Summary
이 프로토콜에서는 쥐에서 우유를 수집 하는 효율적인 방법 뿐만 아니라 신생아 마우스 또는 조 인간의 창 자에서 enteroid 문화 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
인간의 작은 창 자 enteroids는 지하실에서 파생 되 고 줄기 세포 틈새 시장에서 성장 하는 때 모든 상피 세포 유형을 포함. 인간의 enteroid ex vivo 문화 시스템을 설정 하는 기능 모델 장 이상 하 고 특정 세포 응답 관련된 공부에 중요 하다. 최근 몇 년 동안, 쥐와 인간 enteroids 되 고 교양, passaged, 그리고 은행 떨어져 여러 실험실에서 나중에 사용에 대 한 전 세계에 걸쳐. 이 enteroid 플랫폼은 다양 한 치료와 약물의 효과 및 어떤 효과 소장에 다른 세포 유형에가 해지는 테스트를 사용할 수 있습니다. 여기, 신생아 쥐에서 파생 된 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids를 설정 하기 위한 프로토콜 이며 조 인간의 내장 제공 됩니다. 또한,이 enteroid 문화 시스템 종의 유 방 우유의 효과 테스트에 이용 되었다. 마우스 모유 수정된 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 효율적으로 얻을 수 있다 고 표현된 마우스 우유 추가 연구 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 우리 이제 표현된 마우스, 인간의 효과 입증 하 고 성장 및 enteroids의 확산에 기증자 모유 신생아 쥐 또는 조 인간의 작은 창 자에서 파생 된.
Introduction
Necrotizing enterocolitis (NEC)에 영향을 미치는 거의 1/10 유아 29 주 태동1,2,3전에 태어난 조산에 위장 질환에서 죽음의 주요 원인입니다. 생존은 단지 10-304,5가장 심각한 형태를 NEC 진행과 유아의 반은. 미국에는 약된 2-3 십억 달러/년 소비 하는 NEC6,7, 유아 치료 아직 생존 율도 치료는 지난 30 년 동안 변경 되었습니다. 그러나 NEC의 병 장 부상으로 특징은 점 막 치유8,,910,11,, 신호 경로 악화를 선도 염증 반응 및 메커니즘 염증을 불완전 하 게 이해 남아 있습니다.
인간의 모유의 조산에 대 한 NEC에 대 한 유일한 보호 전략 발견 되었습니다. 우리는 이전 유 방 우유는 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) 신호 통로11를 통해 장 상피에 타고 난 면역 수용 체 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4)의 억제를 통해 NEC 개발에 대 한 보호 나타났습니다. 실험 NEC 수식 모유의 보충 감쇠 NEC enterocyte apoptosis의 억제 및 복원 enterocyte 확산 했다 표 피 성장에 의존 하는 방식으로 여로 염증 반응 인자 (EGF) 고 EGFR11. 또 다른 연구에서는 그것은 표시 했다 질 산, 모유의 다른 구성 요소, 분유, 질산염 부족 하 고 NEC에의 증가 주파수에 기여할 수에 비해 장 관류를 변조 하 여 자연 보호에 기여 수식 먹이 유아12,13. 선관위에 대 한 보호에서 포함 되기 위하여 보였다 다른 화합물 모유에 존재 인간의 우유 oligosaccharides, 등 L-아르기닌, 글루타민, lactoferrin14,,1516, 17,,1819. 유 방 우유의 이러한 유익한 요소 NEC의 예방에 있는 그것의 사용의 필요성을 공개 하지만 또한 신호 경로, 및 세포 효과 모유는 선관위에 대 한 보호를 중재 하는 방법에 관련 된 메커니즘의 중요성을 강조 .
