Summary
Bu iletişim kuralı, Yenidoğan fare veya erken insan bağırsak yanı sıra fareler süt toplamak için verimli bir yöntem bir enteroid kültür sistemi kurmak açıklar.
Abstract
İnsan küçük bağırsak enteroids kriptalarının türetilmiştir ve kök hücre niş içinde yetiştirilen epitel hücre türlerinin tümünü içerir. İnsan enteroid ex vivo kültür sistemleri kurmak için yetenek modeli bağırsak patofizyolojisi ve belirli hücresel yanıt dahil çalışma gerekir. Son yıllarda, enteroids fareler ve insanlar, pasajlı ve banked uzakta birkaç laboratuarlarında ileride kullanmak için dünya çapında kültürlü. Bu enteroid platformu çeşitli tedaviler ve ilaçlar etkilerini ve farklı hücre tipleri bağırsak üzerinde ne gibi etkileri sarf test etmek için kullanılabilir. Burada, birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids kurmak için bir protokol yenidoğan fareler türetilen ve erken insan bağırsak sağlanır. Ayrıca, bu enteroid kültür sistemi species-specific anne sütü etkilerini test etmek için kullanılmıştır. Fare anne sütü verimli bir şekilde değiştirilmiş insan göğüs pompası kullanılarak elde edilebilir ve ifade fare süt o zaman daha fazla araştırma deneyler için kullanılabilir. Biz şimdi ifade fare, insan, etkileri göstermek ve neonatal fareler veya erken insan ince bağırsak donör anne sütü büyüme ve enteroids yayılması türetilmiş.
Introduction
Enterokolit Nekroze edici (NEC) gastrointestinal hastalığı etkileyen yaklaşık 28 hafta gebelik1,2,3önce tarihi 1 10 bebeklerde prematüre bebeklerde ölüm önde gelen nedenidir. Yarısı, bebeklerin hayatta kalma sadece % 10-304,5nerede en ağır formu için NEC ilerleme ile. Amerika Birleşik Devletleri'nde bir tahmini 2-3 milyar YTL/yıl harcanan bebekler NEC6,7ile tedavi henüz ne sağkalım oranı ne de terapi son 30 yıl içinde değişti. NEC patogenezinde bağırsak yaralanma ile karakterizedir ve Mukozal iyileşme8,9,10,11, ancak, bir yaygınlaşacak önde gelen sinyal yolları Engelli inflamatuar yanıt ve inflamasyonu tersine çevirmek için mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.
İnsan anne sütü yönetim prematüre bebekler için NEC karşı strateji sadece koruyucu olduğu tespit edilmiştir. Biz daha önce anne sütü NEC geliştirme yolu ile yolu11sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) bağırsak epitel içinde doğuştan gelen bağışıklık reseptör toll benzeri reseptör 4 (TLR4) inhibisyonu yoluyla karşı korur göstermiştir. Anne sütü deneysel bir NEC Formula takviyesi Enterocytes apoptosis inhibisyonu ve restorasyon epidermal büyüme üzerinde bağımlı bir şekilde Enterocytes yayılması tarafından gösterildiği gibi NEC görüldüğü inflamatuar yanıt zayıflatılmış faktör (EGF) ve EGFR11. Başka bir çalışmada, o göstermek bu nitrat, başka bir bileşeni olan anne sütü, koruyucu doğası ile karşılaştırıldığında hangi NEC yüksek frekans için katkıda bulunabilir ve nitrat eksik bebek formülü, bağırsak perfüzyon oransal tarafından katkıda bulunur formülü bebeklerin12,13beslenir. İnsan sütü oligosakkaritler, L-Arginin, glutamin ve Laktoferrin14,15,16, anne sütü mevcut NEC karşı koruma dahil olmak için gösterilen diğer bileşikler içeren 17,18,19. Anne sütü yararlı bu unsurları NEC önlenmesinde kullanımı gerekliliği ortaya, ama aynı zamanda yollar ve hücresel etkileri anne sütü NEC karşı koruma arabuluculuk nasıl içinde ilgili sinyal mekanizmaları, eğitim önemini vurgulamak .
