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Medicine

मां का दूध Enteroids के विकास को बढ़ाता है: सेल प्रसार के एक पूर्व Vivo मॉडल

Published: February 15, 2018 doi: 10.3791/56921
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 3, 1
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे नवजात माउस या समय से पहले मानव आंत के रूप में अच्छी तरह से चूहों से दूध इकट्ठा करने के लिए एक कुशल विधि से एक enteroid संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए ।

Abstract

मानव छोटे आंत्र enteroids तहखाने से प्राप्त कर रहे है और जब एक स्टेम सेल आला में हो उपकला कोशिका प्रकार के सभी होते हैं । मानव enteroid पूर्व विवो संस्कृति प्रणालियों को स्थापित करने की क्षमता मॉडल आंत्र pathophysiology के लिए महत्वपूर्ण हैं और विशेष रूप से सेलुलर प्रतिक्रियाओं शामिल अध्ययन करने के लिए. हाल के वर्षों में, चूहों और मनुष्यों से enteroids संस्कृतिित किया जा रहा है, पारित, और दुनिया भर में कई प्रयोगशालाओं में भविष्य के उपयोग के लिए दूर बैंक । इस enteroid मंच विभिंन उपचार और दवाओं और क्या प्रभाव आंत में विभिंन कोशिका प्रकार पर लागू कर रहे है के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है । यहां, प्राथमिक स्टेम सेल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल-छोटे आंतों नवजात चूहों और समय से पहले मानव आंत से व्युत्पंन enteroids व्युत्पंन प्रदान की जाती है । इसके अलावा, इस enteroid संस्कृति प्रणाली प्रजातियों के प्रभाव विशेष मां के दूध का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया गया था । माउस स्तन दूध प्राप्त किया जा सकता है कुशलतापूर्वक एक संशोधित मानव स्तन पंप का उपयोग कर और माउस दूध व्यक्त किया तो आगे अनुसंधान प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अब हम व्यक्त माउस, मानव के प्रभाव का प्रदर्शन, और विकास और नवजात चूहों या समय से पहले मानव छोटी आंत से व्युत्पंन enteroids के प्रसार पर दाता मां के दूध ।

Introduction

नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ (परिषद) समय से पहले शिशुओं में जठरांत्र रोग से मौत का प्रमुख कारण है, लगभग 1 प्रभावित 10 शिशुओं में 29 सप्ताह के बाद पैदा हुआ1हमल,2,3। सबसे गंभीर रूप में विकास परिषद प्रगति के साथ शिशुओं के आधे, जहां अस्तित्व केवल 10-30%4, 5 है । संयुक्त राज्य अमेरिका में, एक अनुमानित 2-3 अरब अमरीकी डालर/6, 7, अभी तक न तो जीवित रहने की दर और न ही चिकित्सा पिछले 30 वर्षों में बदल गया है के साथ शिशुओं का इलाज खर्च कर रहे हैं । विकास परिषद के रोगजनन आंत्र चोट और बिगड़ा श्लैष्मिक हीलिंग8,9,10,11, तथापि, सिग्नलिंग मार्ग एक गहरा करने के लिए अग्रणी की विशेषता है भड़काऊ प्रतिक्रिया और तंत्र सूजन रिवर्स करने के लिए पूरी तरह से समझ में रहते हैं ।

मानव स्तन दूध के प्रशासन के लिए समय से पहले शिशुओं के लिए परिषद के खिलाफ ही सुरक्षात्मक रणनीति हो पाया गया है । हम पहले से पता चला है कि स्तन के दूध जंमजात प्रतिरक्षा रिसेप्टर टोल के निषेध के माध्यम से विकास परिषद के खिलाफ की रक्षा-रिसेप्टर 4 की तरह (TLR4) आंत्र उपकला में एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर के माध्यम से (EGFR) मार्ग11संकेतन. एक प्रयोगात्मक परिषद सूत्र को स्तन के दूध की पूरकता के रूप में enterocyte apoptosis और enterocyte प्रसार की बहाली के निषेध द्वारा प्रदर्शन के रूप में परिषद में देखा भड़काऊ प्रतिक्रिया तनु एक तरह से है कि एपिडर्मल विकास पर निर्भर था भाज्या (EGF) आणि EGFR११. एक अन्य अध्ययन में, यह दिखाया गया है कि नाइट्रेट, स्तन के दूध का एक और घटक, आंत्र छिड़काव संग्राहक द्वारा अपने सुरक्षात्मक प्रकृति के लिए योगदान देता है, के रूप में शिशु फार्मूला है, जो नाइट्रेट की कमी है की तुलना में और पूर्वोत्तर क्षेत्र में वृद्धि की आवृत्ति में योगदान कर सकते हैं फार्मूला फेड शिशुओं12,13। अंय मां के दूध में मौजूद यौगिकों कि विकास परिषद के खिलाफ संरक्षण में शामिल होना दिखाया गया है मानव दूध oligosaccharides, एल arginine, glutamine, और लैक्टोफेरिन14,15,16, 17,18,19. मां के दूध के इन लाभकारी तत्वों विकास परिषद की रोकथाम में इसके उपयोग की आवश्यकता का पता चलता है, लेकिन यह भी तंत्र का अध्ययन करने के महत्व पर जोर, रास्ते संकेत, और सेलुलर कैसे स्तन दूध में शामिल प्रभाव विकास परिषद के खिलाफ संरक्षण मध्यस्थता है .

