Summary
Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de cultura de enteroid de rato neonatal ou intestino humano prematuro, bem como um método eficiente para coletar leite de ratos.
Abstract
Enteroids intestinais pequenos humanos derivam das criptas e quando cultivadas em um nicho de células-tronco contêm todos os tipos de células epiteliais. A capacidade de estabelecer sistemas de enteroid humana ex vivo cultura são importantes fisiopatologia intestinal modelo e estudar a resposta celular particular envolvido. Nos últimos anos, enteroids de camundongos e humanos estão sendo cultivadas, passadas e bancados afastado para uso futuro em vários laboratórios em todo o mundo. Esta plataforma de enteroid pode ser usada para testar os efeitos de vários tratamentos e drogas e os efeitos que são exercidos sobre diferentes tipos de células no intestino. Aqui, um protocolo para o estabelecimento principal células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids derivado de ratos Neonatais e intestino humano prematuro é fornecido. Além disso, este sistema de cultura de enteroid foi utilizado para testar os efeitos do leite materno espécie-específicos. O leite materno do mouse pode ser obtido com eficiência usando uma bomba de mama humano modificado e leite expressa do mouse pode ser usado para mais experiências de pesquisa. Podemos agora demonstrar os efeitos de mouse expressado, humano, e o leite materno doador sobre o crescimento e a proliferação de enteroids derivado de ratos neonatais ou prematuro intestino humano.
Introduction
Enterocolite necrosante (NEC) é a principal causa de morte por doença gastrintestinal em recém-nascidos prematuros, afetando quase 1 em cada 10 bebés nascidos antes de 29 semanas de gestação,1,2,3. Metade dos infantes com o progresso da NEC para a forma mais grave, onde a sobrevivência é apenas 10-30%4,5. Nos Estados Unidos, uma estimativa de USD 2 bilhões por ano são gastos para tratamento de lactentes com NEC6,7, no entanto, a taxa de sobrevivência, nem terapia tem mudado ao longo dos últimos 30 anos. A patogênese da NEC é caracterizada por lesões intestinais e deficientes auditivos da mucosa cura8,9,10,11, no entanto, as vias de sinalização levando a uma exacerbada resposta inflamatória e mecanismos para reverter a inflamação permanecem incompletamente compreendidos.
A administração de leite materno foi encontrada para ser a estratégia apenas proteção contra NEC para prematuros. Mostramos anteriormente que o leite materno protege contra o desenvolvimento da NEC através da inibição do receptor tipo toll receptor imune inata 4 (TLR4) no epitélio intestinal através do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) sinalização via11. Suplementação do leite materno para uma fórmula de NEC experimental atenuado a resposta inflamatória, vista no NEC, como demonstrado por inibição da apoptose enterócito e restauração do enterócito proliferação de uma forma que era dependente de crescimento epidérmico factor (EGF) e EGFR11. Em outro estudo, foi demonstrado que o nitrato, outro componente do leite materno, contribui para sua natureza protetora, modulando a perfusão intestinal, em comparação com a fórmula infantil, que é desprovido de nitrato e pode contribuir para o aumento da frequência do NEC em Fórmula alimentados infantes12,13. Outros compostos presentes no leite materno que foram mostrados para ser envolvido na proteção contra NEC incluem oligossacarídeos do leite humano, L-arginina, glutamina e lactoferrina14,15,16, 17,18,19. Estes elementos benéficos do leite materno revelam a necessidade de seu uso na prevenção da NEC, mas também salientam a importância de se estudar os mecanismos, sinalização de caminhos e efeitos celulares envolveram em como o leite materno é mediar a proteção contra NEC .
Em ordem para um estudo mais aprofundado as propriedades protetoras do leite materno em um modelo do rato da NEC, desenvolvemos uma técnica de novela, fácil de usar por que mouse leite materno pode ser extraído de uma barragem anestesiada usando um elétrico materno bomba11,12 . Esta estratégia de aquisição de leite materno de rato é vantajosa, não só porque as bombas de mama humano são prontamente disponível e eficiente na aquisição de leite materno, mas também porque este método permite análises de leite materno espécie-específicos. Como resultado, nós podemos comparar os efeitos do leite materno de rato com os do leite materno humano bem como pasteurizado o leite humano doador de um banco de leite em modelos espécie-específicos. Esta técnica permite o estudo dos componentes do leite materno em relação à sua contribuição para a prevenção da NEC. Outros investigadores têm desenvolvido métodos de extração de leite materno, no entanto, essas técnicas são manuais e geralmente exigem mais do que um laboratório membro20,21,22. Aqui apresenta-se uma técnica fácil que pode ser utilizada, modificando uma bombinha elétrica humana para coletar leite de um rato. Esta técnica também pode ser aplicada a outras espécies.
