Summary
Vi presenterar ett protokoll för att undersöka överhörning mellan X-stråle-bestrålade Caco-2 och perifera mononukleära blodceller (PBMC). Protokollet börjar med Caco-2 bestrålning och uppställning av samtidig kultur med PBMC; Därefter mäts trans-epitelial resistans regelbundet över 48 h och western blot utförs i både Caco-2 och PBMC.
Abstract
Protokollen som antogs i detta arbete syftar till att nysta upp hur röntgen stör tarmbarriären, funktionssätt med fokus på samspelet mellan kolorektal tumörceller och immunsystemet. Kolorektal cancer är bland den vanligaste typen av cancer, vanligtvis behandlas med kirurgi, kemoterapi och strålbehandling. Fördelarna med strålbehandling i inriktning tumören är väl kända. Ännu begränsad exponeringar av friska vävnader är dock av stor oro, särskilt när det gäller effekterna på tarmbarriären och immunsystemet. Den antagna setup tillåter för att studera samspelet mellan två cellpopulationer i ett skick som mer liknar den fysiologiska, jämfört med normala cellkulturer. För detta ändamål vi tillgripa olika tekniker och använde vi en in vitro- samtidig kultur, baserat på Caco-2-celler differentierade som en enskiktslager och PBMC, dela samma odlingssubstratet. Detta protokoll har utvecklats att fokusera på både makroskopisk effekter, dvs cellernas viabilitet och Trans-epitelial elektriska motstånd (TEER), och genom western blot, molekylära förändringar, dvs aktivering av inflammatoriska clearanceväg immunceller och den åtsittande föreningspunkt proteinuttryck i Caco-2-celler. Första utvärdering av strålningseffekter på Caco-2 cellviabilitet bedömdes via 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid (MTT) och Trypan blå analyser, medan TEER mättes vid fasta tidsintervall genom en ohmmeter speciellt utformat för samtidig kultur system. På detta sätt kan effekterna på grund av strålning, förekomsten av perifert blod mononukleära celler (PBMC) och så småningom deras synergistisk effekt, påvisas. Genom dessa kompletterande tekniker observerat vi en hög radio-motstånd för Caco-2 inom spänna av 2-10 Gy av röntgen och en ökad Caco-2 enskiktslager permeabilitet när PBMC lades. I synnerhet befanns PBMC närvaro vara associerade med variationen i åtsittande föreningspunkt byggnadsställning proteiner uttrycket.
Introduction
Den metod som antagits i detta arbete var utformade för att undersöka samspelet mellan kolorektal cancerceller och immunsystemet, att utnyttja en set-up närmare det fysiologiska villkor jämfört med normala 2-dimensionella cellkulturer.
Kolorektal cancer (CRC) anses vara den tredje vanligaste typen av cancer, med mer än en miljon fall i hela världen (Global Cancer Observatory, internationella byrån för forskning om Cancer, Världshälsoorganisationen, http://gco.iarc.fr). Hantering av CRC utförs rutinmässigt via antingen kirurgi, kemoterapi eller strålbehandling1. Jämfört med invasiva metoder såsom kirurgi eller kemoterapi, undviker strålbehandling i stor utsträckning de typiska negativa systemiska reaktioner som härrör från dessa kliniska metoder, tack vare lokaliserade leverans av stråldosen. Men kan biverkningar uppstå i de omgivande friska vävnader, utlöser inflammation med direkta skador på friska celler och skador medierade av icke öronmärkt effekter2,3,4. Fokusera på de negativa effekterna på grund av bestrålning under behandling av kolorektal cancer, måste två aspekter undersökas. Först, mekanismerna som ansvarar för intestinal ogenomtränglighet kunde ändras genom strålning leverans orsakar, i sin tur risken för biverkningar på grund av en förändrad inneslutning av bakteriepopulation och paracellular passage av molekyler och lösta ämnen. För det andra, förekomsten av gut-associerad lymfatisk vävnad (GALT) fungerar som en utpost av immunsystemet, med funktionen att kontrollera bakterietillväxt och medla den allmänna immunsvar5,6,7. För att uppfylla dessa funktioner, hålls intestinal ogenomtränglighet på grund av funktionen av Junktional komplex mellan cellernas membran. Av dessa skäl undersöktes de inducerade skadliga konsekvenserna på grund av olika doser av röntgenstrålning i Caco-2-celler ensam och i samtidig kulturer med PBMC.