İleri çalışmalar amacıyla anne sütü, NEC, fare modeli koruyucu özelliklerini biz hangi fare tarafından anne sütü bir elektrik insan meme pompası11,12 kullanarak bir imzalat Barajı elde edilebilir bir roman, kullanımı kolay tekniği gelişmiş . Fare anne sütü edinme Bu strateji değil bu yöntem species-specific meme süt analizleri için verdiğinden yalnızca insan göğüs pompaları ama aynı zamanda hazır ve anne sütü, tedarik verimli olduğundan avantajlıdır. Sonuç olarak, biz fare anne sütü etkileri bu insan sütünü ile karşılaştırabilirsiniz yanı sıra species-specific modelleri süt bankada insan donör süt pastörize. Meme süt bileşenleri ile ilgili olarak yaptıkları katkı NEC önleme yolunda çalışması için bu teknik sağlar. Diğer araştırmacılar meme süt çıkarma yöntemleri geliştirdik, ancak, bu teknikleri el ile ve genellikle birden fazla laboratuvar üye20,21,22gerektirir. Burada bir fareden süt toplamak için bir insan elektrikli göğüs pompası değiştirerek kullanılabilir bir basit tekniği sunulur. Bu teknik diğer türler için de uygulanabilir.
Yeterli sinyal yolları NEC ile ilgili sorguya çekmek için model sistemleri tüm hastalık sürecinde etkilendiği bilinen farklı hücre türleri değerlendirmek için ihtiyaç vardır. Burada, bir tür modeli sistemi - enteroids - ve kendi kuruluş fare ve insan ince bağırsak tartışmak. Gastrointestinal sistem gerçekleşecek patofizyolojik süreçlerin çalışmada yardım etmek için bir yenilikçi, genetik olarak farklı ex vivo insan modeli sundukları çünkü insan bağırsak enteroids (HIEs) özellikle önemli söz, sağlamak 23. Enteroids uzun vadeli kültürlü tespit edilmiştir ve daha sonra kullanım23için dondurulmuş ve insan bağırsak olan kültürler indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden gelişmiştir, Organoids farklı olarak (HIOs), kök hücrelerden enteroids oluşturulur izole bağırsak kriptalarının24içinde. Enteroids daha az bakım gerektiren, olabilir hızlı bir şekilde25enfekte ve bağırsak kriptalarının daha HIOs23farklılaşmış beri kolayca kurulabilir. Bu nedenle, insan gastrointestinal epitel23bölgeye özel kompozisyon ve fonksiyonel özellikleri sergilemek geliştirilebilir çünkü HIEs mevcut teknikleri birçok avantajlar sunuyor. Enteroids kullanımı ihtiyacı olan bir insan modeli bağlılık bölgeye özgü sınırlamalar ve kullanım kolaylığı ile bağırsak ne zaman son derece etkili bir seçimdir. Burada izole edip birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids fareler ve prematüre insan bebeklerin bakımını yapma tekniği göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada tüm hayvan yordamları St. Louis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (iletişim kuralı 20160187) veya Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (iletişim kuralı 14103918) Washington üniversite tarafından kabul edildi. İnsan cenin ince bağırsak daha az 24 haftalık gebelik, Pittsburgh Üniversitesi anatomik doku tedarik kılavuzlarınıza uygun olarak kurumsal inceleme kurulu onayı (protokol PRO14100537) Üniversitesi'nden sonra elde edildi Pittsburgh Sağlık Bilimleri doku Bankası bir dürüst komisyoncu sistemi aracılığıyla. De-tanımlanan insan anne sütü veya pastörize donör anne sütü rıza Üniversitesi Pittsburgh Kurumsal değerlendirme Komitesi'nden feragat ile elde edildi.
1. crypt yalıtım ve Neonatal fareler veya erken insan ince bağırsak Enteroids kurulması
- Medyası hazırlama
Not: Medya crypt yalıtım önceki gün mahallede hazırlanmalıdır.- 1.11 L kültür ortamı hazırlamak. 4,5 g/M glikoz ve L-glutamin ile Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) 1 L ile başlayan ve 110 mL Fetal sığır Serum (FBS) (son konsantrasyonu % 10), 11 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1) ve 1.1 mL steril insülin (final Ekle konsantrasyon %0.1).
- 500 mL PBS-antibiyotik karışımı hazırlayın. İle % 10 500 mL 1 x Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) ile başlayan FBS ve 5 mL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 1 mL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2), ekleyin ve 5 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1).