Para interrogar adequadamente as vias de sinalização envolvidas com NEC, sistemas modelo são necessários para avaliar todos os tipos de célula diferente, conhecidos por ser afetados no processo de doença. Aqui, vamos discutir um tal sistema de modelo - enteroids - e o seu estabelecimento de rato e o intestino delgado humano. Enteroids intestinais humanas (HIEs), em particular, fornecer promessa significativa, porque eles oferecem um inovador, geneticamente diversos ex vivo modelo humano para auxiliar no estudo de processos fisiopatológicos que ocorrem no trato gastrointestinal 23. Enteroids foram encontrados para ser cultivadas a longo prazo e pode ser congelados para posterior utilização23, e ao contrário de Organoids Intestinal humana (HIOs), cujas culturas são desenvolvidas a partir de células-tronco pluripotentes inducible, enteroids são gerados a partir de células-tronco dentro de criptas intestinais isoladas24. Enteroids exigem menos manutenção, pode ser infectado rapidamente25e pode ser facilmente estabelecido desde criptas intestinais são mais diferenciadas que HIOs23. Portanto, HIEs oferecem muitas vantagens sobre as técnicas existentes, porque eles podem ser desenvolvidos para exibem propriedades de composição e funcionais específicas da região o epitélio gastrointestinal humano23. O uso de enteroids é uma opção altamente eficaz quando precisar de um modelo humano do intestino, com aderência às limitações específicas da região e a facilidade de uso. Aqui vamos demonstrar a técnica de isolar e manutenção primária células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids de camundongos e humanos prematuros.
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Protocol
Todos os procedimentos de animais neste estudo foram aprovados pelo também da Universidade de Washington em St. Louis institucional Animal cuidados uso Comité (protocolo 20160187) ou cuidados animais institucionais da Universidade de Pittsburgh e Comissão de utilização (protocolo 14103918). Humano intestino fetal em menos de 24 semanas de gestação foi obtido em conformidade com as diretrizes de aquisição de tecido anatômico Universidade de Pittsburgh após aprovação do Conselho de revisão institucional (protocolo PRO14100537) da Universidade de Pittsburgh saúde ciências banco de tecidos através de um sistema de corretor honesto. Leite materno de identificados ou o leite materno pasteurizado doador foi obtido com uma dispensa de consentimento da Universidade de Pittsburgh Conselho de revisão institucional.
1. a cripta isolamento e estabelecimento de Enteroids de ratos Neonatal ou prematuro intestino humano
- Preparação de meios de comunicação
Nota: Mídia deve ser preparada no bairro no dia anterior o isolamento da cripta.- Prepare meios de cultura 1,11 L. Começar com 1 L médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina e adicionar 110 mL soro Fetal bovino (FBS) (10% de concentração final), 11 mL penicilina-estreptomicina (concentração final 1%) e 1,1 mL insulina estéril (final concentração 0,1%).
- Prepare a mistura de 500 mL de PBS-antibiótico. Começar com 500 mL 1 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS) com 10% FBS e adicionar 5 mL de gentamicina (concentração final 1%), 1 mL de anfotericina B (0,2% de concentração final) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%).
- Prepare 30 mL célula rompimento Media #1. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 600 µ l 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração final 10 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).
- Prepare 30 mL célula rompimento Media #2. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 300 µ l EDTA de 0,5 M (concentração final 5 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).
- Prepare meios de cultura de cripta 50ml sem fatores de crescimento. Medir a 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 e adicionar 10 mL FBS (20% de concentração final).
- Adicionar 500 µ l penicilina-estreptomicina (concentração final 1%), 500 µ l L-glutamina (concentração final 1%), 500 µ l 100 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final), gentamicina (concentração final 1%), 2,5 µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ácido sulfônico (HEPES) (concentração final 0,05 mM), 500 µ l 100 mM N-acetilcisteína (concentração final 1 mM), 500 µ l 100 x N-2 suplemento, 1 mL 50 x suplemento isento de soro (por exemplo, B-27) menos vitamina A e 500 µ l 1 mM 100 x Y-27632.