आदेश में आगे विकास परिषद के एक माउस मॉडल में स्तन के दूध के सुरक्षात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए, हम एक उपंयास, प्रयोग करने में आसान तकनीक है जिसके द्वारा माउस मां के दूध एक anesthetized बांध से एक इलेक्ट्रिक मानव स्तन पंप का उपयोग कर निकाला जा सकता है11,12 . माउस स्तन दूध प्राप्त करने की यह रणनीति लाभप्रद है, न केवल क्योंकि मानव स्तन पंप आसानी से उपलब्ध है और मां के दूध की खरीद में कुशल हैं, बल्कि इसलिए भी कि इस विधि प्रजातियों के लिए अनुमति देता है विशेष स्तन दूध विश्लेषण । एक परिणाम के रूप में, हम मानव मां के दूध के साथ ही pasteurized मानव दाता दूध प्रजातियों में एक दूध बैंक से विशेष मॉडल के उन व्यक्त के साथ माउस मां के दूध के प्रभाव की तुलना कर सकते हैं । इस तकनीक को परिषद की रोकथाम की दिशा में उनके योगदान के संबंध में स्तन के दूध घटकों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । अंय जांचकर्ताओं स्तन दूध निष्कर्षण तरीकों विकसित किया है, तथापि, इन तकनीकों मैनुअल और आम तौर पर एक से अधिक प्रयोगशाला सदस्य20,21,22की आवश्यकता होती है । यहां एक आसान तकनीक है कि एक मानव इलेक्ट्रिक स्तन पंप को संशोधित करने के लिए एक माउस से दूध एकत्र द्वारा उपयोग किया जा सकता है प्रस्तुत किया है । इस तकनीक को अन्य प्रजातियों में भी लागू किया जा सकता है ।

पर्याप्त रूप से संकेतन परिषद के साथ शामिल रास्ते पूछताछ करने के लिए, मॉडल सिस्टम के लिए विभिंन प्रकार के कोशिका के सभी मूल्यांकन की जरूरत है रोग की प्रक्रिया में प्रभावित हो जाना । यहां, हम एक ऐसी मॉडल प्रणाली-enteroids-और माउस और मानव छोटी आंत से उनकी स्थापना पर चर्चा । मानव आंत्र enteroids (HIEs) विशेष रूप से महत्वपूर्ण वादा प्रदान करते हैं, क्योंकि वे एक अभिनव प्रदान करते हैं, आनुवंशिक रूप से विविध पूर्व vivo मानव मॉडल pathophysiological प्रक्रियाओं है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग में जगह लेने के अध्ययन में सहायता करने के लिए 23. Enteroids को लंबे समय तक प्रसंस्कृत होना पाया गया है और बाद में उपयोग के लिए जम सकता है23, और विपरीत मानव आंत्र Organoids (HIOs), जिनकी संस्कृतियों inducible pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विकसित कर रहे हैं, Enteroids स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न कर रहे हैं अलग आंत्र तहखाने के भीतर24। Enteroids कम रखरखाव की आवश्यकता है, जल्दी से संक्रमित किया जा सकता है25, और आसानी से स्थापित किया जा सकता है के बाद से आंत्र तहखाना अधिक HIOs23से विभेदित कर रहे हैं । इसलिए, HIEs मौजूदा तकनीक पर कई लाभ प्रदान करते हैं, क्योंकि वे क्षेत्र के प्रदर्शन के लिए विकसित किया जा सकता है विशेष संरचना और मानव जठरांत्र उपकला के कार्यात्मक गुण23. enteroids का उपयोग एक अत्यंत प्रभावी विकल्प है जब आंत के एक मानव मॉडल की जरूरत है, क्षेत्र के पालन के साथ-विशिष्ट सीमाओं और आसानी से उपयोग । यहां हम अलग और प्राथमिक स्टेम सेल को बनाए रखने की तकनीक का प्रदर्शन-चूहों और समय से पहले मानव शिशुओं से छोटे आंत्र enteroids व्युत्पंन ।

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Protocol

इस अध्ययन में सभी पशु प्रक्रियाओं या तो सेंट लुइस संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल २०१६०१८७) या पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल १४१०३९१८) में वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया । मानव भ्रूण छोटी आंत से कम 24 सप्ताह के गर्भ के अनुसार में प्राप्त किया गया था पिट्सबर्ग के विश्वविद्यालय शारीरिक ऊतक खरीद दिशानिर्देश विश्वविद्यालय से संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदन (प्रोटोकॉल PRO14100537) के बाद पिट्सबर्ग एक ईमानदार ब्रोकर प्रणाली के माध्यम से स्वास्थ्य विज्ञान ऊतक बैंक । De-पहचान मानव स्तन दूध या pasteurized दाता मां के दूध पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड से सहमति की छूट के साथ प्राप्त की थी ।

1. तहखाना अलगाव और नवजात चूहों या समय से पहले मानव छोटी आंत से Enteroids की स्थापना