- 30 mL hücre bozulma medya #1 hazırlayın. İlk 30 mL kültür ortamı hazırlamak. 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) eklemek (son konsantrasyonu 10 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve 60 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2).
- 30 mL hücre bozulma medya #2 hazırlayın. İlk 30 mL kültür ortamı hazırlamak. 300 µL 0,5 M EDTA ekleyin (son konsantrasyonu 5 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve 60 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2).
- 50 mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri olmadan hazırlayın. Ölçmek 33.4 mL 1 x gelişmiş DMEM/F-12 ve 10 mL FBS (son konsantrasyonu % 20) ekleyin.
- 500 µL eklemek penisilin-(son konsantrasyonu % 1), streptomisin 500 µL L-glutamin (son konsantrasyonu % 1), 500 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 100 µL Amfoterisin B (son konsantrasyonu % 0,2), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sülfonik asit (HEPES) (son konsantrasyonu 0.05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcysteine (son konsantrasyonu 1 mM), 500 µL 100 x N-2 ek, A vitamini eksi serum ücretsiz ek (örneğin, B-27) x 1 mL 50 ve 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
- 1 mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri ile hazırlayın. İlk 1 mL, Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri hazırlamak. 2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a ekleyin (son toplama 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL kafa (son toplama 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (son konsantrasyonu 500 ng/mL) ve 0.5 µL 100 µg/mL EGF (son konsantrasyonu 50 ng/mL).
- Crypt yalıtım
- Yer çözündürüldükten membran özü ( Tablo malzemelerigörmek) başlamadan önce çözülme buzda.
Not: Devam membran buz veya polimerize. - Ötenazi ile ikinci iki yöntemi ile fare fareler Yaş 14 günden daha büyük için kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi protokolü ile uyumlu, ötenazi ölüm emin olmak için fiziksel bir yordamı olmak.
Not: fareler için 14 gün altında yaş, işten çıkarma makas kullanarak standart bir uygulamadır. - Makas ve forseps kullanarak, cilt ve Periton, karın tüm uzunluğu için karın orta hat aşağı dikey bir kesi yapmak. İnce bağırsak mide çekum için makas ile tüketim ve Forseps ile bıçaklanmasından kaldırın.
Not: İki-hafta-yaşlı erkek ve dişi C57BL/6J fare pups, her tartı 5,5-7 g crypt yalıtım için kullanılmıştır. Herhangi bir yaş veya boyutu fare crypt yalıtım için kullanılabilir. - Taze hasat ince bağırsak crypt yalıtım için hazırlamak için bağırsak düz getirin ve bağırsak boyuna makas kullanarak tüm uzunluğu boyunca kesilmiş.
Not: Fare ve insan bağırsak benzer şekilde hazırlanabilir. - Temiz dışkı bağırsak sallayarak yavaşça bağırsak ve geriye bir PBS-antibiyotik karışım dolu forseps kullanarak kabında dışında.
- Hücre bozulma medya #1 30 mL 50 mL konik tüp ekleyin. Bağırsak 0,5 cm uzunlukta parçalara doğrudan tüp içine kesti. Tüp bir buz kovası ayarla ve yavaşça 15dk için en düşük hızda shaker üzerinde tahrik.
- Dokular üzerinde shaker olmakla birlikte, enteroids RNA, DNA veya protein yalıtım için kullanılacak ise kriptalarının büyümeye 24 veya 48 iyi tabaklar elde etmek. Eğer enteroids tamamı için kullanılmak üzere kriptalarının büyümeye kullanım 8-şey odası slaytlar confocal görüntüleme bağlayın.
- Başlık, membran 15 µL her şey 24 veya 48 iyi plaka altýna ekleyin. Odası slaytlar kullanıyorsanız, membran 9 µL her odası altýna ekleyin.
Not: gerekirse plaka boyutuna göre membran seviyesini ayarlamak. - Membran kuyunun üzerine ince bir tabaka oluşturur böylece membran pipet ucu hızla yayıldı. Kuluçka membran polimerize izin vermek 30 dk 37 ° C'de plaka yerleştirin.
Not: Kriptalarının membran ince bir tabaka değilse veya membran hava kabarcıkları içeriyorsa eklemek. - Bir shaker üzerinde 15 dk sonra doku 100 µm süzgeç aracılığıyla filtre. Aracılığıyla akış atmak.