- Prepare meios de cultura de cripta de 1 mL com fatores de crescimento. Primeiro Prepare-se 1 mL da cripta meios de cultura sem fatores de crescimento. Adicionar 2,5 µ l 40 µ g/mL Wnt3a (concentração final de 100 ng/mL), 1 µ l 100 µ g/mL Noggin (concentração final de 100 ng/mL), 2 µ l 250 µ g/mL R-Spondin (concentração final 500 ng/mL) e 0,5 µ l 100 µ g/mL EGF (concentração final de 50 ng/mL).
- Isolamento da cripta
- Lugar solubilizado extrato de membrana basal (ver Tabela de materiais) no gelo para descongelar antes de começar.
Nota: Mantenha membrana basal em gelo ou irá polimerizar. - Em conformidade com o protocolo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização para os ratos maiores que 14 dias de idade, eutanásia em ratos com dois métodos de eutanásia com o segundo sendo um processo físico para velar a morte.
Nota: Para os ratos menos de 14 dias de idade, decapitação é o procedimento padrão, usando a tesoura. - Usando uma tesoura e pinça, faça uma incisão vertical para baixo da linha média do abdômen, através da pele e peritônio, para todo o comprimento do abdômen. Excisar o intestino do estômago ao ceco com tesoura e remover o mesentério com fórceps.
Nota: Duas semanas de idade masculinos e femininos C57BL/6J rato filhotes, cada pesagem g 5.5-7, foram utilizados para isolamento de cripta. Qualquer idade ou tamanho do mouse pode ser usado para a isolação de cripta. - Para preparar o intestino recém-colhidas para isolamento de cripta, posicione o intestino reto e corte o intestino longitudinalmente ao longo de toda a sua extensão com uma tesoura.
Nota: Mouse e intestino humano podem ser preparados da mesma forma. - Limpa fezes do intestino, agitando suavemente o intestino e para trás em um prato de Petri cheia de PBS-antibiótico mistura usando fórceps.
- Adicione 30 mL de célula rompimento Media #1 para um tubo cónico de 50 mL. Corte o intestino em pedaços de comprimento 0,5 cm diretamente no tubo. Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.
- Enquanto os tecidos são o agitador, obter placas de 24 ou 48-boas para crescer criptas se o enteroids está a ser usado para o isolamento de proteínas, DNA ou RNA. Slides de câmara de 8 poços uso crescer criptas se o enteroids está a ser usado para toda a montam imagem latente confocal.
- No capô, adicione 15 µ l de membrana basal para o fundo de cada poço da placa de 24 ou 48-bem. Se usando slides câmara, adicione 9 µ l da membrana basal à parte inferior de cada câmara.
Nota: Ajuste de volume da membrana basal de acordo com o tamanho da placa se necessário. - Espalhou-se rapidamente a membrana basal com a ponta da pipeta para que a membrana basal forma uma camada fina no fundo do poço. Coloque a placa a 37 ° C numa incubadora por 30 min permitir que a membrana basal polimerizar.
Nota: As criptas não irão anexar se membrana basal não é uma fina camada ou membrana basal contém bolhas de ar. - Depois de 15 min em uma coqueteleira, filtre o tecido através de um filtro de 100 µm. Descarte a fluir.
- Adicione 30 mL de célula rompimento Media #2 para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo.
- Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.
- Depois de 15 min no agitador, filtro tecido através de um filtro de 100 µm. Manter o fluxo através da este passo, no caso de rendimento é baixo em etapas posteriores.
Nota: Todo o fluxo através de tubos deve ser mantido no gelo. - Adicione 15 mL DMEM com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo. Agitar o tubo com a mão para 10 filtro s. através de um filtro de 100 µm e coletar o fluxo através de vigorosamente. Repita até que flua através de contém sem partículas.
- No capô, filtre o fluxo através da etapa anterior em um novo tubo cônico de 50 mL usando 70 µm de filtros para tecido de rato ou 100 µm filtros de tecido humano.
Nota: Têm filtros extras no modo de espera e despeje lentamente como filtros vão entupir com detritos. - Centrifugar o tubo a x 200 g por 8 min a 4 ° C e lugar diretamente em um balde de gelo no bairro. Remova o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet com total quantidade desejada de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.
Nota: As criptas enriquecidas são a camada 'areia' da pelota. Bem, cada um exige 250 µ l de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.
- Lugar solubilizado extrato de membrana basal (ver Tabela de materiais) no gelo para descongelar antes de começar.
- Estabelecimento de enteroids
- A mistura de mídia cripta directamente sobre a membrana basal da placa.
- Verifique criptas com um microscópio para garantir o processo de isolamento foi bem-sucedido.