  1. मीडिया की तैयारी
    नोट: मीडिया डाकू तहखाने अलगाव से पहले दिन में तैयार किया जाना चाहिए ।
    1. १.११ एल संस्कृति मीडिया तैयार करें । के साथ शुरू 1 L Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम से (DMEM) ४.५ g/l ग्लूकोज और एल-glutamine और जोड़ें ११० एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (अंतिम एकाग्रता 10%), 11 मिलीलीटर पेनिसिलिन-Streptomycin (अंतिम एकाग्रता 1%), और १.१ मिलीलीटर बाँझ इंसुलिन (अंतिम एकाग्रता ०.१%).
    2. तैयार ५०० एमएल पंजाब-एंटीबायोटिक मिश्रण । के साथ शुरू ५०० एमएल 1x Dulbecco के फास्फेट-बफर खारा (DPBS) के साथ 10% FBS और जोड़ें 5 मिलीलीटर Gentamicin (अंतिम एकाग्रता 1%), 1 मिलीलीटर Amphotericin बी (अंतिम एकाग्रता ०.२%), और 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन-Streptomycin (अंतिम एकाग्रता 1%) ।
    3. 30 एमएल सेल व्यवधान मीडिया #1 तैयार करें । सबसे पहले 30 एमएल कल्चर मीडिया तैयार करें । जोड़ें ६०० µ l ०.५ M Ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA) (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी), ३०० µ l Gentamicin (अंतिम एकाग्रता 1%), and ६० µ l Amphotericin B (अंतिम एकाग्रता ०.२%).
    4. 30 एमएल सेल व्यवधान मीडिया #2 तैयार करें । सबसे पहले 30 एमएल कल्चर मीडिया तैयार करें । जोड़ें ३०० µ l ०.५ M EDTA (अंतिम एकाग्रता 5 मिमी), ३०० µ l Gentamicin (अंतिम एकाग्रता 1%), and ६० µ l Amphotericin B (अंतिम एकाग्रता ०.२%).
    5. विकास कारकों के बिना ५० मिलीलीटर तहखाना संस्कृति मीडिया तैयार करें । उपाय ३३.४ एमएल 1x उंनत DMEM/एफ 12 और जोड़ें 10 मिलीलीटर FBS (अंतिम एकाग्रता 20%) ।
      1. जोड़ें ५०० µ L पेनिसिलिन-Streptomycin (अंतिम एकाग्रता 1%), ५०० µ l l-glutamine (अंतिम एकाग्रता 1%), ५०० µ l Gentamicin (अंतिम एकाग्रता 1%), १०० µ l Amphotericin ज (अंतिम एकाग्रता ०.२%), २.५ µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-एतान sulfonic एसिड (HEPES) (अंतिम एकाग्रता ०.०५ mM), ५०० µ एल १०० मिमी एन-असेटयलस्यस्थेने (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी), ५०० µ एल 100x एन-2 पूरक, 1 मिलीलीटर 50x सीरम मुक्त पूरक (उदा., बी-27) ऋण विटामिन ए, और ५०० µ एल 1 मिमी 100x Y-२७६३२ ।
    6. विकास कारकों के साथ 1 मिलीलीटर तहखाना संस्कृति मीडिया तैयार करें । पहले विकास कारकों के बिना तहखाना संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर तैयार करते हैं । जोड़ें २.५ µ l ४० µ g/एमएल Wnt3a (अंतिम एकाग्रता १०० एनजी/1 µ l १०० µ g/मिलि नोगिन (अंतिम एकाग्रता १०० एनजी/एमएल), 2 µ एल २५० µ जी/एमएल आर-Spondin (अंतिम एकाग्रता ५०० एनजी/एमएल), और ०.५ µ एल १०० µ जी/एमएल EGF (अंतिम एकाग्रता ५० एनजी/
  2. तहखाना अलगाव
    1. solubilized तहखाने झिल्ली निकालने प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) बर्फ पर शुरू करने से पहले गल.
      नोट: बर्फ पर तहखाने झिल्ली रखें या यह polymerize होगा ।
    2. संस्थागत पशु देखभाल और चूहों के लिए उपयोग समिति प्रोटोकॉल के साथ अनुपालन में अधिक से अधिक 14 दिनों की उंर, दूसरे के साथ इच्छामृत्यु के दो तरीकों के साथ euthanize चूहों मौत सुनिश्चित करने के लिए एक भौतिक प्रक्रिया जा रहा है ।
      नोट: उम्र के 14 दिनों के तहत चूहों के लिए, decapitation कैंची का उपयोग मानक प्रक्रिया है.
    3. कैंची और संदंश का उपयोग करना, पेट की midline के नीचे एक ऊर्ध्वाधर चीरा, त्वचा और योनि के माध्यम से, उदर की पूरी लंबाई के लिए । एक्साइज की छोटी आंत को पेट से अंधान्त्र पर कैंची से अन्त्रपेशी और संदंश के साथ निकाल दें ।
      नोट: दो सप्ताह पुराने पुरुष और महिला C57BL/6J माउस पिल्ले, प्रत्येक वजन ५.५-7 जी, तहखाना अलगाव के लिए इस्तेमाल किया गया । किसी भी उंर या आकार माउस तहखाना अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    4. तहखाने अलगाव के लिए नए सिरे से काटा छोटी आंत तैयार करने के लिए, स्थिति आंत सीधे, और अपनी पूरी लंबाई के साथ longitudinally आंत काट कैंची का उपयोग कर ।
      नोट: माउस और मानव आंत इसी तरह तैयार किया जा सकता है ।
    5. आंतों के बाहर साफ मल धीरे आंत एक पंजाब में आगे और पीछे मिलाते हुए-एंटीबायोटिक मिश्रण-संदंश का उपयोग कर पेट्री पकवान भरा ।
    6. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए सेल व्यवधान मीडिया #1 के 30 मिलीलीटर जोड़ें । ०.५ सेमी लंबाई के टुकड़ों में आंत काट सीधे ट्यूब में । एक बर्फ बाल्टी में ट्यूब सेट और धीरे 15 मिनट के लिए सबसे कम गति पर शेखर पर आंदोलन ।