Även om studier på cellkulturer är den första setline av undersökningen i biomedicinsk forskning, kan bristen på detaljerad kunskap om drivkrafterna bakom cell biologi och ömsesidiga interaktioner mellan olika celltyper bli kritisk när närmar sig studier av fysiologi av organ, system och apparater som inte kan återskapas enkelt i laboratoriet. Därför, vi beslutat att anta en gemensam kultur set-up, tillåter både studien av två cellpopulationer grupp och dissektion av aspekter som rör intercellulära och extracellulära mekanismer.
Samtidig kultur är en teknik som utnyttjas när man studerar epitelial funktioner och samspelet mellan olika celltyper. I synnerhet blir användningen av sådan teknik obligatoriskt i vårt fall, eftersom epitel består av celler kännetecknas av polaritet. När det gäller tarmbarriären, enterocyter visar en väldefinierad polarisering, med apikala och basolateral stolpar åtskilda normalt på grund av tight junction-skapa adhesionsmolekyler. Denna uppdelning behövs för vävnad fysiologi, undvika paracellular människohandel och att tillåta passage av beslutsamma molekyler endast. Denna funktion är naturligtvis omöjligt att återskapa med en normal cell odlingsskålar set-up. Antagandet av samtidig kultur set-up återger dessutom förekomsten av immunceller endast i basolateral ytan, medan den apikala ytan (motsvarande intestinala lumen) inte är direkt kontakt med andra celler.
Nyligen, Caco-2 cellinjer vunnit mer betydelse som en in vitro- modell av tarmbarriären. Även om härrör från mänskliga kolon adenokarcinom, Caco-2-celler upprätthålla differentiering och skapa en funktionell polariserade enskiktslager8, vilket gör att utredningen av cellmembranet egenskaper när den odlas i en samtidig kultur infoga.
Eftersom Caco-2 odling på ett poröst membran är en väletablerad in vitro- modell av intestinal enskiktslager, har en förbättring varit samtidig kulturen mellan Caco-2 och andra celler. Detta upplägg har antagits vanligt till åtgärd överhörning mellan olika cell typer9 och kan användas för att nysta upp Caco-2 oroade svar på yttre stimuli när i samtidig kultur, med avseende på Caco-2 odlade ensam.
Många studier har behandlat Caco-2 beteende när Co odlade med både icke-patogena bakterier och perifera mononukleära celler, att belysa särskilt överhörning med immunsystemet10blod. Pozo-Rubio o.a. 11 studerade uttrycket av flera cytokiner i en Caco-2/PBMC samtidig kultur med bifidobakterier stimulera Caco-2-celler. Deras arbete belyst väsentliga ändringen till cytokin uttrycket profiler beroende på bakteriell stimulering utförd i närvaro/frånvaro av PBMC. Deras resultat leder till slutsatsen att förekomsten av PBMC väcker intresse Caco-2 till bifidobakterier.
Olika svar av Caco-2-celler på icke-patogena och patogena bakterier har bedömts av olika forskarlag. Parlesak et al. 12 visat Caco-2-celler immunsuppressiva effekter på Escherichia coli-stimulerade PBMC. Dessutom Haller et al. 13 studerade Caco-2-celler stimuleras med båda lipopolysackarid (LPS) svar från enteropathogenic E. coli spp. eller icke-enteropathogenic bakterier i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., stärka den förmodan att Caco-2 cellernas svar strikt beror på närvaron av leukocyter i samtidig kultur set-up.