진학 하기 위해서는, NEC의 마우스 모델에서 모유의 보호 속성 우리 소설, 사용 하기 쉬운 기술을 개발 모유는 전기 인간 유 방 펌프11,12 사용 하 여 마 취 댐에서 추출 수 있는 마우스에 의해 . 마우스 모유 인수의이 전략이 아니다 유리한, 인간 유 방 펌프 쉽게 사용할 수 있으며 유 방 우유의 조달에 효율적인 뿐만 아니라 종의 유 방 우유 분석을 위해이 방법을 수 있기 때문에 때문에. 결과적으로, 우리 그 표현된 인간의 모유 마우스 유 방 우유의 효과 비교할 수 있습니다 뿐만 아니라 종의 모델에서 우유 은행에서 인간 기증자 우유를 저온 살 균. 이 기술은 NEC 예방으로 그들의 공헌에 관하여 유 방 우유 구성의 연구에 대 한 수 있습니다. 그러나 다른 조사 유 방 우유 추출 방법 개발,, 이러한 기술은 수동는 일반적으로 하나 이상의 연구소 회원20,,2122필요. 여기는 마우스에서 우유를 수집 하는 인간의 전기 유 방 펌프를 수정 하 여 활용할 수 있는 쉬운 기술 제공 됩니다. 이 기술은 또한 다른 종에 적용할 수 있습니다.
가 적절 하 게 신호 경로 NEC와 관련된, 모델 시스템의 질병 과정에 영향을 받을 것으로 알려져 다른 세포 유형 모두 평가 필요 합니다. 여기, 우리가 같은 모델 시스템-enteroids-및 마우스 및 인간의 소장에서 그들의 설립 하나 설명합니다. 인간의 장 enteroids (HIEs)는 혁신, 유전으로 다양 한 비보 전 인간의 모델 위장에서 자리를 차지할 pathophysiological 프로세스의 연구에 도움을 제안 하기 때문에 특히 중요 한 약속를 제공합니다 23. Enteroids 장기 배양 될 발견 되었습니다 나중 사용23, 얼 수 있다 그리고 누구의 문화는 유도할 수 있는 만능 줄기 세포에서 개발 하 고, 인간의 장 Organoids (HIOs), 달리 enteroids 줄기 세포에서 생성 되 고립된 장 지하실24내. Enteroids 유지 일 수 있다25, 신속 하 게 감염 하 고 이후 장 지하실 HIOs23보다 더 분화 된다 쉽게 설정할 수 있습니다. 따라서, HIEs 인간의 위장 상피23의 지역별 구성 및 기능적 속성을 전시 하기 위하여 개발 될 수 있기 때문에 기존 기술을 통해 많은 이점을 제공 합니다. Enteroids 사용 하 여 지역별 제한 및 사용의 용이성에 대 한 준수와 내장의 인간의 모델 필요 때 매우 효과적인 선택입니다. 여기 분리 하 고 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids 생쥐와 인간의 조산에서 유지 하는 기술을 보여 줍니다.
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Protocol
이 연구에서 모든 동물 절차는 세인트 루이스 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (20160187 프로토콜) 또는 피츠버그 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (14103918 프로토콜)에 워싱턴 대학에 의해 승인 되었다. 24 주 미만의 임신에서 인간의 태아 소장 기관 검토 위원회 승인 (PRO14100537 프로토콜)의 대학에서 후 피츠버그 대학 해 부 조직 조달 지침에 따라 얻은 피츠버그는 정직한 브로커 시스템을 통해 건강 과학 조직 은행. 취소 확인 된 인간 유 방 우유 나 저온 살 균된 기증자 모유 피츠버그 기관 검토 위원회의 대학에서 동의의 포기와 함께 얻은 것입니다.
1. 토 굴 고립과 신생아 쥐 또는 조 인간의 소장에서 Enteroids의 설립
- 미디어 준비
참고: 미디어 준비 되어야 한다 후드에 하루 토 굴 격리 전에.- 1.11 L 문화 미디어를 준비 합니다. 포도 당 4.5 g/L와 L-글루타민 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 1 L로 시작 하 고 110 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) (최종 농도 10%), 11 mL 페니실린-스 (최종 농도 1%), 그리고 1.1 mL 살 균 인슐린 (최종 추가 농도 0.1%)입니다.
- 500 mL PBS 항생제 혼합을 준비 합니다. 500 mL 1 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) x 10% 시작 FBS 5 mL Gentamicin (최종 농도 1%), 1 mL 암포 B (최종 농도 0.2%), 추가 5 ml 페니실린-스 (최종 농도 1%).
- 30 mL 셀 중단 미디어 # 1을 준비 합니다. 먼저 30 mL 문화 미디어 준비. 600 µ L 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 추가 (최종 농도 10 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 및 60 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%).