    7. जबकि ऊतकों को शेखर पर हैं, 24-या ४८-अच्छी तरह से प्राप्त करने की प्लेटें तहखाने विकसित करने के लिए अगर enteroids शाही सेना, डीएनए, या प्रोटीन अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं । enteroids पूरे माउंट फोकल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं अगर तहखाने विकसित करने के लिए 8 अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड का प्रयोग करें.
    8. हुड में, 24-या ४८-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं के नीचे तहखाने झिल्ली के 15 µ एल जोड़ें । कक्ष स्लाइड का उपयोग करते हैं, तो प्रत्येक कक्ष के नीचे करने के लिए तहखाने झिल्ली के 9 µ l जोड़ें ।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो प्लेट के आकार के अनुसार तहखाने झिल्ली की मात्रा समायोजित करें ।
    9. जल्दी पिपेट टिप के साथ तहखाने झिल्ली फैला है ताकि तहखाने झिल्ली अच्छी तरह के तल पर एक पतली परत रूपों । polymerize करने के लिए तहखाने झिल्ली की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए ३७ ° c में प्लेट प्लेस ।
      नोट: तहखाने झिल्ली एक पतली परत नहीं है या यदि तहखाने झिल्ली हवा के बुलबुले शामिल है नहीं संलग्न करेंगे ।
    10. एक शेखर पर 15 मिनट के बाद, एक १०० µm छलनी के माध्यम से ऊतक फिल्टर । के माध्यम से प्रवाह त्यागें ।
    11. जोड़ें 30 मिलीलीटर सेल व्यवधान मीडिया #2 एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब । छलनी से ऊतक निकालें और ट्यूब करने के लिए जोड़ें ।
    12. एक बर्फ बाल्टी में ट्यूब सेट और धीरे 15 मिनट के लिए सबसे कम गति पर शेखर पर आंदोलन ।
    13. शेखर पर 15 मिनट के बाद, एक १०० µm छलनी के माध्यम से फिल्टर ऊतक । इस कदम के माध्यम से प्रवाह रखें, मामले में बाद में चरणों में उपज कम है ।
      नोट: ट्यूबों के माध्यम से सभी प्रवाह बर्फ पर रखा जाना चाहिए ।
    14. ४.५ g/l ग्लूकोज और l-glutamine के साथ 15 मिलीलीटर DMEM जोड़ें एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब । छलनी से ऊतक निकालें और ट्यूब करने के लिए जोड़ें । जोरदार एक १०० µm छलनी के माध्यम से 10 एस फिल्टर के लिए हाथ से ट्यूब हिला और के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा । दोहराएँ जब तक प्रवाह के माध्यम से कोई कण शामिल हैं.
    15. हुड में, पिछले चरण से प्रवाह के माध्यम से फ़िल्टर एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में माउस ऊतक या मानव ऊतक के लिए १०० µm उपभेदों के लिए ७० µm उपभेदों का उपयोग कर ।
      नोट: स्टैंडबाय पर अतिरिक्त उपभेदों है, और धीरे डालना के रूप में छलनी मलबे के साथ रोकना होगा ।
    16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए २०० x g पर ट्यूब और हुड में एक बर्फ की बाल्टी में सीधे जगह केंद्रापसारक । गोली परेशान बिना पिपेट द्वारा supernatant निकालें । विकास कारकों के बिना तहखाना संस्कृति मीडिया की कुल वांछित राशि के साथ गोली reसस्पेंड.
      नोट: समृद्ध तहखाने गोली के ' रेतीले परत ' कर रहे हैं । प्रत्येक अच्छी तरह से विकास कारकों के बिना तहखाना संस्कृति मीडिया के २५० µ एल की आवश्यकता है ।
  3. enteroids की स्थापना
    1. तहखाने मीडिया मिश्रण प्लेट सीधे तलघर झिल्ली पर ।
    2. अलगाव की प्रक्रिया को सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के साथ तहखाने की जांच सफल रहा था ।
      नोट: कोशिकाओं और कोशिकाओं की गेंदों वांछित हैं. लगभग १०० व्यक्तिगत तहखाना प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया जाता है ।
    3. तहखाने झिल्ली का पालन करने के लिए तहखाना अनुमति देने के लिए 3 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
      नोट: यह मशीन विकास कारकों के बिना तहखाना संस्कृति मीडिया के साथ है ।
    4. धीरे मीडिया और अतिरिक्त तहखाने है कि एक पी २०० पिपेट का उपयोग कर संलग्न करने में विफल हटा दें ।
      नोट: तहखाने झिल्ली परेशान नहीं के रूप में संलग्न तहखाने उखाड़ फेंकना हो सकता है ।
    5. धीरे से एक अच्छी तरह से विकास कारकों के साथ तहखाना संस्कृति मीडिया के २५० µ एल जोड़ें ।
      नोट: के लिए 24, ४८-अच्छी तरह से प्लेटें, या कक्ष स्लाइड, २५० µ एल के विकास कारकों के साथ तहखाना संस्कृति मीडिया के लिए पर्याप्त है ।
    6. 5 दिन के लिए विकास कारकों के साथ ताजा तहखाना संस्कृति मीडिया के साथ हर 2 दिन की जगह उपचार करने के लिए पहले इष्टतम लगाव और विकास के लिए अनुमति देते हैं ।