Genom att utföra olika kompletterande laboratorieanalyser (t.ex. western blot, trans-epitelial elektriska motstånd, MTT, etc.), förutom analysen av olika celltyper som odlas i samtidig kultur, hela metoden lovar resultat som kan anses vara mer representativ för vad som verkligen händer i vivo. Dessutom möjliggör detta upplägg separation av de olika samtidig kultur fack, så att inte bara studier av celltyper som är inblandade utan också de intercellulära signalmolekyler som släppt i det övre vs. nedre facket eller närvaro vs avsaknad av samtidig kultur.
Protocol
Följande protokoll innebär humanblod tillbakadragande från friska frivilliga. Givare som skriftligt informerat samtycke före inskrivning i studien. Detta förfarande är i enlighet med Helsingforsdeklarationen och blod uttag utfördes av en professionell hälso-och assistent.
1. cell kultur och samtidig kultur Set-up
- En vecka före bestrålning, Förbered en Caco-2 cellsuspension innehållande 2,5 × 105 celler/mL i färsk RPMI1640 medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin.
- Utsäde 2 mL cellsuspension i sterila 1 µm-pore diameter cellodling skär för 6 brunnar och sätta in i en 6-well platta.
Obs: Cell kultur skär kan behöva aktiveras genom inkubation med steril komplett medium före cellen sådd. I det här fallet bör kultur media kasseras och ersättas med cell suspension media. - Lägg 3 mL färsk RPMI1640 medium kompletteras med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 IE/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin i varje bottenfack och odla cellerna vid 37 ° C i en inkubator med fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2.
- På den samma dagen av Caco-2 cell bestrålning, samla humant helblod i kommersiellt tillgängliga litium-heparin belagda 6 mL rör (tube storlek: 13 x 100 mm).
- Därefter, isolera perifera mononukleära blodceller (PBMC) med hjälp av Ficoll lutning. Att separera PBMC, sätta 25 mL Ficoll i en 50 mL konisk centrifugrör och lager en lika stor volym av helblod utspädd 1:1 med RPMI1640 på Ficoll yta.
Obs: En normal frisk donator har vanligtvis cirka 4-10 × 106 PBMC/mL. - Centrifugera 50 mL tuberna vid 400 x g i 30 min i rumstemperatur.
- Försiktigt samla PBMC på gränssnittet mellan Ficoll och plasma genom aspiration med en Pasteur-pipett och sätta dem i en 15 mL koniska rör.
- Tvätta PBMC två gånger genom att tillsätta 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugering PBMC vid 250 x g i 10 min.
- Kultur PBMC för högst 3-5 h i T25 cm2 kolvar i slutföra RPMI1640 media, som beskrivits tidigare, vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2.
Obs: Samla PBMC dagen i experimentet och utsäde 2 × 106 celler per brunn, upphängd i 3 mL för komplett RPMI1640 medium, i nedersta facket av samtidig kultur. Skär med Caco-2-celler överförs i PBMC-innehållande wells 30 min efter deras bestrålning. PBMC samlas in från helblod kan inte vara underhålls i kultur för mer än ungefär 72 h, om inte stimuleras med t.ex. fytohemaglutinin (PHA), varefter cellernas livskraft är förlorad.
FÖRSIKTIGHET: Kvalitet och säkerhet av alla blod och blodprodukter måste garanteras genom hela processen.
2. bestrålning Set-up
Obs: Bestrålning av Caco-2-celler utfördes vid strålbehandling Institutionen för Istituto di Ricovero e Cura ett Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Italien) med en linjäraccelerator som rutinmässigt används för att behandla olika typer av cancer.