- 30 mL hücre bozulma medya #2 yeni bir 50 mL konik tüp ekleyin. Süzgeç dokuyu ve tüp ekleyin.
- Tüp bir buz kovası ayarla ve yavaşça 15dk için en düşük hızda shaker üzerinde tahrik.
- Shaker üzerinde 15 dk sonra doku 100 µm süzgeç aracılığıyla filtre. Akış'sonraki adımlarında verim düşüktür Bu adımda tutun.
Not: Tüpler ile tüm akışı buz üstünde tutulmalıdır. - 15 mL DMEM 4,5 g/M glikoz ve L-glutamin ile yeni bir 50 mL konik tüp ekleyin. Süzgeç dokuyu ve tüp ekleyin. Şiddetle tüp el ile 10 s. filtre için 100 µm süzgeç aracılığıyla sallamak. ve akış toplamak. Akışı aracılığıyla hiçbir partiküller içeren kadar yineleyin.
- Mahallede aracılığıyla akış fare doku veya insan dokusu için 100 µm süzgeçler için 70 µm Süzgeçler kullanarak yeni 50 mL konik tüp içine önceki adımdaki filtre.
Not: ilave süzgeçler çagirabilirim ve süzgeçler ile enkaz zarar gibi yavaş yavaş dökün. - Tüp 4 ° C ve doğrudan yerinde bir buz kovası başlıklı 8 min için 200 x g de santrifüj kapasitesi. Süpernatant pipet tarafından Pelet bozmadan kaldırın. Pelet toplam istediğiniz miktarı, Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri ile resuspend.
Not: Zenginleştirilmiş kriptalarının Pelet 'kum' katmandır. Her 250 µL olan Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri de gerektirir.
- Yer çözündürüldükten membran özü ( Tablo malzemelerigörmek) başlamadan önce çözülme buzda.
- Enteroids kurulması
- Crypt medya karışımı membran üzerinde doğrudan plaka.
- Kriptalarının mikroskopla yalıtım işlemi başarılı oldu emin olmak için denetleyin.
Not: Hücreleri ve hücre topları istenen. Yaklaşık 100 bireysel kriptalarının iyi kaplama. - Plaka kriptalarının membran için bağlı kalmak izin vermek 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: Bu kuluçka Crypt kültür medya olmadan büyüme faktörleri ile değil. - Yavaş yavaş medya ve P-200 pipet kullanarak iliştirmek başarısız fazlalık kriptalarının kaldırın.
Not: ekteki kriptalarının yerinden olmak gibi membran rahatsız etmeyin. - Yavaş yavaş 250 µL olan Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri her şey için ekleyin.
Not: 24-için 48-şey plakaları veya odası slaytlar, 250 µL olan Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri yeterlidir. - Ortamı 2 günde 5 gün kala en uygun ek ve büyüme için izin vermek için Tedaviler için taze Crypt kültür medya ile büyüme faktörleri ile değiştirin.
2. fare meme süt toplama
- C57BL/6J emzikli Barajı onun pups sağım öncesinde 6 h için doğum sonrası 7-12 gün ayırmak.
- Burun konisi üzerinden isoflurane ile emzikli Barajı anestezi ve oksitosin 0.15 IU/kg vücut ağırlığı, subkutan enjeksiyon yönetmek. Sağım yordamı denemeden önce 3 dakika bekleyin.
- Emzikleri yordamı sağım öncesinde % 70 etanol ile temiz ve kurumaya bırakın.
- Süt emzikleri bir fare emzikleri 5 mL toplama tüp içine sığacak şekilde boyutlandırılmış silikon tüp ile bir elektrik insan göğüs pompası kullanarak bir defada ayıklayın.
Not: En iyi göğüs pompaları iki ayar, bir hız ve emme için var. Her birinin en düşük ayarlarla başlatın ve her ikisi de yavaş yavaş süt elde edilir kadar artırmak en iyisidir. İdeal olarak, toplam verim olacaktır ~ 500 µL - fare anne sütü emzikli dam başına 1 mL. - Hemen aliquot anne sütü ve mağaza-80 ° C'de
Not: önlemek donma/çözülme döngüsü. - 37 ° C'de 24 h için fare anne sütü mL Crypt kültür medya büyüme faktörleri ile başına 50 µL/mL 5 gün enteroids tedavi
3. bütün Enteroids boyama Mount
-
Reaktifler hazırlanması
- 16 mL 1 x PBS 8 kuyu başına hazırlayın.
