Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid-Kultur-System von Neugeborenen Maus oder vorzeitige menschlichen Darm sowie eine effiziente Methode um Milch von Mäusen zu sammeln.
Abstract
Menschlichen kleinen intestinalen Enteroids ergeben sich aus den Krypten und wenn Sie in einer Stammzellnische angebaut enthalten alle Epithelzelle Typen. Die Fähigkeit, menschliche Enteroid ex Vivo Kultur Systeme einzurichten sind wichtig, Modell Darm Pathophysiologie und studieren die bestimmten zellulären Reaktionen beteiligt. In den letzten Jahren sind Enteroids von Mäusen und Menschen, passagiert und Querneigung Weg für die zukünftige Verwendung in mehreren Labors auf der ganzen Welt kultiviert wird. Diese Enteroid-Plattform kann verwendet werden, testen Sie die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen und Medikamente und welche Auswirkungen auf verschiedene Zelltypen im Darm ausgeübt werden. Hier ein Protokoll für die Gründung der primäre Stammzellen gewonnenen kleinen intestinalen Enteroids abgeleitet von neugeborenen Mäusen und vorzeitige menschlichen Darm wird zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus wurde dieses Enteroid-Kultur-System eingesetzt, um die Auswirkungen der artspezifische Muttermilch zu testen. Maus-Muttermilch erhalten Sie effizient mit einer veränderten menschliche Milchpumpe und ausgedrückt Maus Milch kann dann für weitere Forschung Experimente verwendet werden. Wir zeigen nun die Auswirkungen der zum Ausdruck gebrachten Maus, Mensch, und Spender Muttermilch auf das Wachstum und die Verbreitung von Enteroids von neugeborenen Mäusen oder vorzeitige menschlichen Dünndarm abgeleitet.
Introduction
Nekrotisierende Enterokolitis ist (NEC) die führende Ursache des Todes von Magen-Darm-Erkrankung bei Frühgeborenen, die betreffen fast 1 in 10 Neugeborenen vor 29 Wochen Schwangerschaft1,2,3. Die Hälfte der Säuglinge mit NEC Fortschritte, die schwerste Form, wo überleben befindet sich nur 10-30 %4,5. In den Vereinigten Staaten einem geschätzten 2 Milliarden USD pro Jahr ausgegeben werden, Behandlung von Säuglingen mit NEC6,7, doch weder die Überlebensrate noch Therapie hat in den vergangenen 30 Jahren verändert. Die Pathogenese der NEC zeichnet sich durch intestinale Verletzungen und beeinträchtigt mukosalen Heilung8,9,10,11, jedoch die Signalwege führt zu einer verschärften entzündliche Reaktion und Mechanismen, die Entzündung umzukehren bleiben unvollständig verstanden.
Die Verwaltung der menschlichen Muttermilch hat sich herausgestellt, die nur Schutzstrategie gegen NEC für Frühgeborene zu sein. Wir haben bereits gezeigt, dass Muttermilch gegen NEC Entwicklung durch Hemmung des angeborenen Immunsystems Rezeptor Abgabe-wie Rezeptors 4 (TLR4) in das Darmepithel über den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR schützt) Signalisierung Weg11. Ergänzung der Muttermilch auf eine experimentelle NEC Formel gedämpft, die entzündliche Reaktion in NEC wie durch Hemmung der Enterozyten Apoptose und Wiederherstellung der Enterozyten Verbreitung in einer Weise, die abhängig von epidermalen Wachstum war, gesehen Factor (EGF) und EGFR-11. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass Nitrat, ein weiterer Bestandteil der Muttermilch, trägt zu seiner schützenden Natur durch Modulation der intestinalen Perfusion, im Vergleich zu Säuglingsnahrung, die Nitrat fehlt und kann dazu beitragen, die erhöhte Häufigkeit von NEC in Formel gefüttert Kleinkinder12,13. Andere Verbindungen, die in der Muttermilch, die nachweislich in den Schutz gegen NEC einbezogen sind Muttermilch-Oligosaccharide, L-Arginin, Glutamin und Lactoferrin14,15,16, 17,18,19. Diese positiven Elemente der Muttermilch zeigen die Notwendigkeit, seine Verwendung in der Prävention von NEC, aber auch betonen, wie wichtig es ist, die Mechanismen, Signalisierung, Wege und zelluläre Effekte wie Muttermilch ist den Schutz gegen NEC Vermittlung beteiligt .
