нижнии отсек или в присутствии против отсутствие совместного культуры.
Protocol
Следующий протокол предполагает вывод крови человека от здоровых добровольцев. Доноры предоставили письменного информированного согласия до подачи заявки. Эта процедура осуществляется в соответствии с Хельсинкской декларации и снятия крови были исполнены профессионального здравоохранения помощник.
1. клетки культуры и Сопредседатель культуры Set-up
- За одну неделю до облучения, готовят суспензию клеток Caco-2, содержащие 2,5 × 105 клеток/мл в свежих RPMI1640 среде с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамином, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина.
- Семян 2 мл суспензии клеток в стерильных 1 мкм поры диаметром клеточной культуре вкладыши для 6-ну пластин и поставить insert в 6-ну плиту.
Примечание: Вставки культуры клеток может потребоваться активироваться инкубации с стерильных полного среднего до заполнения ячейки. В этом случае культуры средств массовой информации следует отказаться и заменить ячейки подвеска СМИ. - Добавить 3 мл свежего RPMI1640 среды с 10% FBS, 2 мм L-глютамином, 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл в каждом отсеке снизу и культура клетки при 37 ° C в инкубаторе с увлажненной атмосфера, содержащая 5% CO2.
- В тот же день Како-2 клетки облучения, собирать человека цельной крови в коммерчески доступных литий гепарин покрытием 6 мл трубы (труба размер: 13 x 100 мм).
- Впоследствии изолируйте мононуклеаров периферической крови (МПК), используя градиент Ficoll. Чтобы отделить КСДОР, 25 мл Ficoll в 50 мл конические пластиковых пробирок и слой равный объем цельной крови разбавляют 1:1 с RPMI1640 на Ficoll поверхность.
Примечание: Нормальных здоровых доноров, как правило, имеет приблизительно 4-10 × 106 КСДОР/мл. - Центрифуга 50 мл трубки на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно собирать КСДОР на стыке между Ficoll и плазмы путем аспирации с пипетка Пастера и положить их в 15 мл Конические трубки.
- Вымойте КСДОР дважды, добавив 10 мл-фосфатный буфер (PBS) и центрифугирование КСДОР на 250 x g за 10 мин.
- Культура КСДОР для максимум 3-5 ч в T25 см2 фляги в полное RPMI1640 средств массовой информации, как описано ранее, при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2.
Примечание: Собирать КСДОР в день эксперимента и семян 2 × 106 клеток/Ну, приостановлено в 3 мл полного среднего RPMI1640, в нижнем отсеке Сопредседатель культуры. Вставок с Како-2 клетки передаются в скважинах содержащих КСДОР 30 мин после их облучения. КСДОР, собранные из цельной крови нельзя сохранить в культуре для более чем примерно 72 h, если не стимулировали с например. phytohaemagglutinin (ФГА), после чего теряется жизнеспособность клеток.
Предупреждение: Качество и безопасность крови и продуктов крови должна быть гарантирована на протяжении всего процесса.
2. облучение Set-up
Примечание: Облучение клеток Caco-2 была выполнена на кафедре радиотерапии Istituto di Ricovero e Cura Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Павия, Италия) с линейный ускоритель, обычно используются для лечения различных видов рака.
- Набор энергии фотона рентгеновские 6 МВ пик. Линейный ускоритель работает в пульсирующий режим (время между двух последовательных импульсов приблизительно 4 мс; длительность одного импульса о 5 МКС с дозой оценить до 1 × 10-3 гр/p).
- Поместите пластины 6-а, содержащий вставки с Како-2 на траектории рентгеновских лучей на 1.4 лист оргстекла толщиной см (соответствует на расстоянии чуть больше, чем наращивание используется радиационной) на 100 см от источника излучения.
- Место 0,5 см толщиной болюс на каждом образце до облучения возникает гарантировать компонента рассеяния излучения и равновесия заряженных частиц.
- Облучить клетки (в диапазоне доз 2-10 гр) с плоским и симметричный (± 2%) 20 x 20 см2 поля излучения дозы и -3 гр/мин.
Примечание: Управление «Шам»-облученных клетки прошли же процедурные условия облученного одни, без входа в комнату облучения (полученные дозы: 0 гр).
Предупреждение: ионизирующего излучения производители устройств должны использоваться только специализированным персоналом.
3. клетки жизнеспособности Assay (МТТ проба)
Примечание: Метаболической активности клеток Caco-2 оценивали через Пробирная 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium бромид (МТТ)14.