Nota: As células e bolas de células são desejadas. Aproximadamente 100 criptas individuais são banhadas por bem. - Incube a placa a 37 ° C por 3 h permitir criptas de aderir a membrana basal.
Nota: Esta incubação é com cripta meios de cultura sem fatores de crescimento. - Remova lentamente a mídia e criptas em excesso que falharam ao conectar usando uma pipeta de P-200.
Nota: Não perturbe a membrana basal como criptas anexadas podem tornar-se desalojado. - Lentamente, adicione 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento para cada poço.
Nota: Para 24-, 48-bem placas, ou câmara desliza, 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento é suficiente. - Substitua os meios de comunicação a cada 2 dias com fresco cripta meios de cultura com fatores de crescimento durante 5 dias antes de tratamentos para permitir o crescimento e o acessório ideal.
2. Mouse recolha de leite materno
- Separe uma barragem de C57BL/6J lactante no pós-parto 7-12 dias seus filhotes para 6 h antes da ordenha.
- Anestesiar a barragem lactante com isoflurano através de um cone de nariz e administrar uma injeção subcutânea de ocitocina em 0,15 UI/kg de peso. Espere 3 minutos antes de tentar o procedimento de ordenha.
- Limpar os tetos com etanol a 70% antes do procedimento de ordenha e deixe secar.
- Extrai leite de tetinas, um de cada vez usando uma bomba de mama humano elétrico com tubo de silicone de tamanho para caber as tetinas de rato em um tubo de coleta de 5 mL.
Nota: As bombas de mama ideal tem duas configurações, um para a velocidade e outro para a sucção. É melhor começar com o menor configurações de cada um e aumentar ambos lentamente até leite é extraído. Idealmente, o rendimento total será ~ 500 µ l - 1 mL de leite materno de rato por barragem lactante. - O leite materno imediatamente alíquota e loja a-80 ° C.
Nota: Evite congelar/descongelar ciclos. - Tratar enteroids no dia 5 com 50 µ l/mL de leite materno de rato por mL de meio de cultura de cripta com fatores de crescimento por 24 h a 37 ° C.
3. toda montagem coloração de Enteroids
-
Preparação dos reagentes
- Prepare-se 16 mL 1X PBS por 8 poços.
- Prepare o paraformaldeído 4% de 2 mL (PFA) em 1X PBS por 8 poços.
- Prepare-se 2 mL 0,1% Triton X-100 em PBS 1x por 8 poços.
- Preparar 24 mL PBS Tween (PBST é 0.1% Tween 20 em 1X PBS) por 8 poços.
- Preparar o soro de burro normal de 10% 2 mL (NDS) em 0,1% PBST (10% NDS/PBST) por 8 poços.
- Preparar 4 mL 1% NDS em 0,1% PBST (1% NDS/PBST) por 8 poços.
-
Dia 1 de coloração
- Aspire o tratamentos e lavar enteroids com PBS. Adicionar 250 µ l 4% PFA por bem. Coloque no rotator para 1-2 h a 4 ° C. Remover 4% PFA com pipeta.
- Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotator durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
Nota: É possível armazenar a placa por 1-2 dias a 4 ° C, se necessário. - Adicionar 250 µ l/poço 0.1% Triton X-100. Incubar durante 1 h em RT. Remove 0,1% Triton X-100 com pipeta.
- Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotador por 15 min no RT
- Adicionar 250 µ l/poço 10% NDS/PBST. Incubar durante 45 min no RT. Remove 10% NDS/PBST com pipeta.
- Adicionar 250 µ l/poço primário anticorpo, 1/250 diluídos em 1% NDS/PBST e incubar durante a noite a 4 ° C.
Nota: A diluição de anticorpo ideal varia de acordo com o fabricante.
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Dia 2 de coloração
- Lave pelo menos 5 vezes para 4-5 h com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator a 4 ° C entre cada lavagem.
- Adicione 250 µ l/poço secundário anticorpo, diluído 1/1.000 em 1% NDS/PBST. Embrulhe o prato em folha e incubar durante a noite a 4 ° C.
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Dia 3 de coloração
- Adicione 250 µ l/poço nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 15 min.
Nota: Manter a placa no escuro. - Lavar 6 vezes com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator durante 10 minutos a 4 ° C entre cada lavagem.
- Monte lamela na câmara deslize com meios de montagem.
- Captar imagens com um microscópio confocal objetivo de 40x e igualmente processar em um editor de gráficos raster (ver Tabela de materiais).