2. माउस स्तन दूध संग्रह

  1. प्रसवोत्तर 7-12 दिन के लिए अपने पिल्ले से 6 ज के लिए दूध देने से पहले एक C57BL/6J स्तनपान कराने वाले बांध अलग ।
  2. एक नाक शंकु के माध्यम से isoflurane के साथ स्तनपान कराने वाली बांध Anesthetize और ०.१५ IU/kg शरीर के वजन में ऑक्सीटोसिन के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रशासन । प्रक्रिया दुहना के प्रयास से पहले 3 मिनट रुको ।
  3. ७०% इथेनॉल के साथ साफ करने की प्रक्रिया दूध देने से पहले और सूखी चलो ।
  4. एक समय में एक निपल से दूध निकालें सिलिकॉन टयूबिंग के साथ एक इलेक्ट्रिक मानव स्तन पंप का उपयोग कर एक 5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में माउस निपल फिट आकार ।
    नोट: इष्टतम स्तन पंपों दो सेटिंग्स, गति के लिए एक और चूषण के लिए एक है । यह प्रत्येक की सबसे कम सेटिंग्स के साथ शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है और दोनों धीरे से दूध निकाला जाता है जब तक वृद्धि. आदर्श रूप में, कुल उपज होगा ~ ५०० µ एल-1 स्तनपान कराने वाली बांध प्रति माउस स्तन दूध की मिलीलीटर ।
  5. तुरंत aliquot स्तन दूध और स्टोर पर-८० ° c ।
    नोट: फ्रीज/गल चक्र से बचें ।
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए विकास कारकों के साथ तहखाना संस्कृति मीडिया की एमएल प्रति माउस मां के दूध के ५० µ एल/एमएल के साथ 5 दिन पर enteroids समझो ।

3. पूरे Enteroids के धुंधला माउंट

  1. रिएजेंट की तैयारी
    1. 8 कुओं प्रति 16 मिलीलीटर 1x पंजाबियों तैयार करते हैं ।
    2. 8 कुओं प्रति 1x पंजाब में 2 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करें ।
    3. 8 कुओं प्रति 1x पंजाब में 2 मिलीलीटर ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० तैयार करें ।
    4. तैयार 24 एमएल पंजाब के बीच (PBST है ०.१% के बीच 1x पंजाब में 20) प्रति 8 कुओं ।
    5. 8 कुओं प्रति ०.१% PBST (10% एनडीएस/PBST) में 2 मिलीलीटर 10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) तैयार करें ।
    6. 8 कुओं प्रति ०.१% PBST (1% एनडीएस/PBST) में 4 मिलीलीटर 1% एनडीएस तैयार करें ।
  2. धुंधला दिन 1
    1. महाप्राण बंद उपचार और पंजाब के साथ enteroids धो लो । Add २५० µ l 4% पीएफए प्रति well. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए रोटेटर पर प्लेस । पिपेट के साथ 4% पीएफए निकालें ।
    2. २५० µ l/अच्छी तरह 1x पंजाबियों के साथ 4 बार धोएं । कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए रोटेटर पर रखें ।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए थाली स्टोर करने के लिए संभव है.
    3. २५० µ l/अच्छी तरह से ०.१% ट्राइटन X-१०० जोड़ें । आरटी पर 1 एच के लिए मशीन । पिपेट के साथ ०.१% ट्राइटन X-१०० निकालें ।
    4. २५० µ l/अच्छी तरह 1x पंजाबियों के साथ 4 बार धोएं । आरटी पर 15 मिनट के लिए रोटेटर पर प्लेस ।
    5. Add २५० µ l/अच्छी तरह से 10% एनडीएस/PBST । आर टी पर ४५ मिनट के लिए मशीन निकालें 10% एनडीएस/PBST पिपेट के साथ ।
    6. जोड़ें २५० µ एल/अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी, पतला 1/250 में 1% एनडीएस/PBST, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
      नोट: इष्टतम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने निर्माता के अनुसार बदलता है ।
  3. धुंधला दिन 2
    1. २५० µ l/अच्छी तरह से PBST के साथ 4-5 ज के लिए कम से कम 5 बार धो लें । प्रत्येक वॉश के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेटर पर रखें ।
    2. Add २५० µ l/अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी, पतला 1/1000 में 1% एनडीएस/PBST । पन्नी में थाली लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  4. धुंधला दिन 3
    1. जोड़ें २५० µ l/अच्छी तरह से परमाणु दाग 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 मिनट के लिए ।
      नोट: थाली को अंधेरे में रखें ।
    2. २५० µ l/अच्छी तरह से PBST के साथ 6 बार धो लें । प्रत्येक वॉश के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रोटेटर पर प्लेस ।
    3. माउंट मीडिया बढ़ते के साथ चैंबर स्लाइड पर coverslip ।
    4. एक 40X उद्देश्य फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को ले लो और समान रूप से एक रैस्टर ग्राफिक्स संपादक में प्रदान ( सामग्री की तालिकादेखें).