In Ordnung, weiter zu studieren die Schutzeigenschaften der Muttermilch in einem Mausmodell der NEC, entwickelten wir eine neuartige, einfach zu bedienende-Technik durch die Maus Muttermilch aus einem narkotisierten Damm mit einer elektrischen Muttermilch Pumpe11,12 extrahiert werden können . Diese Strategie des Erwerbs von Maus-Muttermilch ist vorteilhaft, nicht nur weil Muttermilch Pumpen leicht zugänglich und effizient bei der Beschaffung von Muttermilch, sondern auch weil diese Methode ermöglicht eine artspezifische Brust Milch Analysen. Infolgedessen, wir können die Auswirkungen der Maus Muttermilch mit denen des menschlichen abgepumpte Milch vergleichen sowie pasteurisiert menschlichen Spender Milch von einer Milch-Bank in artspezifische Modelle. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Brust Milchkomponenten in Bezug auf ihren Beitrag zur Prävention von NEC. Andere Forscher haben Brust Milch Extraktionsverfahren entwickelt, aber diese Techniken sind manuell und erfordert in der Regel mehr als ein Labor Mitglied20,21,22. Hier ist eine einfache Technik, die genutzt werden kann, indem Sie ändern eine menschliche elektrische Milchpumpe um Milch von einer Maus zu sammeln vorgestellt. Diese Technik kann auch auf andere Arten angewendet werden.
Um die Signalwege mit NEC angemessen zu verhören, sind Modellsysteme erforderlich, um die verschiedenen Zelltypen im Krankheitsprozess betroffenen bewerten. Hier diskutieren wir ein solches Modell - Enteroids- und deren Etablierung von Mäusen und menschlichen Dünndarm. Menschlichen Darm Enteroids (HIEs) bieten vor allem bedeutende versprechen, denn sie eine innovative, genetisch vielfältigen ex Vivo Menschmodell bieten um die Untersuchung pathophysiologischer Prozesse zu unterstützen, die im Magen-Darm-Trakt stattfinden 23. Enteroids sind gefunden worden, um langfristige kultiviert werden und kann für spätere Verwendung23eingefroren werden, und im Gegensatz zu menschlichen Darm Organellen (Chios), deren Kulturen von induzierbaren pluripotente Stammzellen entwickelt werden, Enteroids entstehen aus Stammzellen innerhalb von isolierten Darm Krypten24. Enteroids erfordern weniger Wartung, kann schnell25infiziert, und kann leicht festgestellt werden, da Darm Krypten als Chios23differenzierter sind. Deshalb bieten HIEs viele Vorteile gegenüber bestehenden Techniken, weil sie entwickelt werden können, um regionsspezifische kompositorischen und funktionellen Eigenschaften des menschlichen Magen-Darm-Epithel23aufweisen. Die Verwendung von Enteroids ist eine hochwirksame Wahl wenn diese ein menschliches Modell des Darmes, mit Einhaltung der Region-spezifische Einschränkungen und Ease of Use. Hier zeigen wir die Technik der Isolierung und Aufrechterhaltung primäre Stammzellen gewonnenen kleinen Darm Enteroids von Mäusen und menschlichen Säuglingen verfrüht.
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Protocol
Alle tierische Verfahren in dieser Studie wurden von entweder der Washington University in St. Louis institutionelle Animal Care und Use Committee (Protokoll 20160187) oder institutionelle Tierbetreuung University of Pittsburgh und Use Committee (Protokoll 14103918) genehmigt. Menschlichen fetalen Dünndarm in weniger als 24 Wochen Schwangerschaft wurde im Einklang mit der University of Pittsburgh Leitlinien für die Auftragsvergabe des anatomischen Gewebe nach Institutional Review Board Genehmigung (Protokoll PRO14100537) von der University of erhalten. Pittsburgh Gesundheit Wissenschaften Gewebebank durch ein ehrlicher Makler-System. Anonymisierte Muttermilch oder pasteurisierte Spender Muttermilch wurde mit einem Verzicht auf der Zustimmung von der University of Pittsburgh Institutional Review Board erhalten.