- 30 mL 셀 중단 미디어 # 2를 준비 합니다. 먼저 30 mL 문화 미디어 준비. 300 µ L 0.5 M EDTA를 추가 (최종 농도 5 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 및 60 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%).
- 성장 인자 없이 50 mL 토 굴 문화 미디어를 준비 합니다. 33.4 mL 1 측정 x 고급 DMEM/F-12 10 mL FBS (최종 농도 20%)를 추가 하 고.
- 500 µ L 추가 페니실린-스 (최종 농도 1%), 500 µ L L-글루타민 (최종 농도 1%), 500 µ L Gentamicin (최종 농도 1%), 100 µ L 암포 B (최종 농도 0.2%), 2.5 µ L 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane 술 폰 산 (HEPES) (최종 농도 0.05 m m), 500 µ L 100 mM N Acetylcysteine (최종 농도 1 m m), 500 µ L 100 N-2 보충, 비타민 A, 마이너스 혈 청 무료 보충 (예를 들어, B-27) x 1 mL 50 및 500 µ 1 m 100 m L x Y-27632 x.
- 성장 요인 1 mL 토 굴 문화 미디어를 준비 합니다. 첫째 1 mL의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 요소를 준비 합니다. 2.5 µ L 40 µ g/mL Wnt3a 추가 (최종 농도가 100 ng/mL), 1 µ L 100 µ g/mL 머리 (최종 농도가 100 ng/mL), 2 µ L 250 µ g/mL R-Spondin (최종 농도 500 ng/mL), 및 0.5 µ L 100 µ g/mL EGF (최종 농도 50 ng/mL).
- 토 굴 절연
- 장소 solubilized 지하실 막 추출 물 ( 재료의 표참조) 시작 하기 전에 해 동 얼음에.
참고: 얼음에 계속 지하실 멤브레인 유해 것입니다. - 쥐 나이의 14 일 보다 큰에 대 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜, 준수와 안락사의 두 가지 방법으로 마우스를 안락사 되 고 죽음을 보장 하기 위해 실제 절차.
참고: 마우스에 대 한 나이의 14 일 아래 잘린은가 위를 사용 하 여 표준 절차. - 가 위와 집게를 이용, 피부 및 복 막, 복 부의 전체 길이 통해 복 부의 정중 선 아래로 수직 절 개 만들. 가 위 맹 하 위장에서 소장을 소비 세 고 집게로는 mesentery를 제거 합니다.
참고: 2 주 된 남성과 여성의 C57BL/6J 마우스 새끼, 각 무게 5.5-7 g, 토 굴 격리 사용 되었다. 토 굴 격리에 대 한 어떤 나이 또는 크기 마우스를 사용할 수 있습니다. - 갓 수확된 소장 토 굴 격리를 준비 하려면 소장 똑바로 놓고 잘라가 위를 사용 하 여 그것의 전체 길이 따라 경도 소장.
참고: 마우스 및 인간의 장 수 준비 마찬가지로. - 부드럽게 앞뒤로 집게를 사용 하 여 PBS 항생제 혼합 가득 페 트리 접시에 소장을 떨고 하 여 소장에서의 하의 깨끗 한 자
- 50 mL 원뿔 튜브에 세포 장애 미디어 # 1의 30 mL를 추가 합니다. 소장을 튜브에 직접 0.5 c m 길이 조각을 잘라. 튜브는 얼음 양동이에 설정 하 고 부드럽게 15 분에 대 한 최저 속도로 통에 선동.
- 조직 뿌리에 있는 동안, 24 또는 48 잘 플레이트는 enteroids RNA, DNA, 또는 단백질 격리에 사용 되는 경우 지하실을 성장 하는 것을 얻을. 사용 8 잘 챔버 슬라이드 전체에 사용 되는 enteroids 있다면 지하실을 성장 하는 confocal 영상을 탑재 합니다.
- 후드, 24 또는 48 잘 플레이트의 각의 밑에 지하실 막의 15 µ L를 추가 합니다. 챔버 슬라이드를 사용 하 여 각 챔버의 바닥에 지하실 막의 9 µ L를 추가 합니다.