- Adicione 250 µ l/poço nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 15 min.
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Representative Results
Primeiro procuramos investigar se expressou o leite materno ou leite pasteurizado doador teve um efeito na pequena enteroids intestinal. Na verdade, leite materno e leite materno de doadores aumentaram o crescimento de prematuro humana derivada enteroids (figura 1B) e rato neonatal (figura 1A).
Desde que o leite materno humano aumentou o crescimento de pequenas enteroids intestinal, investigamos em seguida se o leite materno teve um efeito sobre a proliferação de enteroids humana prematura. Demonstramos que o leite materno aumenta a proliferação de enteroids humana prematura em relação ao controle (Figura 2A–B, Ki67, de coloração vermelha). Importante, o leite materno humano doador também aumentou a proliferação de enteroid comparada ao controle, mas para um grau ligeiramente menor do que o leite materno não-pasteurizadas (Figura 2B–C). Em seguida, nós avaliada a expressão de RNAm de Ki67 no enteroids humano prematuro e descobriu que Ki67 foi aumentada na enteroids tratados com leite materno ou leite materno de doadores em relação ao controle (Figura 2D).
Em seguida queríamos ver se estes efeitos foram espécie-específicos com relação ao leite materno. Desenvolvemos uma maneira de coletar leite de ratos lactantes, usando uma bomba de mama humano disponível comercialmente modificados como referências11,12. Retratado é uma barragem de lactante anestesiada, passando a coleta de leite usando este dispositivo (Figura 3). A próxima série de experimentos foi realizada na enteroids de rato e avaliamos os efeitos da proliferação de leite materno de rato, humano ou doador de leite materno. Como mostrado na Figura 4, rato, humano, e proliferação aumentada no enteroids do mouse em relação ao controle (Figura 4A–D) de leite materno pasteurizado doador. Proliferação em enteroids o rato foi diminuída na presença do ligante TLR4, lipopolissacarídeo (LPS), comparado ao controle (Figura 4A, E). Importante, rato, humano ou doador mama leite todo restaurado enteroid proliferação na presença de LPS, como demonstrado pelo aumento de coloração Ki67 comparado com LPS sozinho (Figura 4F–H).
De nossas experiências, mostramos que enteroids intestinal pequena derivada de ratos Neonatais e prematuro intestino fetal humano pode ser mantido em cultura. Além disso, nós fornecemos um método de coleta de leite materno romance que fornece uma maneira eficiente para extrair o leite materno de ratos, que podem ser usados para várias experiências. Descobrimos que o leite materno de humanos ou ratos aumentou o tamanho, crescimento e proliferação no mouse e enteroids humana. Além disso, o mouse, humanos e doadora de leite materno restaurado a proliferação de enteroid após a exposição de LPS. Isto sugere que o leite materno pode exercer efeitos anti-inflamatórios no intestino delgado dos ratos e seres humanos.
Figura 1. O leite materno e o leite materno doador aumentam o tamanho e o crescimento de rato e enteroids humana prematura. Fotomicrografias de pequenas enteroids intestinal de ratos neonatais (p14) ou intestino humano prematuro tratadocom com mídia (controle), o leite materno ou leite de doador (50 µ l/mL) para a barra de tamanho de 24 h.: 1.000 µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior deste Figura.