(1) Krypta Isolation und Gründung der Enteroids von neugeborenen Mäusen oder vorzeitige menschlichen Dünndarm
- Medien-Vorbereitung
Hinweis: Medien sollten in der Haube am Vortag Krypta Isolierung vorbereitet werden.- 1,11 L Kulturmedien vorbereiten. Beginnen Sie mit 1 L Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin und 110 mL fetalen Bovine Serum (FBS) (Endkonzentration 10 %), 11 mL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %) und 1,1 mL sterile Insulin (final Konzentration von 0,1 %).
- 500 mL PBS-Antibiotikum Mischung zubereiten. Beginnen Sie mit 500 mL 1 x Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 10 % FBS und 5 mL Gentamicin (Endkonzentration 1 %), 1 mL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %) und 5 mL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %).
- Bereiten Sie 30 mL Cell Disruption Medien #1. Bereiten Sie zuerst 30 mL Nährmedien. Fügen Sie 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (Endkonzentration 10 mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %).
- Bereiten Sie 30 mL Cell Disruption Medien #2. Bereiten Sie zuerst 30 mL Nährmedien. Fügen Sie 300 µL 0,5 M EDTA (Endkonzentration 5 mM), 300 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %) und 60 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %).
- Bereiten Sie 50 mL Krypta Kulturmedien ohne Wachstumsfaktoren. Messen von 33,4 mL 1 x erweiterte DMEM/F-12 und 10 mL FBS (Endkonzentration 20 %).
- Hinzufügen von 500 µL Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1 %), 500 µL L-Glutamin (Endkonzentration 1 %), 500 µL Gentamicin (Endkonzentration 1 %), 100 µL Amphotericin B (Endkonzentration 0,2 %), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane Sulfonsäure (HEPES) (Endkonzentration 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcystein (Endkonzentration 1 mM), 500 µL 100 x n-2-Beilage, 1 mL 50 x serumfreien Ergänzung (z.B.B-27) abzüglich Vitamin A und 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
- Bereiten Sie 1 mL Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren. Bereiten Sie zuerst 1 mL der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren. Fügen Sie 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (Endkonzentration 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL Birne (Endkonzentration 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (Endkonzentration 500 ng/mL) und 0,5 µL 100 µg/mL EGF (Endkonzentration 50 ng/mL).
- Krypta Isolierung
- Ort solubilisiert Basalmembran Extrakt (siehe Tabelle der Materialien) auf Eis Auftauen vor Beginn.
Hinweis: Halten Sie Basalmembran auf Eis, oder es werden polymerisieren. - In Übereinstimmung mit den institutionellen Animal Care und Use Committee Protokoll für Mäuse mehr als 14 Tage alt, einschläfern Mäuse mit zwei Methoden der Euthanasie mit der zweiten wird ein physischer Verfahren, um Tod zu gewährleisten.
Hinweis: Für Mäuse unter 14 Tage alt, ist Enthauptung das Standardverfahren mit einer Schere. - Mit Schere und Pinzette, machen Sie einen vertikalen Schnitt auf der Mittellinie des Bauches, durch die Haut und Bauchfell, über die gesamte Länge des Abdomens. Verbrauchsteuern im Dünndarm aus dem Magen, der Blinddarm mit Schere und das Mesenterium mit einer Pinzette entfernen.
Hinweis: Zwei Wochen alten männliche und weibliche C57BL/6J Maus Welpen, je 5,5-7 g, dienten zur Krypta Isolierung. Jedem Alter oder Größe Maus kann zur Krypta Isolierung verwendet werden. - Krypta Isolierung, Lage Darm gerade, frisch geernteten Dünndarm vorzubereiten und den Darm längs entlang seiner gesamten Länge mit einer Schere schneiden.