- Семенной 2 × 105 Како-2 в 24-ну пластине 24 ч до облучения в 1,25 мл полной среды.
- Облучить клетки, как описано в шагах 2.1-2.4, то инкубации клеток при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2.
- 21 h после облучения, 100 мкл раствора 5 мг/мл МТТ и сохранить клетки при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 на 3 ч.
- Отменить супернатант и вымыть клетки с 1 мл раствора PBS.
- Растворяют Формазаны кристаллы, добавив 500 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в каждой скважине и оценки поглощения с читателем несколькими хорошо пластины на λ = 570 Нм.
- Повторите шаг 3.3-3.4 - 3.5-3.6 в 45 h после облучения.
Примечание: Результаты отображаются как возмущение от соответствующего состояния Шам, который нормализуется до 100%.
Предупреждение: ДМСО-легковоспламеняющиеся и раздражающий агент для кожи, глаз и дыхательной системы (GHS07, GHS08). При попадании в глаза немедленно промойте обильной водой и обратиться к врачу. MTT является агентом раздражение кожи, глаз и дыхательной системы (GHS07, GHS08). В случае контакта с глазами немедленно промыть большим количеством воды и обратиться к врачу.
4. доля жизнеспособных клеток определения (Трипановый синий краситель исключения проба)
Примечание: Доля жизнеспособных клеток был оценен пробирного Трипановый синий краситель исключения.
- Семян 2 × 105 Како-2 в 24-ну пластине 24 ч до облучения в 1,25 мл полной среды.
- Облучить клетки с дозы в диапазоне 0 - 10 гр (см. шаги 2.1-2.4) затем инкубации клеток при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 за 24-48 ч.
- После того, как два выбранное время точек, вымыть клетки с PBS, отменить его, а затем добавить 100 мкл раствора трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Положите клетки при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 на 2 мин, затем добавить полного среднего арестовать ферментативной реакции.
- Собрать клетки в 1,5 мл и центрифуги трубки на 500 x g для 5 минут удалить супернатант и вновь приостановить клетки в 50 мкл PBS.
- Смесь суспензии клеток с 50 мкл раствора Трипановый синий краситель и инкубировать смесь для 3 мин при комнатной температуре.
- Граф окрашенных (нежизнеспособных) и неокрашенном (жизнеспособных) клеток с Bürker камерой.
5. Транс эпителиальных электрическое сопротивление (ТЕЕР)
- Семена 5 × 105 Како-2 клетки за одну неделю до облучения в пластине 6-ну совместно культуры вставок (полиэтилентерефталат (ПЭТ), 2 x 106 поры/см2).
- 1 ч до облучения, измерить ТЕЕР с вольтметр/омметром.
- Облучить клетки, как описано в шагах 2.1-2.4.
- Инкубируйте Како-2 клетки в присутствие/отсутствие культуры совместно с КСДОР при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2.
- За первые несколько часов после облучения, измерить ТЕЕР каждый час и впоследствии каждые 3 ч до 48 ч.
6. западной помарке анализ Клаудин-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB и XIAP
- Семена 5 × 105 клетки 1 неделю до воздействия рентгеновских лучей в 6-ну пластины со культуры вставляет (PET, 2 х 106 поры/см2) и облучить клетки, как описано в шагах 2.1-2.4.
- Инкубируйте Како-2 клетки в присутствие/отсутствие культуры совместно с КСДОР при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2.
- 48 ч после облучения, подготовить Како-2 и КСДОР lysates клетки, рассматривая клетки с лизис клеток буфера и хранить образцы при-20 ° C.
Примечание: протокол может быть приостановлена здесь. - Подсчитать количество общего белка методом bicinchoninic кислоты (BCA).
Примечание: протокол может быть приостановлена здесь. - Смешать с Laemli буфер образца с β-меркаптоэтанол равное количество общего белка (конечная концентрация β-меркаптоэтанол составляет 5%), тепло образцы на 95 ° C за 5 мин и спина их на 10000 x g.
- Загрузка образцов в 4-20% сборный гель и провести электрофорез на 120 V 1 ч. передачи белка на мембране фторид (PVDF) polyvinildiene.
- Блок сайтов связывания неспецифической по инкубации PVDF мембрану при комнатной температуре с 5% обезжиренное сухое молоко (NFDM) в PBS, добавил с 0,2% Tween-20 (PBT). Промойте мембрану в три раза с 10 мл 0,2% PBT за 5 мин.