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Representative Results

हम पहले की जांच करने के लिए कि क्या व्यक्त मानव स्तन के दूध या pasteurized दाता मां के दूध की मांग की छोटी आंत्र enteroids पर एक प्रभाव था । दरअसल, मानव स्तन के दूध और दाता मां के दूध नवजात माउस (चित्र 1a) और समय से पहले मानव व्युत्पंन enteroids (आंकड़ा 1b) के विकास में वृद्धि हुई ।

के बाद से मानव स्तन दूध छोटे आंत्र enteroids के विकास में वृद्धि हुई है, हम अगले जांच अगर मां का दूध समय से पहले मानव enteroids के प्रसार पर एक प्रभाव था । हम यह प्रदर्शित करते है कि मानव स्तन का दूध समय से पहले मानव enteroids के प्रसार को बढ़ाता है (चित्र 2a-बी, Ki67, लाल दाग) । महत्वपूर्ण बात, मानव दाता स्तन दूध भी नियंत्रण की तुलना में enteroid प्रसार में वृद्धि हुई है, लेकिन गैर से एक थोड़ा कम डिग्री pasteurized मानव स्तन दूध (चित्रा बी-सी) । हम अगले समय से पहले मानव enteroids में Ki67 mRNA अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया है और पता चला कि Ki67 में वृद्धि हुई enteroids या तो स्तन के दूध या दाता मां के दूध के सापेक्ष नियंत्रण (आंकड़ा 2d) के साथ इलाज ।

हम अगले अगर इन प्रभावों प्रजातियों के साथ विशेष मां के दूध के संबंध थे देखना चाहता था । हम एक तरह से स्तनपान कराने के लिए एक संशोधित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव स्तन पंप का उपयोग कर चूहों से मां का दूध इकट्ठा करने के संदर्भ में11,12विकसित । चित्रित एक anesthetized स्तनपान कराने वाला बांध इस उपकरण (चित्रा 3) का उपयोग कर दूध संग्रह के दौर से गुजर रहा है । प्रयोगों की अगली श्रृंखला माउस enteroids पर प्रदर्शन किया और हम या तो माउस, मानव, या दाता मां के दूध से व्यक्त स्तन के दूध के प्रसार प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था । के रूप में चित्रा 4, माउस, मानव में दिखाया गया है, और pasteurized दाता स्तन दूध माउस enteroids में प्रसार में वृद्धि के रूप में नियंत्रण (चित्रा 4a-डी) की तुलना में । माउस enteroids में प्रसार TLR4 ligand, lipopolysaccharide (एलपीएस), नियंत्रण (चित्र 4a, ई) की तुलना में की उपस्थिति में कमी आई थी । महत्वपूर्ण बात, माउस, मानव, या दाता मां के दूध एलपीएस की उपस्थिति में सभी बहाल enteroid प्रसार के रूप में वृद्धि हुई Ki67 धुंधला एलपीएस अकेले (चित्रा 4F-एच) की तुलना में प्रदर्शन किया ।

हमारे प्रयोगों से, हम बताते है कि छोटे आंत्र enteroids नवजात चूहों से व्युत्पंन और समय से पहले मानव भ्रूण आंत संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है । हम आगे एक उपंयास स्तन दूध संग्रह विधि प्रदान करते है कि चूहों, जो तब विभिंन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से मां के दूध निकालने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है । हमें पता चला कि मानव या चूहों से व्यक्त मां के दूध आकार, विकास में वृद्धि हुई है, और माउस और मानव enteroids में प्रसार । इसके अलावा, माउस, मानव, और दाता मां के दूध एलपीएस जोखिम के बाद enteroid प्रसार बहाल । यह सुझाव है कि मां के दूध चूहों और मनुष्यों की छोटी आंत पर विरोधी भड़काऊ प्रभाव डालती कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1. मां का दूध और दाता मां का दूध आकार और माउस और समय से पहले मानव enteroids के विकास में वृद्धि । नवजात चूहों से छोटे आंत्र enteroids के Photomicrographs (p14) या समय से पहले या तो मीडिया (नियंत्रण), मां के दूध, या दाता मां के दूध (५० µ एल/एमएल) के साथ इलाज के लिए 24 एच. आकार बार: १,००० µm. कृपया इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा.