Hinweis: Maus und menschlichen Darm können in ähnlicher Weise zubereitet werden. - Saubere Hocker aus Darm durch sanft schütteln den Darm hin und her in einer PBS-Antibiotikum-Mischung gefüllt Petrischale mit Pinzette.
- Eine 50 mL konische Rohr 30 mL Cell Disruption Medien #1 hinzufügen. Geschnitten Sie der Darm in 0,5 cm Länge Stücke direkt in das Rohr. Legen Sie das Rohr in einem Eiskübel und sanft schütteln im Shaker mit niedrigster Geschwindigkeit für 15 min.
- Während das Gewebe auf den Shaker, erhalten Sie 24 oder 48-Well Platten um Krypten wachsen, wenn die Enteroids für RNA oder DNA-Protein isoliert verwendet werden. Einsatz 8-Well-Kammer Folien, Krypten zu wachsen, wenn die Enteroids für ganze verwendet werden montieren konfokale Bildgebung.
- Fügen Sie in der Haube 15 µL der Basalmembran am unteren Rand jedes gut von 24 oder 48-Well-Platte hinzu. Wenn Kammer Folien verwenden, fügen Sie unten jeder Kammer 9 µL der Basalmembran.
Hinweis: Stellen Sie die Lautstärke der Basalmembran entsprechend der Größe der Platte bei Bedarf. - Schnell die Basalmembran mit der Pipettenspitze so verteilt, dass die Basalmembran eine dünne Schicht auf der Unterseite des Brunnens bildet. Legen Sie die Platte bei 37 ° C im Brutschrank für 30 min an der Basalmembran zu polymerisieren zu ermöglichen.
Hinweis: Wenn die Basalmembran keine dünne Schicht ist oder Basalmembran Luftblasen enthält die Krypten nicht befestigen. - Nach 15 min auf einen Shaker filtern Sie das Gewebe durch ein 100 µm-Sieb. Die Durchströmung zu verwerfen.
- Eine neue 50 mL konische Rohr 30 mL Cell Disruption Media #2 hinzufügen. Gewebe aus Sieb entfernen und Hinzufügen der Röhre.
- Legen Sie das Rohr in einem Eiskübel und sanft schütteln im Shaker mit niedrigster Geschwindigkeit für 15 min.
- Nach 15 min auf den Shaker filtern Sie Gewebe durch ein 100 µm-Sieb. Halten Sie Durchströmung bei diesem Schritt für den Fall, dass Ertrag niedrig in späteren Schritten ist.
Hinweis: Alle Strömung durch Rohre muss auf Eis gehalten werden. - Hinzufügen einer neuen 50 mL konische Rohr 15 mL DMEM mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin. Gewebe aus Sieb entfernen und Hinzufügen der Röhre. Kräftig schütteln Sie das Rohr von hand 10 S. Filter durch ein 100 µm-Sieb und sammeln Sie Durchströmung zu. Wiederholen Sie, bis der Durchfluss durch keine Partikel enthält.
- In der Haube filtern Sie die Durchströmung von vorherigen Schritt in ein neues 50 mL konische Röhrchen mit 70 µm Siebe für Maus Gewebe oder 100 µm Siebe für menschliches Gewebe.
Hinweis: Haben Sie zusätzliche Siebe im Standby-Modus und gießen Sie langsam wie Siebe mit Ablagerungen verstopfen. - Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 X g für 8 min bei 4 ° C und Platz direkt in einen Eiskübel in der Kapuze. Entfernen Sie den Überstand durch Pipette ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen Sie Pellet mit gewünschten Gesamtbetrag der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren.
Hinweis: Die angereicherten Krypten sind die "sandig" Schicht des Pelletofens. Jede erfordert gut 250 µL der Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren.
- Ort solubilisiert Basalmembran Extrakt (siehe Tabelle der Materialien) auf Eis Auftauen vor Beginn.
- Einrichtung von enteroids
- Platte der Krypta Medien Mischung direkt auf der Basalmembran.
- Überprüfen Sie Krypten mit einem Mikroskop um sicherzustellen, dass die Isolierung Prozess erfolgreich war.