- Проинкубируйте мембрану с нежным агитации за 1 ч при комнатной температуре подаваемой на ночь при 4 ° C с следующих первичного антитела до: анти Клаудин-1, анти ZO-1, анти ZO-2, анти afadin, анти occludin, анти NF-kB, анти XIAP и анти актина. Промойте мембрану в три раза с 10 мл 0,2% PBT за 5 мин.
- Инкубации мембран с ПХ пероксидазы хрена конъюгированных вторичные антитела для 1 ч при комнатной температуре с нежным агитации. Промойте мембрану в три раза с 10 мл 0,2% PBT за 5 мин.
- При комнатной температуре развивать фотопленок, инкубации мембран с расширенной химио светящиеся kit.
- Приобрести с системой сканирования фотопленок и количественную оценку полученных полос с программным обеспечением анализа подходящее изображение.
Примечание: Оценки Клаудин-1, Occludin, Afadin, ZO-1 и ZO-2 выполняется в клетках Caco-2. В КСДОР выполняется оценка NF-kB и XIAP.
Предупреждение: β-меркаптоэтанол токсичных (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Не дышать парами, избежать выброса в окружающую среду и носить устройства индивидуальной защиты и защиты органов дыхания. При проглатывании немедленно попросите медицинскую консультацию.
7. Статистический анализ
- Чтобы определить ли радиационного облучения и Сопредседатель культуры побудить статистически возмущений, выполните тест двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с нескольких сопоставлений для повторных измерений (с Бонферрони пост hoc тесты для сравнения Репликация означает).
- Если иное не указано, вычисления статистической значимости (p) на двух Стьюдента t тест. Каждое значение является среднее ± независимых экспериментов ≥3 Стандартная ошибка означает (SEM).
Representative Results
Одна неделя до эксперимента, клетки посеяно на пористые мембраны вставки и позволено расти в течение следующих дней. Можно контролировать уровень слияния, либо с помощью инвертированного микроскопа или через измерение ТЕЕР значения. Действительно во время фазы роста, ТЕЕР продолжает расти, пока не был покрыт всех пористых мембран клеток и они формируют дифференцированных клеток монослоя. Если клетки размножаются быстрее/медленнее, эксперимент может начаться раньше/позже точках после выполняется заполнение. Когда при впадении, клетки затем доводятся до облучательной установки, минимизации установленные экологического стресса (температуры или рН), перед началом совместного культуры с/без КСДОР, семенами в нижнем отсеке (рис. 1А), или оценки распространения клеток Caco-2. Учитывая Начальная плотность посева на день 0 клетки должны достичь 100% слияния и создания дифференцированной монослоя эпителиальных клеток, которые можно наблюдать на плато в ТЕЕР, показанный на рисунке 1B. После того, как клетки достичь такого состояния, значение ТЕЕР хранится относительно постоянной на следующей неделе, до тех пор, как старый питательной среды заменяется свежей среды, по крайней мере один раз в неделю (рис. 1Б). Как показано на рисунке 1C, пробирного МТТ не показывают статистически значимого изменения пролиферативной статус клеток Caco-2 24 ч ни на 48 ч, независимо от дозы, полученной (до 10 гр).
Другой результат наблюдался относительно краткосрочной смертности Како-2 клетки. В обеих точках времени Трипановый синий пятнать Показать дозозависимое увеличение смертности ячейки. Эти результаты показывают ясно эффект облучения, хотя процент мертвых клеток, как представляется, быть очень низким, особенно при рассмотрении, что самая высокая доза поставленный (10 гр) производит лишь примерно 20% гибели клеток (рис. 1D).
Образцы были совместно культивируемых, с или без КСДОР в нижнем отсеке. Учитывая тот факт, что КСДОР не получают каких-либо внешний стимул, чтобы размножаться, 48 h эксперимент считался идеальным избежать предвзятости, представленный КСДОР начинает умирать. Таким образом от непосредственно перед облучения, ТЕЕР регулярно измерялось в течение 48 часов, чтобы отслеживать возможные переходные эффекты, вызванные протокол облучения. Как показано на рисунке 1 E-F, ТЕЕР значения представлены в виде относительного вариации в отношении предварительно обработанного состояния (которые были порядка 1200-1500 Ω·cm2) лучше выделить возмущений, вызванных рентгеновского облучения и или наличие/отсутствие КСДОР в сотрудничестве культуры. В обоих случаях первоначальных переходных пик можно ясно увидеть на первом этапе после радиационного облучения, которые можно отнести к процедуре облучения.