- Ange röntgen fotonenergi 6 MV peak. Den linjär acceleratorn driver i en pulserande regim (tiden mellan två på varandra följande pulser ungefärligt av 4 ms, varaktigheten av en enda puls om 5 µs med en dos Betygsätt upp till 1 × 10-3 Gy/p).
- Placera 6-väl plattorna som innehåller skär med Caco-2 på banan för röntgen på 1,4 cm tjock Plexiglas ark (motsvarande ett avstånd som är något större än uppbyggnaden av strålningen som används) på 100 cm från källan till strålning.
- Placera en 0,5 cm tjock bolus på varje prov innan bestrålning sker för att garantera komponenten bakåtspritt strålning och den laddade partiklar equilibriumen.
- Bestråla cellerna (doser inom intervallet 2-10 Gy) med ett platt och symmetrisk (± 2%) 20 x 20 cm2 strålfält och en dos-hastighet av 3 Gy/min.
Obs: Kontrollera ”bluff”-bestrålade celler genomgick samma processuella villkor av de bestrålade, utan att ange bestrålning rummet (mottagna dos: 0 Gy).
FÖRSIKTIGHET: joniserande strålning-producerande enheter får endast användas av specialiserad personal.
3. cell livskraft Assay (MTT Assay)
Obs: Caco-2 cells metaboliska aktivitet utvärderades genom den 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid (MTT) assay14.
- Utsäde 2 × 105 Caco-2 i en 24-well platta 24 h före bestrålning i 1,25 mL av komplett medium.
- Bestråla cellerna som beskrivs i steg 2.1-2.4 sedan Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2.
- 21 h efter bestrålning, tillsätt 100 µL av 5 mg/mL MTT lösning och hålla cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 för 3 h.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 1 mL PBS.
- Lös upp formazan kristaller genom att lägga till 500 µL av dimetyl sulfoxid (DMSO) i varje brunn och utvärdera absorbansen med en flera Plattläsare vid λ = 570 nm.
- Upprepa steg 3.3-3.4 - 3.5-3.6 på 45 h efter bestrålning.
Obs: Resultaten visas som en störning från motsvarande sham villkora, som är normaliserade till 100%.
Varning: DMSO är eldfarlig och irriterande agent för huden, ögonen och andningsorganen (GHS07, GHS08). Vid kontakt med ögonen, skölj omedelbart med rikligt med vatten och uppsök läkare. MTT är ett irriterande medel för huden, ögonen och andningsorganen (GHS07, GHS08). Vid kontakt med ögonen, skölj omedelbart med rikligt med vatten och uppsök läkare.
4. andel av viabla celler bestämning (Trypan blått färgämne utslagning Assay)
Obs: Procentandel av viabla celler bedömdes av Trypan blå färgämnet utslagning assay.
- Utsäde 2 × 105 Caco-2 i 24-väl tallrik 24 h före bestrålning i 1,25 mL av komplett medium.
- Bestråla cellerna med doser inom intervallet 0 - 10 Gy (se steg 2.1-2.4) sedan Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 för 24-48 h.
- Efter två valda tiden poäng, tvätta cellerna med PBS, kassera den och tillsätt 100 µL av Trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra lösningen. Lägg komplett medium för att arrestera den enzymatiska reaktionen sedan sätta cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 i 2 min.
- Samla in cellerna i ett 1,5 mL-rör och centrifugera röret vid 500 x g i 5 min. Kassera supernatanten och Slamma upp cellerna i 50 µL av PBS.
- Blanda cellsuspension med 50 µL Trypan blått färgämne lösning och inkubera blandningen under 3 minuter vid rumstemperatur.
- Räkna de färgade (icke-viabla) och ofärgade (viabla) celler med en Bürker kammare.
5. Trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER)
- Utsäde 5 × 105 Caco-2 celler en vecka före bestrålning i 6-väl plattan samarbete kultur skär (polyetentereftalat (PET), 2 x 106 porer/cm2).
- 1 h före bestrålning, mäta TEER med en voltmeter/ohmmeter.