- 2 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) 8 kuyu başına 1 x PBS hazırlayın.
- 2 mL % 0,1 hazırlamak 8 kuyu başına 1 x PBS Triton X-100.
- 24 mL hazırlamak PBS ara (PBST ise % 0.1 ara 20 içinde 1 x PBS) 8 kuyu başına.
- %0,1 2 mL % 10 normal eşek serum (NDS) hazırlamak PBST (% 10 NDS/PBST) 8 kuyu başına.
- 4 mL % 1'i hazırlayın NDS % 0,1 PBST (% 1 NDS/PBST) 8 kuyu başına.
-
1. gün boyama
- Tedaviler Aspire edin ve enteroids PBS ile yıkayın. 250 µL % 4 eklemek PFA ücret iyi. Rotator için 1-2 h 4 ° C'de yerleştirin %4 kaldırmak PFA pipet ile.
- Yıkama 250 µL/kuyu 1 ile 4 kez PBS x. Rotator (RT) oda sıcaklığında 10 dakika yerleştirin.
Not: Bu plaka gerekirse 1-2 gün 4 ° C'de depolamak mümkündür. - 250 µL/iyi 0,1 Ekle % Triton X-100. RT Kaldır, 1 h için kuluçkaya % 0,1 Triton X-100 pipet ile.
- Yıkama 250 µL/kuyu 1 ile 4 kez PBS x. Rotator RT. itibariyle 15 dakika yerleştirin
- 250 µL/iyi %10 eklemek NDS/PBST. RT Kaldır, 45 dk için kuluçkaya % 10 NDS/PBST pipet ile.
- 250 µL/iyi birincil antikor, seyreltilmiş 1 %1/250 NDS/PBST, eklemek ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
Not: Optimum antikor seyreltme üreticisine göre değişir.
-
2. gün boyama
- 4-5 h ile 250 µL/iyi PBST için en az 5 kez yıkayın. 4 ° C arasında her yıkama rotator yerleştirin.
- 250 µL/iyi ikincil antikor, seyreltilmiş 1 %1/1.000 NDS/PBST ekleyin. Plaka folyo sarın ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya
-
3. gün boyama
- 250 µL/iyi nükleer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15dk için leke ekleyin.
Not: plaka karanlıkta bırakın. - 6 kez 250 µL ile/iyi PBST yıkayın. Rotator her yıkama arasında 4 ° C'de 10 dakika yerleştirin.
- Mount coverslip odası üzerinde slayt ortam takma ile.
- 40 X objektif confocal mikroskop ile fotoğraf çekmek ve eşit bir raster grafik editörü render ( Tablo malzemelerigörmek).
- 250 µL/iyi nükleer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15dk için leke ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk insan anne sütü ifade olup olmadığını araştırmak aranan veya pastörize donör anne sütü küçük bağırsak enteroids üzerinde bir etkisi vardı. Nitekim, insan anne sütü ve donör anne sütü yenidoğan fare (şekil 1A) ve erken insan türetilmiş enteroids (şekil 1B) büyüme arttı.
Bu yana insan anne sütü küçük bağırsak enteroids büyüme arttı, anne sütü erken insan enteroids yayılması üzerinde etkisi olsaydı biz sonraki araştırdık. İnsan anne sütü erken insan enteroids denetimi (şekil 2A-B, Ki67, kırmızı boyama) göre yayılması arttığını göstermektedir. Önemlisi, insan donör anne sütü de denetim ama insan meme sigara pastörize süt (şekil 2B-C) daha biraz daha az bir ölçüde karşılaştırıldığında enteroid yayılması arttı. Biz sonraki erken insan enteroids Ki67 mRNA ifade değerlendirilir ve Ki67 anne sütü veya donör anne sütü denetime (2D rakam) göre tedavi enteroids artış olmuştur keşfetti.