참고: 필요한 경우 접시의 크기에 따라 지하실 막의 볼륨을 조정 합니다. - 우물의 바닥에 얇은 층을 형성 하는 지하실 멤브레인을 피 펫 팁 지하실 막을 빠르게 확산. 유해를 지하실 멤브레인 수 있도록 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 놓습니다.
참고:는 지하실 지하실 멤브레인은 얇은 층 또는 지하실 멤브레인 기포를 포함 하는 경우 첨부 하지 않습니다. - 후 통에 15 분, 100 µ m 스 트레이너를 통해 조직을 필터링 합니다. 삭제를 통해 흐름.
- 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 30 mL 셀 중단 미디어 # 2를 추가 합니다. 스 트레이너에서 조직을 제거 하 고 관에 추가 합니다.
- 튜브는 얼음 양동이에 설정 하 고 부드럽게 15 분에 대 한 최저 속도로 통에 선동.
- 통에 15 분 후 조직 100 µ m 스 트레이너를 통해 필터링. 수율은 나중 단계에서 낮은 경우에이 단계에서를 통해 흐름을 유지.
참고: 튜브를 통해 모든 흐름은 얼음에 유지 되어야 한다. - 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 15 mL DMEM 포도 당 4.5 g/L와 L-글루타민을 추가 합니다. 스 트레이너에서 조직을 제거 하 고 관에 추가 합니다. 적극적으로 100 µ m 스 트레이너를 통해 10 s. 필터에 대 한 손으로 튜브를 흔들을 통해 수집 합니다. 통해 아무 입자 포함 될 때까지 반복 합니다.
- 후드, 70 µ m 멤브레인을 사용 하 여 마우스 조직 또는 인간의 조직에 대 한 100 µ m 멤브레인에 대 한 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 이전 단계에서 통해 흐름 필터링.
참고: 대기, 여분의 멤브레인 있고 멤브레인 파편으로 방해할 것으로 천천히 붓는 다. - 4 ° C와 후드에 얼음 양동이에 직접 장소에서 8 분 200 x g에서 튜브 원심 펠 릿을 방해 하지 않고 피 펫으로는 상쾌한을 제거 합니다. 총 원하는 금액의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 인자와 펠 릿 resuspend
참고: 농축된 지하실은 펠 릿의 '모래' 레이어. 각 잘 250 µ L의 토 굴 문화 미디어 없이 성장 인자를 요구 한다.
- 장소 solubilized 지하실 막 추출 물 ( 재료의 표참조) 시작 하기 전에 해 동 얼음에.
- Enteroids의 설립
- 지하실 멤브레인에 직접 토 굴 미디어 혼합 플레이트
- 격리 프로세스 성공적이 되도록 현미경으로 지하실을 확인 합니다.
참고: 셀과 셀의 공을 원하는 됩니다. 약 100 개인 지하실 잘 당 도금 된다. - 지하실 지하실 멤브레인에 있도록 3 h 37 ° C에서 접시를 품 어.
참고:이 부 화와 토 굴 문화 미디어 없이 성장 요인입니다. - 천천히 제거 미디어 초과 지하실 P-200 피 펫을 사용 하 여 연결 하지 못했습니다.
참고: 연결 된 지하실 제거 될 수 있다로 지하실 막을 방해 하지 마십시오. - 천천히 각 우물에 250 µ L의 토 굴 문화 미디어와 성장 인자를 추가 합니다.
참고: 24-48-잘 접시, 또는 챔버 슬라이드, 250 µ L의 토 굴 문화 미디어와 함께 성장 요인 충분 하다. - 대체 미디어 2 일 마다와 신선한 토 굴 문화 미디어와 함께 성장 요인 5 일전 최적의 부착과 성장을 허용 하기 위해 치료에 대 한.
2. 마우스 유 방 우유 컬렉션
- 그 새끼 짤 전에 6 h에서 산 후 7-12 일 C57BL/6J 양모 댐을 구분 합니다.
- Anesthetize 코 콘 통해 isoflurane와 양모 댐 하 고 0.15 IU/kg 몸 무게에서 oxytocin의 피하 주사를 관리. 절차를 짜기 전에 3 분을 기다립니다.