- Bestråla cellerna som beskrivs i steg 2.1-2.4.
- Inkubera Caco-2-celler i närvaro/frånvaro av samtidig kultur med PBMC vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2.
- För det första några timmar efter strålning, mäta TEER varje timme, och därefter varje 3 h upp till 48 timmar.
6. Western Blot analys av Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB och XIAP
- Utsäde 5 × 105 celler 1 vecka innan röntgen exponering i 6-well plate samtidig kultur infogar (PET, 2 x 106 porer/cm2) och bestråla cellerna som beskrivs i steg 2.1-2.4.
- Inkubera Caco-2-celler i närvaro/frånvaro av samtidig kultur med PBMC vid 37 ° C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2.
- 48 h efter bestrålning, Förbered Caco-2 och PBMC cell lysates genom att behandla celler med cellys buffert och lagra prover vid-20 ° C.
Obs: protokollet kan pausas här. - Kvantifiera totalprotein beloppet av bicinchoninic syra (BCA) metod.
Obs: protokollet kan pausas här. - Blanda lika mängder totala proteiner med Laemli prov buffert till med β-merkaptoetanol (slutlig koncentration av β-merkaptoetanol är 5%), värm proverna vid 95 ° C i 5 min och snurra dem vid 10 000 x g.
- Load prover i en 4-20% förtillverkade gel och utföra elektrofores vid 120 V för 1 h. överföring proteiner på ett polyvinildiene fluor (PVDF) membran.
- Blockera icke-specifik bindning platser genom ruvning PVDF membran vid rumstemperatur med 5% fettfri torr mjölk (NFDM) i PBS med 0,2% Tween-20 (PBT). Tvätta membranet tre gånger med 10 mL 0,2% PBT för 5 min.
- Inkubera membranet med mild agitation för 1 h i rumstemperatur före släpps över natten vid 4 ° C med följande primära antikroppar: anti-claudin-1 anti-ZO-1, anti-ZO-2, anti-afadin, anti-occludin, anti-NF-kB, anti-XIAP och anti aktin. Tvätta membranet tre gånger med 10 mL 0,2% PBT för 5 min.
- Inkubera membran med pepparrot peroxidas HRP-konjugerad sekundära antikroppar för 1 h i rumstemperatur med försiktig skakning. Tvätta membranet tre gånger med 10 mL 0,2% PBT för 5 min.
- Vid rumstemperatur, utveckla fotografiskt filmar genom ruvning membran med förbättrad chemo-självlysande kit.
- Förvärva fotografiskt filmar med en scanning system och kvantifiera de erhållna banden med lämplig bild analys programvara.
Obs: Utvärdering av Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 och ZO-2 utförs i Caco-2-celler. Utvärderingen av NF-kB och XIAP utförs i PBMC.
FÖRSIKTIGHET: β-merkaptoetanol är giftigt (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Inte andas ångor, Undvik utsläpp i miljön, och bära individuella skyddsanordningar och andningsskydd. Vid förtäring, omedelbart be om medicinsk rådgivning.
7. statistisk analys
- För att avgöra om strålningsexponering och samtidig kulturen inducerar en statistiskt betydande störning, genomför en tvåvägs variansanalys (ANOVA) med multipla jämförelser för upprepade mätningar (med Bonferroni post-hoc-tester för att jämföra replikera betyder).
- Om inte annat anges, beräkna den statistisk signifikansen (p) tvåsidiga Students t-test. Varje värde är medelvärdet av ≥3 oberoende experiment ± medelfel av menar (SEM).