Figure 2
चित्र 2. मां का दूध और दाता मां का दूध समय से पहले मानव enteroids के प्रसार में वृद्धि । (क) समय से पहले मानव enteroids के फोकल माइक्रोग्राफ 5 दिनों के लिए, मानव स्तन के दूध और pasteurized दाता मां के दूध के लिए 24 ज और प्रसार मार्कर Ki67 (लाल) और DAPI (नाभिकीय, नीला) के लिए दाग के साथ इलाज किया । आकार पट्टी: ५० µm. (ख) qRT-गृह व्यवस्था जीन RPLO के सापेक्ष मानव enteroids की Ki67 अभिव्यक्ति के लिए पीसीआर । n = 5 प्रति समूह । p < 0.0001 तुलना को नियंत्रण की तुलना में छात्र t परीक्षण के साथ करें । डेटा ± मानक विचलन मतलब है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. एक anesthetized माउस से दूध का संग्रह एक संशोधित मानव स्तन पंप का उपयोग कर । ऑक्सीटोसिन इंजेक्शन प्राप्त करने के बाद anesthetized स्तनपान कराने वाली बांध के निपल पर रखा बाँझ मानव स्तन पंप टयूबिंग. माउस दूध मध्यम गति और बिजली पर एक 5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में मानव स्तन पंप का उपयोग कर एकत्र की है । कलेक्टिव ५०० µ एल से सभी निपल रेंज से निकाले जन्मोत्तर दिन 7-12 पर माउस प्रति 1 मिलीलीटर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. माउस, मानव, और pasteurized दाता मां का दूध बढ़ाने के माउस enteroid प्रसार । (A-H) p14 छोटे आंत्र माउस enteroids के फोकल माइक्रोग्राफ (नियंत्रण, A) माउस स्तन दूध (MBM, बी), मानव स्तन दूध (बीएम, सी), या मानव दाता मां के दूध (DBM, डी) के साथ इलाज में 12 एच के लिए ५० µ एल/ A-D) या उपस्थिति lipopolysaccharide (एलपीएस) की एक खुराक पर 25 µ g/एमएल के लिए मीडिया के 12 ज, (ई एच) और प्रसार मार्कर Ki67 (लाल) और DAPI (नाभिकीय, नीला) के लिए दाग । आकार पट्टी: ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

आंतों उपकला कई सेलुलर उपप्रकार है कि रोगज़नक़ों के खिलाफ मेजबान रक्षा प्रदान करने के लिए जिंमेदार हैं शामिल है, आंत बाधा अखंडता को बनाए रखने, और कई रोगों के रोगजनन में उल्लंघन किया जा सकता है । जबकि पशु मॉडल रोग के कुछ पहलुओं दोहराऊंगा कर सकते हैं, चूहों और मनुष्यों की छोटी आंत से व्युत्पंन enteroids के पूर्व vivo मॉडल विभिन्न उपचार के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक मंच प्रदान करता है । enteroid मॉडल का महत्व शोधकर्ताओं ने संस्कृति के लिए अनुमति देता है और सभी उपकला सेलुलर उपप्रकार में भोली या रोगग्रस्त जानवरों और मनुष्यों कि मौजूदा तरीकों के साथ उपलब्ध नहीं हैं से आंत्र स्टेम कोशिकाओं में अंतर. इस मॉडल प्रणाली मानव रोगजनकों कि माउस में आसानी से अनुवाद योग्य नहीं हो सकता है, ऐसे enterovirus के रूप में25 या नोरोवायरस26 दूसरों के बीच में संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । enteroid मॉडल कई फायदे और उपयोग करता है; हालांकि, देखभाल करने के लिए एजेंट है कि मीडिया और विशिष्ट exogenous विकास कारकों है कि enteroids के अस्तित्व के लिए आवश्यक है बनाने के लिए उपयोग किया जाता है में निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए ।

enteroid मॉडल के भीतर, कई कदम महत्वपूर्ण महत्व के है enteroids उत्पादन में सफलता का आश्वासन दिया । ठंडे कोरोनरी समय को कम करने के लिए, ऊतक समीचीन कार्रवाई की जानी चाहिए । Enteroids ऊतक काटा जाता है के बाद 24 ज करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है अगर ऊतक रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस में रखा गया है । यदि आवश्यक हो तो यह शिपिंग या परिवहन के विकल्प की सुविधा कर सकते हैं । enteroids की स्थापना के लिए, तहखाने झिल्ली संलग्न और बढ़ने के लिए तहखाना के लिए एक अच्छी तरह के तल पर एक पतली, सपाट परत होना चाहिए । यदि तहखाने झिल्ली फ्लैट नहीं है या बुलबुले मौजूद है, तहखाने का पालन करने के लिए असफल हो सकता है और मीडिया बदल जाता है जब हटा दिया जाएगा । enteroids स्थापित करने के बाद, वे हर 7 दिन या लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हो सकता है । हटाने और विकास कारकों और प्रत्येक उपचार के प्रशासन के साथ तहखाना संस्कृति मीडिया के अलावा धीरे से किया जाना चाहिए और प्रत्येक के किनारे करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से enteroids परेशान से बचने के लिए । enteroids के विघटन के कारण उन्हें अलग हो जाते हैं और मीडिया के परिवर्तित हो जाने पर दूर धोया जा सकता है । सबसे अच्छा परिणाम के लिए, देखभाल के लिए तहखाने झिल्ली और संलग्न enteroids की अखंडता को बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए ।