Hinweis: Zellen und Kugeln der Zellen sind erwünscht. Ca. 100 einzelnen Krypten sind pro Bohrloch beschichtet. - Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 3 h Krypten zur Einhaltung der Basalmembran ermöglichen.
Hinweis: Diese Inkubation ist mit Krypta Nährmedien ohne Wachstumsfaktoren. - Abnehmen Sie die Medien und überschüssige Krypten, die konnte nicht angehängt werden mit einer Pipette P-200 langsam.
Hinweis: Stören Sie die Basalmembran nicht, wie die beigefügten Krypten verdrängt werden können. - Fügen Sie langsam 250 µL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren in jede Vertiefung.
Hinweis: Für 24-48-Well Platten oder Kammer gleitet, 250 µL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren ist ausreichend. - Ersetzen Sie die Medien alle 2 Tage mit frischem Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren für 5 Tage vor Behandlungen, um optimale Anhaftung und Wachstum zu ermöglichen.
(2) Maus Brust Milch Kollektion
- Ihre Welpen für 6 h vor dem Melken trennen Sie Naturfreibad C57BL/6J stillende postpartale 7-12 Tage.
- Betäuben Sie den stillenden Damm mit Isofluran über eine Nase Kegel zu und verwalten Sie eine subkutane Injektion von Oxytocin bei 0,15 IU/kg Körpergewicht. Warten Sie 3 Minuten vor dem Melken Verfahren.
- Sauger mit 70 % Ethanol vor dem Melken Verfahren reinigen und trocknen lassen.
- Extrahieren Sie Milch aus Zitzen ein zu einem Zeitpunkt mit einer menschlichen elektrische Milchpumpe mit Silikonschlauch in eine 5 mL-Sammelröhrchen Maus Zitzen angepasst.
Hinweis: Optimale Milchpumpen haben zwei Einstellungen, eine für Geschwindigkeit und eine für die Absaugung. Es empfiehlt sich, mit den niedrigsten Einstellungen jedes starten und beide langsam erhöhen, bis die Milch gewonnen wird. Im Idealfall werden Gesamtausbeute ~ 500 µL - 1 mL der Maus Muttermilch pro stillende Mutter. - Sofort aliquoten Muttermilch und Store bei-80 ° C.
Hinweis: Vermeiden Sie Frost/Tau-Zyklen. - Behandlung von Enteroids am 5. Tag mit 50 µL/mL Muttermilch Maus pro mL der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren für 24 h bei 37 ° C.
3. gesamte montieren Sie Färbung des Enteroids
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Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie 16 mL 1 X PBS pro 8 Brunnen.
- 1 X PBS pro 8 Brunnen 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) vorbereiten.
- Vorbereitung 2 mL 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer pro 8 Brunnen.
- Bereiten Sie 24 mL PBS-Tween (PBST ist 0,1 % Tween 20 in 1 X PBS) pro 8 Brunnen.
- Bereiten Sie 2 mL 10 % normale Esel Serum (NDS) in 0,1 % PBST (10 % NDS/PBST) pro 8 Brunnen.
- Bereiten Sie 4 mL 1 % NDS in 0,1 % PBST (1 % NDS/PBST) pro 8 Brunnen.
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Färbung von Tag 1
- Aspirieren von Behandlungen und Enteroids mit PBS waschen. Fügen Sie 250 µL 4 % PFA pro Bohrloch. Legen Sie auf Rotator für 1-2 h bei 4 ° C. Entfernen Sie die 4 % PFA mit Pipette.
- Waschen 4 Mal mit 250 µL/Well 1 x PBS. Setzen Sie auf Rotator für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
Hinweis: Es ist möglich, Platte für 1-2 Tage bei 4 ° C zu speichern, wenn nötig. - Fügen Sie 250 µL/Well 0,1 % Triton x-100. Inkubation für 1 h bei RT. Entfernen Sie 0,1 % Triton x-100 mit Pipette.