- 절차를 짜기 전에 70% 에탄올과 꼭지를 깨끗 하 고 건조 하 게.
- 실리콘 튜브 마우스 꼭지 5 mL 컬렉션 튜브에 맞게 크기와 전기 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 한 번에 한 꼭지에서 우유를 추출 합니다.
참고: 최적의 유 방 펌프는 두 개의 설정 속도, 하나 흡입 있습니다. 그것은 각각의 낮은 설정으로 시작 하 고 둘 다 우유 추출 될 때까지 천천히 증가입니다. 이상적으로, 총 수익률 됩니다 ~ 500 µ L-마우스 모유 수 댐 당 1 mL. - 즉시 aliquot 모유와-80 ° c.에 게
참고: 동결/동결 해제 방지 주기. - 37 ° c.에 24 h에 대 한 성장 인자와 토 굴 문화 미디어의 mL 당 마우스 유 방 우유의 50 µ L/mL와 5 일에 enteroids를 취급
3. 전체 Enteroids의 Staining 탑재
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시 약의 준비
- 8 우물 당 16 mL 1 x PBS를 준비 합니다.
- 8 우물 당 1 x PBS에 2 mL 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다.
- 준비 2 mL 0.1 %8 우물 당 1 x PBS에 트라이 톤 X-100.
- 준비 24 mL PBS 트윈 (PBST은 0.1% Tween 20 1 x PBS) 8 웰 스 당.
- 준비 2 mL 0.1%에 10% 정상 당나귀 세럼 (NDS) PBST (10 %NDS / PBST) 8 웰 스 당.
- 준비 4 mL 1% 0.1%에서 NDS PBST (1 %NDS / PBST) 8 웰 스 당.
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주 1 얼룩
- 치료에서 aspirate와 enteroids PBS로 세척. 추가 250 µ L 4 %PFA 잘 당. 1-2 h 4 ° c.에 대 한 회전에 4% 제거 PFA와 피 펫.
- 250 µ L/잘 1과 4 번 세척 PBS x. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 회전에 놓습니다.
참고: 필요한 경우 4 ° C에서 1-2 일에 대 한 접시를 저장 가능 하다. - 추가 250 µ L/잘 0.1% 트라이 톤 X-100. 1 h 실시간 제거에 대 한 품 어 0.1% 피 펫과 트라이 톤 X-100.
- 250 µ L/잘 1과 4 번 세척 PBS x. 실시간에서 15 분 동안 회전에
- 250 µ L/잘 10% 추가 NDS/PBST. 실시간 제거에서 45 분 동안 품 어 10 %NDS / PBST 피 펫과.
- 250 µ L/잘 1 차적인 항 체, 희석된 1/250에서 1 %NDS / PBST을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
참고: 최적의 항 체 희석 제조업체에 따라 다릅니다.
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얼룩이 Day 2
- 4-5 h 250 µ L/잘 PBST에 대 한 5 번 이상 씻는 다. 각 씻어 사이의 4 ° C에서 회전자에 놓습니다.
- 250 µ L/잘 이차 항 체, 희석된 1/1000에서 1 %NDS / PBST을 추가 합니다. 호 일에 접시를 포장 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
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3 일을 착 색
- 250 µ L/음 핵 얼룩 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 분 추가 합니다.
참고: 어둠 속에서 접시를 유지. - 250 µ L/잘 PBST 6 번 씻어. 각 씻어 사이의 4 ° C에서 10 분 동안 회전에 놓습니다.
- 챔버에 마운트 coverslip 설치 미디어와 슬라이드.
- 객관적인 confocal 현미경 40x와 이미지와 래스터 그래픽 편집기에서 동일 하 게 렌더링 ( 재료의 표참조).
- 250 µ L/음 핵 얼룩 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 분 추가 합니다.
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Representative Results
우리는 먼저 인간의 모유를 표현 하는 여부를 조사 하고자 또는 저온 살 균된 기증자 모유 작은 장 enteroids에 영향을 했다. 실제로, 인간 유 방 우유와 모유 기증자 신생아 마우스 (그림 1A)와 조 인간의 파생된 enteroids (그림 1B)의 성장을 증가 했다.