Representative Results
En vecka före experimentet, är celler sått på porösa membranet i skäret och tillåts växa under följande dagar. Nivån på confluencen kan kontrolleras antingen med ett inverterat Mikroskop eller via mätning av TEER värdena. Under tillväxtfasen, håller faktiskt TEER ökar tills alla porösa membranet har täckts av celler och bildar de en differentierad cell enskiktslager. Om cellerna föröka snabbare/långsammare, börja experimentet vid tidigare/senare tidpunkter efter som dirigeras. Vid sammanflödet, cellerna förs sedan till bestrålningsanläggningen, minimera den förmedlade miljömässig stressen (temperatur eller pH), före start samtidig kulturen med/utan PBMC, seedade i det nedre facket (figur 1A), eller utvärdera spridningen av Caco-2-celler. Med tanke på det ursprungliga sådd densitet, på dag bör 0 celler nå 100% sammanflödet och skapa en differentierad enskiktslager av epitelceller, som kan observeras av platån i TEER som visas i figur 1B. När cellerna når sådan status, hålls TEER värdet relativt konstant under den följande veckan, så länge det gamla odlingsmediet ersätts med färska medium, minst en gång i veckan (figur 1B). Som visas i figur 1C, visar MTT analysen inte någon statistiskt signifikant förändring av Caco-2-celler proliferativ status på 24 h varken på 48 h, oberoende av dosen som fick (upp till 10 Gy).
Ett annat resultat observerades avseende kortfristiga dödligheten hos Caco-2-celler. Vid båda tidpunkter, Trypan blå färgning visar en dosberoende ökning cell dödlighet. Dessa resultat visar en tydlig effekt av strålningsexponering, fastän procentsatserna av döda celler verkar vara mycket låg, särskilt när man överväger att högsta dosen (10 Gy) producerar bara ungefär 20% av celldöd (figur 1D).
Prover var samtidig odlade med eller utan PBMC i det lägsta facket. Tanke på att PBMC inte fick någon yttre stimulans att föröka sig, ansågs ett 48 h experiment idealisk för att undvika bias infördes genom PBMC börjar dö. Därför mättes från omedelbart före bestrålning, TEER regelbundet för 48 h, för att hålla koll på eventuella tillfälliga effekter som orsakas av protokollet bestrålning. Som visas i figur 1 E-F, TEER värden presenteras som relativa variationer med avseende på det förbehandlade villkoret (vilket var storleksordningen 1200-1500 Ω·cm2) att bättre belysa den störning som induceras av röntgen bestrålning och eller av närvaro/frånvaro av PBMC i samtidig kultur. I båda fallen kan en inledande övergående topp ses tydligt vid den första tidpunkten efter exponering, som kan hänföras till förfarandet för bestrålning.
När inte samtidig kultur med PBMC (figur 1E), TEER värden är nästan konstant upp till 48 h samtidigt, efter 10 Gy röntgenstrålar, celler Visa en långvarig minskning av TEER börjar vid 3 h efter strålning. Förekomsten av PBMC ändrar helt TEER tidsmässiga dynamiken (figur 1F). För alla doser är en minskning av TEER tydligt observerbara från 3 h upp till ca 30 h efterbestrålning, när TEER visas att bosätta sig på ett konstant värde (figur 1F).
Åtsittande föreningspunkt komplex uttrycksnivåerna undersöktes i Caco-2 celler lysates genom western blot-analys. Caco-2-celler var utsatt för joniserande strålning (med doser på 0, 2 och 10 Gy) och sedan dess vuxit ensam eller i samarbete kultur med PBMC i nedersta facket för 48 h (som visas i figur 2A-F). Både Claudin-1 och Occludin (figur 2A, 2B) befanns vara inte signifikant genom röntgen och/eller samtidig kultur med PBMC. Stora svängningar i stället hos byggnadsställning proteiner ZO-1, ZO-2 och Afadin (figur 2C, 2D, 2E). I synnerhet observeras en minskning av ZO-2 uttrycksnivåerna redan efter 2 Gy när i samtidig kultur med PBMC medan endast på 10 Gy när Caco-2 växer ensam. Afadin uttrycksnivåerna istället påverkas först efter 10 Gy röntgenstrålar, med en ytterligare nedsättning när Caco-2 är samtidig odlade med PBMC.