- Waschen 4 Mal mit 250 µL/Well 1 x PBS. Legen Sie auf Rotator für 15 min bei RT
- Fügen Sie 250 µL/Well 10 % NDS/PBST. 45 min bei RT. Entfernen Sie inkubieren 10 % NDS/PBST mit Pipette.
- 250 µL/Well Primärantikörper, verdünnt 1/250 in 1 % NDS/PBST hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Die optimale Antikörper Verdünnung variiert je nach Hersteller.
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Färbung von Tag 2
- Mindestens 5 Mal für 4-5 Std. mit 250 µL/Well PBST waschen. Setzen Sie auf Rotator bei 4 ° C zwischen jedem Waschgang.
- Fügen Sie 250 µL/Well Sekundärantikörper, verdünnt 1/1.000 in 1 % NDS/PBST. Die Platte in Folie wickeln und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
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Färbung von Tag 3
- Fügen Sie 250 µL/Well nuklearen 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 15 min. Fleck.
Hinweis: Halten Sie die Platte in der Dunkelheit. - Waschen Sie 6 Mal mit 250 µL/Well PBST. Setzen Sie auf Rotator für 10 min bei 4 ° C zwischen jedem Waschgang.
- Mount Deckglas auf Kammer schieben mit Montage Medien.
- Nehmen Sie Bilder mit einem 40 X Objektiv confocal Mikroskop und ebenso Rendern in ein Raster-Grafik-Editor (siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 250 µL/Well nuklearen 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 15 min. Fleck.
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Representative Results
Zuerst wollten wir untersuchen, ob die Muttermilch ausgedrückt oder pasteurisierte Spender Muttermilch wirkten sich auf kleinen Darm Enteroids. In der Tat erhöht die Muttermilch und Spender Muttermilch das Wachstum des Neugeborenen Maus (Abbildung 1A) und vorzeitige menschlichen abgeleiteten Enteroids (Abbildung 1 b).
Da die Muttermilch das Wachstum der kleinen intestinalen Enteroids erhöht, untersuchten wir als nächstes wenn Muttermilch auf die Verbreitung von vorzeitigen menschlichen Enteroids ausgewirkt. Wir zeigen, dass die Muttermilch die Verbreitung der vorzeitigen menschlichen Enteroids im Vergleich zur Kontrolle (–Abbildung 2AB, Ki67, rote Färbung) erhöht. Wichtig ist, erhöht die menschlichen Spenders Muttermilch auch Enteroid Verbreitung im Vergleich zu kontrollieren, aber in etwas geringerem Maße als nicht-pasteurisierte Muttermilch (Abb. 2 b–C). Wir als nächstes die Ki67 mRNA Expression in die vorzeitige menschlichen Enteroids ausgewertet und entdeckte, dass Ki67 in der Enteroids behandelt mit Muttermilch oder Spender Muttermilch relativ zum Steuerelement (Bild 2D) erhöht wurde.
Als nächstes wollten wir sehen, ob diese Effekte im Hinblick auf die Muttermilch artspezifische waren. Wir entwickelten eine Methode, Muttermilch von stillenden Mäuse mit einem modifizierten kommerziell verfügbare menschliche Muttermilch Pumpe wie Referenzen11,12zu sammeln. Dargestellt ist ein narkotisierten stillende dam unterziehen Milchsammlung dieses Gerät (Abbildung 3) verwenden. Die nächste Serie von Experimenten wurde am Maus-Enteroids durchgeführt und wir bewerten die Verbreitung Auswirkungen von abgepumpter Milch von der Maus "," Mensch "oder" Spender Muttermilch. Wie in Abbildung 4dargestellt, Maus, menschliche und pasteurisierte Spender Brust Milch erhöhte Proliferation in der Maus-Enteroids im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 4A–D). Verbreitung in der Maus-Enteroids wurde in Anwesenheit von TLR4 Liganden, Lipopolysaccharid (LPS), im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 4A, E) verringert. Maus, Mensch oder Spender Brust Milch alle wiederhergestellt Enteroid Verbreitung im Beisein von LPS wie erhöhte Ki67 Färbung zeigt gegenüber allem LPS allein (Abbildung 4F–H).