Sonra bu etkiler anne sütü ile species-specific olup olmadığını görmek istedim. Başvurular11,12olduğu gibi değiştirilmiş bir ticari olarak mevcut insan meme pompası ile emzikli fareler anne sütü toplamak için bir yol geliştirdi. Tasvir bir imzalat emzikli Barajı süt toplama geçiren bu cihazı (şekil 3) kullanıyor. Deneyler sonraki dizi fare enteroids üzerinde gerçekleştirilmiş ve sütünü fare, insan veya donör anne sütü gelen nükleer silahların yayılmasına karşı etkileri değerlendirildi. Şekil 4' te gösterildiği gibi mouse, insan ve pastörize donör meme süt artan fare enteroids denetimi (şekil 4A-D) göre nükleer silahların yayılmasına karşı. Fare enteroids yayılması TLR4 ligand, denetim (şekil 4A, E) göre lipopolysaccharide (LPS), huzurunda azalma. Önemlisi, fare, insan veya donör meme süt tüm geri enteroid üretimi artan Ki67 boyama tarafından gösterildiği gibi LPS huzurunda LPS yalnız (şekil 4Fiçin-H) karşılaştırıldı.
Bizim deneylerden gösterdiğimiz küçük bağırsak enteroids yenidoğan fareler türetilen ve erken insan cenin bağırsak kültüründe korunabilir. Biz daha sonra çeşitli deneyler için kullanılabilir fareler anne sütü ayıklamak için etkili bir yöntem sağlar bir roman meme süt toplama yöntemi sağlar. Sütünü insanlar veya fareler artan boyutu, büyüme ve nükleer silahların yayılmasına karşı fare ve insan enteroids keşfetti. Ayrıca, fare, insan ve donör anne sütü enteroid yayılması LPS maruz kaldıktan sonra geri. Bu anne sütü bağırsağın fareler ve insanlar üzerinde anti-inflamatuar etkileri sarfetmek göstermektedir.
Şekil 1. Anne sütü ve donör anne sütü arttırmak boyutu ve büyüme, fare ve erken insan enteroids. Medya (kontrol), anne sütü veya 24 h boyutu çubuğu için donör anne sütü (50 µL/mL) ile tedavi küçük bağırsak enteroids yenidoğan fareler (p14) veya erken insan bağırsak photomicrographs: 1000 µm. burayı tıklayın bunları daha büyük bir sürümünü görüntülemek için şekil.
Şekil 2. Anne sütü ve donör anne sütü arttırmak erken insan enteroids çoğalması. (A)5 gün, insan anne sütü ve 24 saat için pastörize donör anne sütü ile tedavi ve nükleer silahların yayılmasına karşı marker Ki67 (kırmızı) lekeli ve DAPI (nükleer, mavi) için kültürlü erken insan enteroids Confocal filmler. Boyutu bar: 50 µm. (B) qRT-PCR Ki67 ifade temizlik gen RPLO göre insan enteroids. n = 5 grup başına. p < denetimine göre öğrenci t testi ile 0.0001 karşılaştırmalar. Ortalama ± standart sapma verilerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Koleksiyon değiştirilmiş insan göğüs pompası kullanarak bir imzalat fare sütten. Steril insan meme pompası boru üzerinde imzalat emzikli Barajı emzikleri oksitosin enjeksiyon aldıktan sonra yerleştirilir. Fare süt insan göğüs pompası orta hız ve güç kullanarak 5 mL toplama tüp içine toplanır. Toplu birimleri aralığından tüm emzikleri 500 µL fare başına 1 ml postnatal gün 7-12 ayıklanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Mouse, insan ve pastörize donör anne sütü arttırmak fare enteroid nükleer silahların yayılmasına karşı. (A-H) P14 küçük bağırsak fare enteroids (kontrol, A) confocal Filmler (MBM, B), fare anne sütü ile insan anne sütü (BM, C) veya insan donör anne sütü (DBM, D) 50 µL/mL ( yokluğunda 12 h için medyanın tedavi A-D) veya lipopolysaccharide (LPS) medya için 12 h, (E-H) 25 µg/mL bir doz, varlığı ve nükleer silahların yayılmasına karşı marker Ki67 (kırmızı) ve DAPI (nükleer, mavi) için lekeli. Boyutu bar: 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağırsak epitel konak savunma bağırsak bariyer bütünlüğünü korumak patojenlere karşı sorumluluğunuz vardır ve çeşitli hastalıkların patogenezinde çiğnenebilmektedir birçok hücresel türlerinden oluşur. Hayvan modelleri hastalık bazı yönleriyle özetlemek, fareler ve insanlar bağırsağın türetilmiş enteroids ex vivo modelinin çeşitli tedaviler etkilerini test etmek için bir platform sağlar. Enteroid modeli önemini araştırmacılar kültür ve bağırsak kök hücre saf ya da hastalıklı hayvanlar ve varolan yöntemleri ile mevcut değildir insanlar tüm epitel hücre alt türlerinden ayırt sağlar. Bu modeli sistem enfeksiyonları enterovirüslerin25 veya norovirus26 diğerleri arasında gibi fare içine kolayca çevrilebilir olmayabilir insan patojenler ile kullanılabilir. Enteroid modeli birkaç avantajları ve kullanımları vardır; Ancak, medya ve enteroids yaşam için gerekli olan belirli eksojen büyüme faktörleri yapmak için kullanılan reaktifler tutarlılık sağlamak için özen göstermelidir.