인간의 모유 증가 작은 창 자 enteroids의 성장, 이후 우리는 다음 모유 했다 조 인간 enteroids의 확산에 영향을 조사. 우리 인간의 모유 제어 (B, Ki67, 붉은 얼룩-그림 2A)에 비해 조 숙한 인간 enteroids의 확산을 증가 입증. 중요 한 것은, 인간 기증자 모유는 또한 enteroid 확산을 제어, 하지만 인간의 유방암 저온 살 균 되지 않은 우유 (그림 2B-C) 보다 약간 낮은 정도에 비해 증가 했다. 우리 다음 조 인간 enteroids에 Ki67 mRNA 식을 평가 하 고 Ki67 모유 또는 기증자 모유 컨트롤 (그림 2D)을 기준으로 치료 하는 enteroids에서 증가 했다 발견.
우리 다음 이러한 효과 모유에 관하여 종의 있다면 보고 싶 었 어 요. 우리 개발 참조11,12로 수정된 상용 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 젖을 쥐에서 모유를 수집 하는 방법. 묘사는 마 취 수 댐 우유 컬렉션을 받고 사용 하는이 장치 (그림 3). 실험의 다음 시리즈 마우스 enteroids에서 수행 하 고 마우스, 인간, 또는 기증자 모유에서 표현된 모유의 확산 효과 평가 했습니다. 그림 4에서 같이, 마우스, 인간, 그리고 저온 살 균된 기증자 유 방 우유 컨트롤 (그림 4A-D)에 비해 마우스 enteroids에 증가 확산. 마우스 enteroids에 확산 존재 TLR4 ligand, lipopolysaccharide (LPS), 제어 (그림 4A, E)에 비해 감소 했다. 중요 한 것은, 마우스, 인간, 또는 기증자 유 방 우유 모든 복원 enteroid 확산 LPS 같이 증가 Ki67 얼룩에 의해 존재 LPS 혼자 (그림 4 층-H)에 비해.
우리의 실험에서 우리는 작은 창 자 enteroids 신생아 쥐에서 파생 된 조 인간의 태아 소장 문화에서 유지 될 수 표시. 우리는 더 다양 한 실험을 위해 사용할 수 있는 마우스에서 모유를 추출 하는 효율적인 방법을 제공 하는 새로운 유 방 우유 수집 방법을 제공 합니다. 우리 인간이 나 쥐에서 표현된 모유 증가 크기, 성장, 그리고 확산 쥐와 인간 enteroids에 발견. 또한, 마우스, 인간, 그리고 기증자 모유 LPS 노출 후 enteroid 확산 복원. 이 모유가 생쥐와 인간 소장에 항 염증 효과 발휘 수 있습니다 나왔다.
그림 1입니다. 유 방 우유와 기증자 모유 증가 크기와 마우스와 조 인간 enteroids의 성장. 신생아 쥐 (p14) 또는 조 인간의 창 자에서 작은 창 자 enteroids의 photomicrographs 미디어 (제어), 모유, 또는 기증자 모유 (50 µ L/mL) 24 h. 크기 바에 대 한 치료: 1000 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이 더 큰 버전을 볼 수 그림.