Aus unseren Experimenten zeigen wir, dass kleine Darm Enteroids von neugeborenen Mäusen abgeleitet und vorzeitige menschlichen fetalen Darm in Kultur beibehalten werden kann. Weiter bieten wir eine neuartige Brust Milch Sammlung-Methode, die bietet eine effiziente Möglichkeit zur Muttermilch aus Mäusen, gewinnen, die dann für verschiedene Experimente verwendet werden kann. Wir entdeckten, dass abgepumpte Milch von Menschen oder Mäuse Größe, Wachstum und Vermehrung in Maus und menschlichen Enteroids erhöht. Maus, Menschen- und Spender Muttermilch restauriert darüber hinaus die Enteroid Verbreitung nach LPS-Exposition. Dies deutet darauf hin, dass Muttermilch entzündungshemmende Wirkung auf den Dünndarm von Mäusen und Menschen ausüben kann.
Abbildung 1: Muttermilch und Spender Muttermilch erhöhen die Größe und das Wachstum von Maus und vorzeitige menschlichen Enteroids. Vergößerung der kleinen intestinalen Enteroids von neugeborenen Mäusen (p14) oder vorzeitige menschlichen Darm mit Medien (Control), Muttermilch oder Spender Muttermilch (50 µL/mL) für 24 Std. Größe Bar behandelt: 1.000 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version davon Abbildung.
Abbildung 2: Muttermilch und Spender Muttermilch erhöhen die Verbreitung von vorzeitigen menschlicher Enteroids. (A) konfokale Mikrographen der vorzeitigen menschlichen Enteroids für 5 Tage, mit der Muttermilch und pasteurisierte Spender Muttermilch für 24 h behandelt und gebeizt für die Verbreitung Markers Ki67 (rot) und DAPI (nukleare, blau) kultiviert. Größe Bar: 50 µm. (B) qRT-PCR für Ki67 Ausdruck der menschlichen Enteroids bezogen auf das Zimmermädchen gen RPLO. n = 5 pro Gruppe. p < 0,0001 Vergleiche mit Student t -Test im Vergleich zur Kontrolle. Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Sammlung von Milch von einem narkotisierten Maus über eine modifizierte menschliche Milchpumpe. Sterile Muttermilch Pumpenschläuche auf Zitzen narkotisierten stillende Mutter nach Erhalt Oxytocin Injektion gelegt. Maus Milch werden über die menschliche Milchpumpe auf mittlerer Geschwindigkeit und Kraft in eine 5 mL-Sammelröhrchen. Sammelbände alle Zitzen reichen von 500 µL bis 1 mL pro Maus postnatale Tage 7-12 entnommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Maus, menschliche und pasteurisierte Spender Muttermilch erhöhen Maus Enteroid Verbreitung. (A-H) Konfokale Mikrographen p14 kleinen Darm Maus Enteroids (Control A) behandelt mit Maus Muttermilch (MBM, B), Muttermilch (BM, C) oder menschlichen Spenders Muttermilch (DBM, D) 50 µL/ml Medien für 12 h in der Abwesenheit ( A-D) oder das Vorhandensein von Lipopolysaccharid (LPS) in einer Dosis von 25 µg/mL von Medien für 12 h, (E-H) und für die Verbreitung Markers Ki67 (rot) und DAPI (Kernenergie, blau) gefärbt. Größe Bar: 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das Darmepithel besteht aus vielen zellulären Subtypen, die sind verantwortlich für die Bereitstellung von Host-Abwehr von Krankheitserregern, Darm Barriere Integrität, und in der Pathogenese verschiedener Krankheiten durchbrochen werden kann. Während Tiermodelle einige Facetten der Krankheit zusammenfassen können, bietet die ex-Vivo -Modell des Enteroids, abgeleitet aus dem Dünndarm von Mäusen und Menschen eine Plattform, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen zu testen. Die Bedeutung des Enteroid-Modells kann Forscher Kultur und intestinale Stammzellen in allen epithelialen Zellen Subtypen unterscheiden, von naiv oder kranke Tiere und Menschen, die nicht mit vorhandenen Methoden zur Verfügung stehen. Dieses Modellsystem kann für Infektionen mit humanpathogenen verwendet werden, die möglicherweise nicht leicht übersetzbar in der Maus, wie Enterovirus25 oder Norovirus26 unter anderem. Das Enteroid-Modell hat mehrere Vorteile und Anwendungen; Allerdings muss darauf geachtet werden, um Einheitlichkeit in der Reagenzien, die verwendet werden, um die Medien und die bestimmte exogene Wachstumsfaktoren, die für das Überleben der Enteroids zu machen.