Enteroid modeli içinde enteroids üreten bir başarı sağlamak için kritik öneme sahip birkaç adım vardır. Soğuk iskemik süresini en aza indirmek için doku expediently işlenmesi. Doku 4 ° C'de Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) ortamda koyarsanız doku hasat edilir sonra 24 s kadar Enteroids üretilen Bu gerekirse nakliye veya nakliye seçeneği kolaylaştırabilir. Enteroids kurulması için membran her kuyunun eklemek ve büyümeye kriptalarının için ince, düz bir katmanda olması gerekir. Membran düz değil veya kabarcıkları varsa kriptalarının uymak başarısız olabilir medya değiştiğinde kaldırılabilir. Enteroids oluşturulduktan sonra onlar olabilir her 7 günde pasajlı ya da uzun süreli depolama için sıvı azot donmuş. Temizleme ve toplama Crypt kültür medya büyüme faktörleri ile ve her tedavi yönetim yavaş yavaş ve enteroids rahatsız edici önlemek için her şey kenarına yapmanız gerekir. Enteroids bozulma onları müstakil ve medya değiştiğinde akıp neden olabilir. En iyi sonuçlar için membran ve ekli enteroids bütünlüğünü korumak için özen gösterilmelidir.
Mevcut çalışmada yenidoğan fareler enteroids türetilen ve prematüre bebeklerin büyümesi ve anne sütü farklı türde huzurunda çoğalırlar rapor. Bu çalışmalar, erken bağırsak anne sütü etkileri bizim anlayışı ilerletmek. Fareler ve insanlar laboratuardan kültürlerde enteroid kurmak nasıl ayrıntılı bir yöntem sunar. Buna ek olarak, biz anne sütü değiştirilmiş elektrik insan meme pompası ile emzikli bir fareden toplama verimli bir yöntem göstermek. Biz o fare göstermek insan ve pastörize donör anne sütü büyüme ve enteroids fareler ve insanlar yayılması geliştirin. Buna ek olarak, biz ne zaman fare, insan veya donör anne sütü enteroids için verildi hangi restore edilerek TLR4 ligand LPS, huzurunda azalan enteroid nükleer silahların yayılmasına karşı gösteriyor. Gelecekteki uygulamalar ile yüksek işlem hacmi uyuşturucu bebeklerde bağırsak rezeksiyonundan sonra belirli ilaçları belirli bebek nasıl etkileyebileceğini görmek için elde edilen enteroids ekranlarda kişiselleştirilmiş hassas tıp içerebilir. Birlikte ele alındığında, umarız ultraviyole çocuk hastalıkları bağırsak, NEC, dahil olmak üzere birçok farklı krallıkları bu teknikleri kullanan potansiyel başarı bulacaksınız yeni tedavi stratejileri geliştirmek için acil bir klinik ihtiyaç olduğu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek hiçbir şey ve hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
MG hibe K08DK101608 ve R03DK111473 Ulusal Sağlık enstitüleri, Mart, Dimes Vakfı Hibe No 5-FY17-79, çocuk Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi ve Anabilim Dalı tarafından desteklenmektedir Pediatri Washington Üniversitesi School of tıp, St. Louis. CJL R01DK104946 tarafından desteklenmektedir (PI: Silverman), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