Figura 2. O leite materno e o leite materno doador aumentam a proliferação de enteroids humana prematura. (A) Confocal micrografias de prematuro enteroids humano cultivados por 5 dias, tratados com leite materno e o leite materno pasteurizado doador para 24h e manchada para o marcador de proliferação Ki67 (vermelho) e DAPI (nuclear, azul). Barra de tamanho: 50 µm. (B) qRT-PCR para Ki67 expressão de enteroids humana em relação ao gene da limpeza RPLO. n = 5 por grupo. p < 0,0001 comparações com o teste t de Student em relação ao controle. Dados são média ± desvio-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Coleção de leite de um mouse anestesiado utilizando uma bomba de mama humano modificado. Tubulação de bomba de mama humano estéril colocado no tetinas da barragem lactante anestesiada depois de receber injeção de oxitocina. Leite de rato é coletada usando a bomba de mama humano na velocidade média e potência em um tubo de coleta de 5 mL. Coletivos volumes extraídos todos variam de tetinas de 500 µ l a 1 mL por rato em dias pós-natal 7-12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Mouse, humano, e leite pasteurizado doador aumentar a proliferação de rato enteroid. (A H) Confocal micrografias de p14 pequeno rato intestinal enteroids (controle, A) tratadocom com leite materno de rato (MBM, B), leite materno (BM, C), ou leite materno de doador humano (DBM, D) em 50 µ l/mL de mídia por 12h na ausência ( A-D) ou presença de lipopolissacarídeo (LPS) na dose de 25 µ g/mL de mídia por 12h, (E-H) e manchados para o DAPI (nuclear, azul) e o marcador de proliferação Ki67 (vermelho). Barra de tamanho: 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O epitélio intestinal é composto de muitos subtipos celulares que são responsáveis por fornecer a defesa do hospedeiro contra patógenos, mantendo a integridade de barreira do intestino e podem ser rompidos na patogênese de diversas doenças. Enquanto modelos animais podem recapitular algumas facetas da doença, o modelo ex vivo de enteroids derivado do intestino de ratos e humanos fornece uma plataforma para testar os efeitos de vários tratamentos. A importância do modelo de enteroid permite que os pesquisadores de cultura e diferenciar as células-tronco intestinais em todos os subtipos celulares epiteliais de ingênuo ou animais doentes e os seres humanos que não estão disponíveis com os métodos existentes. Este sistema de modelo pode ser usado para infecções com agentes patogénicos humanos que não podem ser facilmente traduzíveis para o rato, como enterovírus25 ou norovírus26 entre outros. O modelo enteroid tem várias vantagens e usos; no entanto, deve-se ter cuidado para garantir a consistência nos reagentes que são usados para fazer a mídia e os fatores de crescimento exógenos específicos que são necessários para a sobrevivência da enteroids.
Dentro do modelo de enteroid, várias etapas são de fundamental importância para garantir o sucesso na produção de enteroids. Para minimizar o tempo de isquemia frio, tecido deve ser processado de forma expedita. Enteroids pode ser produzido até 24 h após o tecido é colhido, se o tecido é colocado no meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a 4 ° C. Isto pode facilitar a opção de frete ou transporte se necessário. Para o estabelecimento de enteroids, a membrana basal deve ser uma camada fina, plana na parte inferior de cada poço para as criptas anexar e crescer. Se a membrana basal não é plana ou tem bolhas presentes, criptas podem falhar aderir e será removido quando a mídia é alterada. Depois que os enteroids são estabelecidos, podem ser passadas a cada 7 dias ou congelados em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Remoção e adição de meios de cultura de cripta com fatores de crescimento e a administração de cada tratamento devem ser feitos lentamente e à borda de cada poço a evitar perturbar a enteroids. Interrupção da enteroids pode causar-lhes para se tornar independente e lavados quando a mídia é alterada. Para os melhores resultados, deve ter-se cuidado para preservar a integridade da membrana basal e o enteroids anexado.
No estudo atual, nós relatamos que enteroids derivado de ratos Neonatais e prematuros podem crescer e se proliferam na presença de diferentes tipos de leite materno. Estes estudos avançam nossa compreensão dos efeitos do leite materno sobre o intestino prematuro. Nós fornecemos um método detalhado sobre como estabelecer enteroid culturas em laboratório de seres humanos e ratos. Além disso, vamos demonstrar um método eficiente de coleta de leite materno de um rato lactante usando uma bomba de mama humano elétrico modificado. Mostramos esse rato, o leite materno de humanos e pasteurizado doador reforçar o crescimento e proliferação de enteroids de ratos e humanos. Além disso, mostramos enteroid diminuição da proliferação na presença do ligante de TLR4 LPS, que foi restaurado quando o mouse, humanos ou doador de leite materno foi administrado para o enteroids. As aplicações futuras podem incluir medicamento personalizado precisão com telas de drogas alto throughput em enteroids obtidos de lactentes após a ressecção intestinal, para ver como certos medicamentos podem afetar a criança especial. Tomados em conjunto, esperamos que outros laboratórios encontre sucesso potencial na utilização destas técnicas em muitos reinos diferentes pediátrica doenças do intestino, incluindo NEC, onde existe uma necessidade clínica urgente de desenvolver novas estratégias terapêuticas.
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Disclosures
Os autores têm nada para divulgar e sem conflitos de interesse.
Acknowledgments
MG é apoiada por subsídios, K08DK101608 e R03DK111473 do Hospital o National Institutes of Health, março de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, das crianças Discovery Institute de Washington University e St. Louis infantil e departamento de Pediatria Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL é suportado pelo R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital Discovery Institute de Washington University infantil e St. Louis infantil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
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