PBMC Co odlade med Caco-2 analyserades fråga inflammatoriska tillstånd, i synnerhet de nukleära transkriptionsfaktor kB (NF-kB) och de X-länkade hämmaren av apoptos proteinnivåer (XIAP) har undersökts (figur 2 G-jag). NF-kB totalbeloppet påverkades inte av samtidig kultur med Caco-2 utsätts för olika stråldoser (figur 2G). Tvärtom var XIAP nivåer 4-fold uppreglerat i både den 2 Gy och 10 Gy samtidig kulturer, även om de stora variationerna kräver ett högre antal prover analyseras för att minska sådana svängningar och få en bättre statistisk power.
Som visas i figur 2F och 2I, kanske några icke-specifika band visas bredvid den förväntade molekylvikten av proteinet av intresse. Såvida inte sann och icke-specifika band är lätt urskiljbara, bör olika antikroppar och/eller BSA eller NFDM koncentrationer övervägas.
Figur 1 . Övergripande experiment och makroskopiska effekterna av exponering för strålning och PBMC samtidig kultur. (A) Schematisk avbildning av samtidig kultur modellen. (B) TEER värdena mätas dagligen från första utsäde av Caco-2-celler att bedöma statusen för ordentlig tillväxt och differentiering av enskiktslager. Cellviabilitet C) och D) dödlighet i Caco-2 utsätts för röntgen (0, 2, 5 och 10 Gy). E) TEER mätningar i Caco-2-celler bestrålas med 0, 2 och 10 Gy av röntgen odlade utan eller F) med PBMC. Varje värde är medelvärdet av ≥3 oberoende experiment ± SEM. * p-val < 0,05; ** p-va l < 0,01; p-val < 0,001. Grafer från Morini et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Western Blot resultaten av Caco-2 och PBMC lysates. Uttryck nivå av åtsittande föreningspunkt proteiner (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) och Afadin (E)) i Caco-2 efter 0, 2 och 10 Gy av röntgen och i närvaro/frånvaro av PBMC i samtidig kultur. Värden är normaliserade på aktin nivå. Illustrativa filmer för varje åtsittande föreningspunkt protein och villkor visas i panelen (F). Uttryck nivå av NF-κB (G) och XIAP (H) i PBMC Co odlade med Caco-2-celler. Representativa filmerna för NF-kB, XIAP och aktin visas i panelen. Varje värde är medelvärdet av ≥3 oberoende experiment ± SEM. grafer anpassad från Morini et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Kolorektal cancer, med dess höga förekomsten i utvecklade länder, är en av de vanligaste orsakerna till sjuklighet och dödlighet i befolkningen. Det är vanligen hanteras av kirurgi, kemoterapi och strålbehandling1. Inom ramen för strålbehandling behandlingar, måste särskild uppmärksamhet ägnas effekterna av frisk vävnad exponering4; Dessutom, systematiska studier om sambandet mellan exponering för strålning och immunsystemet är grundläggande för att utveckla strategier för radio-immunterapi3.
Den metod som vi antog i detta arbete har skräddarsytts till utredningen av Caco-2-celler och PBMC överhörning. Vi fokuserar på effekten av röntgen exponering av tumörceller, men samma protokoll kan anpassas till studier med farmakologiska medel. Att vara närmare fysiologiska förhållanden avseende standard cellen odling, är den starka fördelen med denna metod möjligheten till en komplett dissektion av ett komplext system, få möjlighet att analysera både olika celltyper och frisläppandet av signalmolekyler i de två fack av samtidig kulturen själv. På detta sätt kan rutinmässigt tillämpad biologiska metoder hjälpa förståelsen av cellular samspel relaterade mekanismer.