वर्तमान अध्ययन में, हम रिपोर्ट है कि नवजात चूहों और समय से पहले शिशुओं से व्युत्पंन enteroids विकसित कर सकते है और मां के दूध के विभिंन प्रकार की उपस्थिति में पैदा करना । ये अध्ययन समयपूर्व आंत पर मां के दूध के प्रभाव की हमारी समझ अग्रिम । हम मानव और चूहों से प्रयोगशाला में enteroid संस्कृतियों की स्थापना करने के लिए कैसे पर एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं । इसके अलावा, हम एक संशोधित बिजली मानव स्तन पंप का उपयोग कर एक स्तनपान कराने वाले माउस से मां के दूध इकट्ठा करने का एक कुशल विधि का प्रदर्शन । हम बताते है कि माउस, मानव, और pasteurized दाता मां के दूध के विकास और चूहों और मनुष्यों से enteroids के प्रसार में वृद्धि । इसके अलावा, हम TLR4 ligand एलपीएस है, जो बहाल किया गया था जब माउस, मानव, या दाता मां के दूध की उपस्थिति में enteroid प्रसार कम दिखाने के enteroids के लिए प्रशासित किया गया । भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए आंत्र लकीर के बाद शिशुओं से प्राप्त enteroids पर उच्च प्रवाह दवा स्क्रीन के साथ व्यक्तिगत परिशुद्धता दवा शामिल हो सकते हैं देखने के लिए कैसे कुछ दवाओं विशेष शिशु को प्रभावित कर सकते हैं. एक साथ ले लिया, हमें आशा है कि अंय प्रयोगशालाओं आंत के बाल चिकित्सा रोगों के कई विभिंन स्थानों में इन तकनीकों का उपयोग करने में संभावित सफलता मिलेगा, परिषद सहित, जहां एक तत्काल नैदानिक नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास कुछ भी नहीं है और हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

एमजी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान K08DK101608 और R03DK111473 द्वारा समर्थित है, सिक्का की मार्च फाउंडेशन अनुदान No .5-FY17-79, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के बच्चों की खोज संस्थान और सेंट लुइस बच्चों के अस्पताल और विभाग के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन, सेंट लुइस में बाल रोग । CJL R01DK104946 (PI: Silverman), वाशिंगटन विश्वविद्यालय और सेंट लुइस बच्चों के अस्पताल के बच्चों की खोज संस्थान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-079
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Humulin N (Insulin) Eli Lilly And Company 0002-8315
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Gentamicin Gibco 15750-060
Amphotericin B Gibco 15290-026
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 Invitrogen 15575-020
1x Advanced DMEM/F-12 Invitrogen 12634-028
200 mM L-Glutamine Gibco 25030-081
1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3537
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165
100x N-2 Supplement Gibco 17502-048
50x B-27 Supplement Minus Vitamin A Gibco 08-0085SA
100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503
Recombinant Mouse Wnt3a Protein R&D Systems 1324-WN
Murine Noggin PeproTech 250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1 R&D Systems 3474-RS
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix Corning 356231
35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish Eppendorf 0030700112
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf 0030722116
48-Well Cell Culture Plate Eppendorf 0030723112
8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Thermo Scientific 154534
50 mL Conical Tube Corning 352070
100 μM Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-549
70 μM Sterile Cell Strainer Fisher Scientific 22-363-548
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 Invitrogen 20012-027
16% Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma-Aldrich D9663
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Invitrogen D1306
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-544-D
Confocal Microscope Leica TCS SP8 X Leica Microsystems N/A
Photoshop CS6 Adobe Systems N/A
18 G 1.5 Inch Needle Becton Dickinson 305196
Isoflurane Sigma-Aldrich 792632
Oxytocin Sigma-Aldrich O3251
Human Double Electric Breast Pump Lansinoh 044677530163
5 mL Round Bottom Test Tube Corning 352058
Rubber Stoppers Frey Scientific 560761
Ki67 Antibody Abcam AB15580
Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' Integrated DNA Technologies N/A

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References

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चिकित्सा मुद्दा १३२ Enteroids आंत्र स्टेम सेल मिनी हिंमत organoids नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ मां का दूध दुहना
मां का दूध Enteroids के विकास को बढ़ाता है: सेल प्रसार के एक <em>पूर्व Vivo</em> मॉडल
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Lanik, W. E., Xu, L., Luke, C. J.,… More

Lanik, W. E., Xu, L., Luke, C. J., Hu, E. Z., Agrawal, P., Liu, V. S., Kumar, R., Bolock, A. M., Ma, C., Good, M. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. J. Vis. Exp. (132), e56921, doi:10.3791/56921 (2018).

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