Когда не в культуре совместно с КСДОР (Рисунок 1E), ТЕЕР значения почти постоянной вверх до 48 ч, после 10 гр рентгеновских лучей, клетки показывают длительное снижение ТЕЕР начало в 3 ч после облучения. Присутствие получения полностью изменяет ТЕЕР временная динамика (рис. 1F). Для всех доз сокращение ТЕЕР наблюдается явно от 3 ч до примерно 30 ч после облучения, когда ТЕЕР появляется поселиться на постоянное значение (рис. 1F).
В лизатов клетки Caco-2 через западную помарку пробирного были расследованы туго Джанкшен комплексы выражение уровня. Како-2 клетки были воздействию ионизирующего излучения (с дозы 0, 2 и 10 гр) и впоследствии вырос самостоятельно или в сотрудничестве культуре с получения в нижнем отсеке для 48 h (как показано на рисунке 2A-F). Чтобы быть существенно не изменяется под рентген и/или совместного культуры с КСДОР были найдены Клаудин-1 и Occludin (рис. 2A, 2B). Вместо этого большие колебания наблюдались в эшафот белки ZO-1, ZO-2 и Afadin (рис. 2C, 2D, 2E). В частности снижение уровня выражения ZO-2 наблюдается уже после 2 гр когда в культуре совместно с КСДОР только при 10 гр когда Како-2 росли только. Afadin уровни выражения вместо затронуты только после 10 гр рентгеновских лучей, дополнительное сокращение когда Како-2 совместно культивируемых с получения.
Получения совместно культивируемых с Како-2 были проанализированы относительно воспалительные состояния, в частности, исследованы ядерного транскрипционного фактора kB (NF-kB) и Х-хромосомой Ингибитор апоптоза уровни белка (XIAP) (рис. 2 G-я). NF-kB общая сумма не пострадал от совместного культуры с Како-2 различные излучения дозы (рис. 2G). Напротив XIAP уровни были 4 раза вверх регулируется в 2 гр и 10 гр. Сопредседатель культур, хотя большие изменения требуют большее количество образцов, проанализированы, чтобы уменьшить такие колебания и получить лучше статистической мощности.
Как показано на рисунке 2F и 2I, некоторые неспецифичных может появиться рядом с ожидаемой молекулярный вес протеина интереса. Если true и неспецифической полосы легко различимы, следует рассмотреть различные антитела или концентрацию BSA или NFDM.
Рисунок 1 . В целом экспериментальной установки и макроскопические эффекты облучения и/или совместного культуры КСДОР. A) схематически модели совместного культуры. B) ТЕЕР измеренная ежедневно от начального Како-2 клетки, чтобы оценить состояние надлежащего роста и дифференцировки монослоя. Жизнеспособность клеток C) и D) смертности в како-2 подвергнуться рентгеновских лучей (0, 2, 5 и 10 гр). ТЕЕР E) измерения в клетках Caco-2 облученных 0, 2 и 10 гр рентгеновских выращиваются без или F) с получения. Каждое значение является среднее ± независимых экспериментов ≥3 SEM. * p Валь < 0,05; ** p ва l < 0.01; p Валь < 0,001. Графов адаптированы из Morini и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Западной помарке результаты Како-2 и КСДОР лизатов. Уровень экспрессии туго Джанкшен белков (Клаудин-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) и Afadin (E)) в како-2 после 0, 2 и 10 гр от рентгеновских лучей и наличие/отсутствие КСДОР в сотрудничестве культуры. Значения нормализованы на уровне актина. Наглядные фильмы для каждой жесткой перехода белка и условия, отображаемые в панели (F). Уровень экспрессии NF-κB (G) и XIAP (H) в репликацию, совместно культивируемых клеток Caco-2. Представитель пленки для NF-kB, XIAP и актина, отображаемые в панели. Каждое значение является среднее ± независимых экспериментов ≥3 SEM. графов адаптированы из Morini и др. 15. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Колоректальный рак, с ее высокой вхождения в развитых странах, является одним из наиболее частых причин заболеваемости и смертности населения. Это обычно управляется хирургии, химиотерапии и лучевой терапии1. В рамках лечения лучевой терапии особое внимание должно уделяться воздействию облучения здоровых тканей4; Кроме того систематические исследования о взаимосвязи между радиационного облучения и иммунной системы являются основополагающими для разработки подходов, Радио иммунотерапия3.