Im Rahmen des Enteroid-Modells sind mehrere Schritte von entscheidender Bedeutung für den Erfolg in der Herstellung von Enteroids zu sichern. Um kalte ischämische Zeit zu minimieren, sollte zweckmäßigerweise Gewebe verarbeitet werden. Enteroids kann bis zu 24 Stunden hergestellt werden, nachdem das Gewebe geerntet wird, wenn das Gewebe in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium bei 4 ° c steht Dies kann die Möglichkeit, Versand oder Transport erleichtern. Für die Einrichtung des Enteroids muss der Basalmembran eine dünne, flache Ebene am unteren Rand jedes gut für den Krypten zu befestigen und zu wachsen. Wenn die Basalmembran nicht flach ist oder Luftblasen vorhanden, die Krypten können nicht haften und wird entfernt, wenn die Medien verändert werden. Nachdem die Enteroids festgelegt sind, können sie passagiert alle 7 Tage oder in flüssigem Stickstoff für langfristige Lagerung eingefroren. Ausbau und Ergänzung der Krypta Nährmedien mit Wachstumsfaktoren und die Verwaltung einer jeden Behandlung müssen langsam und an den Rand des jedes gut, nicht zu stören den Enteroids erfolgen. Von der Enteroids können Störungen gelöst und weggespült, wenn die Medien geändert werden. Für optimale Ergebnisse sollte darauf geachtet werden, die Integrität der Basalmembran und den beigefügten Enteroids zu bewahren.
In der aktuellen Studie berichten wir, dass Enteroids von neugeborenen Mäusen abgeleitet und Frühgeborene können wachsen und vermehren sich in Anwesenheit von verschiedenen Arten von Muttermilch. Diese Studien voraus unser Verständnis der Auswirkungen der Muttermilch auf die vorzeitige Darm. Wir bieten eine detaillierte Methode zum Enteroid Kulturen in das Labor von Menschen und Mäusen zu etablieren. Darüber hinaus zeigen wir Ihnen eine effiziente Methode des Sammelns der Muttermilch von einer stillenden Maus verwenden eine modifizierte elektrische menschliche Milchpumpe. Wir zeigen, dass Maus menschlichen und pasteurisierte Spender Muttermilch verbessern, das Wachstum und die Verbreitung von Enteroids von Mäusen und Menschen. Darüber hinaus zeigen wir verringerten Enteroid Verbreitung im Beisein der TLR4 Liganden LPS, die restauriert wurde, wenn der Enteroids Maus, Mensch oder Spender Muttermilch verabreicht wurde. Zukünftige Anwendungen gehören personalisierte Präzisionsmedizin mit Hochdurchsatz-Drogen-Bildschirme auf Enteroids erhalten von Säuglingen nach Darm-Resektion zu sehen, wie bestimmte Medikamente das besondere Kind auswirken können. Zusammen genommen, wir hoffen, andere Laboratorien finden potenzielle Erfolg bei der Nutzung dieser Techniken in vielen verschiedenen Bereichen der pädiatrischen Erkrankungen des Darms, darunter NEC, wo gibt es klinische dringend neue therapeutische Strategien zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben und frei von Interessenkonflikten.
Acknowledgments
MG wird unterstützt durch Zuschüsse, K08DK101608 und R03DK111473 von den National Institutes of Health, März des Dimes Foundation Grant Nr. 5-FY17-79, die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital und dem Department of Pediatrics an der Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL stützt sich auf R01DK104946 (PI: Silverman), die Kinder Discovery Institute of Washington University und St. Louis Children Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
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