Den första karakteriseringen av X-stråle-inducerad effekter på Caco-2-celler var baserat på två kompletterande mätningar, MTT kolorimetriska analysen och Trypan blått färgämne uteslutande testa dvs . De tydligen inkonsekventa resultat kunde förklaras med olika fokus för dessa två analyser. MTT bedömer mitokondriskt enzymer aktiviteten, medan den Trypan blått färgämne är baserad på en levande-cellen utslagning dye mekanism.
Utredningen av Caco-2-PBMC samspel kräver skapandet av en epitelial enskiktslager kunna leda till en fullständig separation mellan de två avdelningarna av samtidig kultur. Möjligheten att sådd Caco-2-celler i samarbete kultur infoga tillåter bestrålning av endast denna cell befolkningen. Eftersom samtidig kulturen börjar efter bestrålning, finns det inga fördomar på grund av någon oavsiktlig exponering av PBMC. Detta upplägg måste hanteras försiktigt för att undvika skada (eller kontaminering) den cellulära enskiktslager under Infoga rörelser från en 6-well platta till den andra. När noggrant utfört, är TEER mätningar en enkel och icke-invasiv metod att utreda enskiktslager permeabilitet. Denna analys är strikt relaterad till samtidig kultur set-up, och det är inte det enda valet för utredning av enskiktslager permeabilitet. Det tillåter en bra reproducerbarhet av åtgärder när det väl är kalibrerad med färska komplett medium. Gemensamma analyser fokuserar på diffusionen av kemiska färgämnen från övre ”apikala” facket till den nedre ”basolateral” en (e.g. fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran assay)16. Men sedan PBMC är närvarande i basolateral facket i denna studie, beslutade vi att undvika införandet av kemiska reagenser i experimenten.
Bland de olika tekniker som antagits i detta arbete, är TEER mätning den enda som kräver samtidig kultur set-up17,18. Andra vanliga laboratorietekniker ger dock mer informativa resultat när de tillämpas på celler i samtidig kultur, som de tillåter utredningen av en setup närmre fysiologiska förhållanden och data har en starkare biologisk betydelse. Däremot, måste det noteras att användningen av celler som odlas på porösa underlag kan leda till vissa svårigheter i den verksamheten som behövs för att bereda proverna, såsom den cellen lysis för beredning av cellulära extrakt analyseras genom western blotting.
Systemet antogs i denna studie har potential att vara ytterligare förbättrad, t.ex. med tillämpning av ämnen kunna återskapa den extracellulära matrix-miljön. Men detta kommer också att resultera i en ökad komplexitet och en fullständig dissekering av upplägget kommer att vara svårare att uppnås.
Inställningar för samtidig cellkultur säkert representera ett kraftfullt verktyg för utvecklingen av in vitro- forskning, och för förståelsen av komplexa system. Denna teknik har potential att öka kunskapen om grundläggande mekanismer, ge nya ingångar till grundläggande forskningsstudier på molekylär signalering och med möjliga tillämpningar till moduleringen av aktiviteten i immunsystemet inom ramen för onkologisk kliniska patienthantering.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Italienska institutet för kärnfysik (INFN) finansieras delvis detta arbete genom projektet INFN-MERIDIAN. Författarna erkänner Prof. Edoardo Milotti (fysiska institutionen, universitetet i Trieste, Italien) för INFN-MERIDIAN projektsamordning; Dr. Roberto Chignola (bioteknik institutionen, universitetet i Verona, Italien) för att tillhandahålla de Caco-2-cellerna, ohmmeter, och hans värdefull hjälp och utbildning. Vi erkänner också Agnese Solari för tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
| Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
| Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
| CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
| Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
| Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
| Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
| Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
| Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
| Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
| Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
| Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
| Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
| Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
| Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
| BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
| Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
| 10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
| Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
| Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
| ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
| ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
| Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
| Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
| Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
| Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
| Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
| Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |
References
- Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
- Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
- Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
- Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
- Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
- Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
- Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
- Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
- Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
- Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
- Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
- Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, (March) 1-12 (2017).
- Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).