Методология, которую мы приняли в этой работе было специально для расследования Како-2 клетки и КСДОР перекрестных помех. Мы сосредоточили внимание на эффект воздействия рентгеновских лучей опухолевых клеток, но тот же протокол может быть адаптирована к исследованиям с фармакологическими агентами. Находясь ближе к физиологических условиях в отношении культивирования стандартной ячейки, сильным преимуществом данного метода является возможность полного рассечение сложной системы, учитывая возможность анализа различных типов клеток и выпуска сигнальных молекул в двух отсеков Сопредседатель самой культуры. Таким образом регулярно применяются биологические методы могут помочь пониманию сотовых взаимосвязи соответствующих механизмов.
Первоначальные Квалификация рентген-индуцированной воздействие на клетки Caco-2 было основано на двух дополнительных измерений, т.е. MTT колориметрические пробирного и Трипановый синий краситель исключения испытаний. Очевидно противоречивые результаты можно объяснить различными фокус этих двух анализов. MTT оценивает Оксидоредуктазы активности ферментов, а Трипановый синий краситель основан на краситель механизм исключения живой клетки.
Расследование Како-2-КСДОР взаимодействие требует создания эпителиальных монослоя, способны привести к полное разделение между двумя отделениями совместно культуры. Возможность заполнения Како-2 клетки в сотрудничестве культуры insert позволяет облучение только этой популяции клеток. Поскольку совместное культуры начинается после облучения, существует без предвзятости из-за любого случайного воздействия КСДОР. Эта настройка должен быть тщательно обработаны, чтобы избежать повреждения (или загрязнение) для сотовых монослоя во время движения вставки из одного 6-ну плиты к другой. Когда тщательно выполнены, ТЕЕР измерения являются простой и неинвазивный метод расследовать проницаемость монослоя. Этот assay строго относящиеся к настройке совместного культуры, и это не единственный выбор для расследования проницаемости монослоя. Это позволяет хорошую воспроизводимость мер после того, как хорошо он откалиброван с свежий полного среднего. Общие анализы сосредоточиться на распространение химических красителей для нижней «базолатеральной» один из верхних «верхушечный» отсека (например флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-пробирного декстрана)16. Однако поскольку КСДОР присутствуют в отсеке базолатеральной в этом исследовании, мы решили избегать введение химических реагентов в экспериментах.
Среди различных методов, применяемых в этой работе ТЕЕР измерение является только один, который требует совместного культуры set-up17,18. Однако другие общие лабораторные методы обеспечивают более информативные результаты при применении к клеткам в культуре сотрудничества, поскольку они позволяют расследования ближе к физиологической условий установки и данные имеют сильнее биологическое значение. С другой стороны необходимо отметить, что использование клеток, выращенных на пористых поддержки может привести к некоторые трудности в работе, необходимой для подготовки образцов, таких как lysis клетки для приготовления клеточных экстрактов для анализа через западный blotting.
Принятая в настоящем исследовании система имеет потенциал для дальнейшего улучшения, например с применением веществ воссоздать окружение внеклеточного матрикса. Однако это также приведет к увеличению сложности системы, и полный рассечение настройки будет более трудно достичь.
Настройки для совместного культуры клеток, несомненно, представляют мощный инструмент для продвижения в vitro исследования и для понимания сложных систем. Эта технология обладает потенциалом для повышения знаний о фундаментальных механизмов, предоставляя новые материалы для базовых исследований на молекулярных сигналов и с возможным приложениям модуляции активности иммунной системы в рамках Онкологическая клинических пациента управления.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Итальянский институт ядерной физики (INFN) частично финансировать эту работу в рамках проекта INFN-Меридиан. Авторы признают Edoardo Milotti профессор (Кафедра физики, Университет Триеста, Италия) для координации проекта INFN-Меридиан; Д-р Роберто Chignola (Кафедра биотехнологии, Университет Вероны, Италия) для предоставления Како-2 клетки, омметр и за его ценную помощь и обучение. Мы также признаем Agnese Солари для оказания технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
| Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
| Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
| CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
| Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
| Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
| Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
| Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
| Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
| Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
| Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
| Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
| Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
| Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
| Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
| BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
| Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
| 10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
| Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
| Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
| ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
| ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
| Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
| Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
| Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
| Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
| Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
| Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |
References
- Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
- Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
- Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
- Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
- Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
- Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
- Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
- Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
- Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
- Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
- Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
- Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, (March) 1-12 (2017).
- Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).