그림 2입니다. 유 방 우유와 모유 기증자 조 인간 enteroids의 확산 증가. 5 일, 24 h에 대 한 인간의 유 방 우유와 저온 살 균된 기증자 유 대우 고 얼룩이 확산 마커 Ki67 (빨간색)와 DAPI (핵, 블루)에 대 한 교양 조 인간 enteroids의 Confocal 현미경 사진 (A). 크기 바: 50 µ m. (B) qRT-PCR Ki67 식 하우스키핑 유전자 RPLO에 상대적인 인간 enteroids의. n = 그룹 당 5. p < 학생 t 테스트 제어에 비해 0.0001 비교. 데이터는 평균 ± 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 컬렉션에서 수정 된 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 마 취 마우스 우유의. 메 마른 인간 유 방 펌프 튜브는 옥 시 토 신 주사를 받은 후 마 취 수 댐의 꼭지에 배치. 마우스 우유 5 mL 컬렉션 튜브로 중간 속도 힘에 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 수집 됩니다. 집단 양 출생 후 일 7-12에서 모든 꼭지 에서부터 500 µ L 마우스 당 1 mL에서 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 마우스, 인간, 그리고 저온 살 균된 기증자 모유 강화 마우스 enteroid 확산. (A H) P14 작은 장 마우스 enteroids (제어, A)의 confocal 현미경 마우스 모유 (MBM, B)와 인간의 모유 (BM, C), 또는 인간 기증자 모유 (DBM, D)에서 치료 부재 ( 에서에서 12 h에 대 한 미디어의 50 µ L/mL A-D) 또는 12 h, (E-H)에 대 한 미디어의 25 µ g/mL의 복용량에 lipopolysaccharide (LPS)의 존재와 확산 마커 Ki67 (빨간색)와 DAPI (핵, 블루)에 대 한 스테인드. 크기 바: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
장 상피 직감 장벽 무결성을 유지 하는 병원 체에 대 한 호스트 방어를 제공 하 고 여러 질병의 병 인에 위반 될 수 있는 많은 세포질 하위 구성 됩니다. 동물 모델 질병의 몇 가지 측면을 정리 수 있습니다, 하는 동안 생쥐와 인간의 작은 창 자에서 파생 된 enteroids의 비보 전 모델 다양 한 치료의 효과 테스트 플랫폼을 제공 합니다. Enteroid 모델의 중요성 문화 순진한 또는 병에 걸린 동물과 기존 방법으로 사용할 수 없습니다 인간에서 모든 상피 세포 하위로 장 줄기 세포를 분화 하는 연구자를 수 있습니다. 이 모델 시스템 마우스 등 엔테로바이러스25 또는 노로바이러스26 다른 사람 사이 쉽게 변환 되지 않을 수 있습니다 인간 병원 체와 감염에 대 한 사용할 수 있습니다. Enteroid 모델에는 몇 가지 이점이 사용; 그러나, 배려는 미디어와 enteroids의 생존에 필요한 특정 세 성장 요인에 사용 되는 시 약에 일관성을 보장가지고 한다.
Enteroid 모델 내에서 몇 가지 단계가 중요 enteroids 생산에서 성공을 보장 하는. 찬 허 혈 성 시간을 최소화, 조직 적당 하 게 처리 한다. Enteroids 조직 조직 4 ° c.에 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 배치 됩니다 경우 수확 후 24 h까지 생성 될 수 있습니다. 이 필요한 경우 운송 또는 운송의 옵션을 촉진 수 있습니다. Enteroids의 설립, 지하실 멤브레인 첨부 하 고 성장 지하실에 대 한 각의 밑에 얇은, 평면 레이어 수 있어야 합니다. 지하실 막 플랫 되지 않습니다 또는 거품 존재는 지하실 되지 않을 수 있습니다 준수 하 고 것입니다 미디어 변경 될 때 제거 됩니다. enteroids 설립 후 그들은 수 있습니다 7 일 마다 passaged 또는 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동. 천천히 그리고 각 잘 방지는 enteroids를 방해 하는 것의 가장자리를 제거 및 추가 토 굴 문화 미디어의 성장 요인 및 각 치료의 관리 수행 되어야 합니다. enteroids의 그들 분리 되 고 씻 겨 미디어 변경 될 때 발생할 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 해야 합니다 주의 지하실 막과 연결 된 enteroids의 무결성을 유지 하.
현재 연구에서 우리 신생아 쥐에서 파생 된 enteroids 및 조기 유아 성장 하 고 증식 유 방 우유의 다른 종류의 존재를 보고 합니다. 이러한 연구는 조 소장에 유 방 우유의 효과 대 한 우리의 이해를 사전. 우리 enteroid 문화 인간과 쥐에서 실험실에서 설정 하는 방법에 대 한 자세한 방법의 제공 합니다. 또한, 수정된 전기 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 젖이 마우스에서 모유를 수집 하는 효율적인 방법을 시연 합니다. 우리 그 마우스 보여 인간, 및 저온 살 균 기증자 모유 강화 성장과 쥐와 인간 enteroids의 확산. 또한, 우리는 감소 enteroid 확산 TLR4 ligand LPS, 마우스, 인간, 또는 기증자 모유는 enteroids를 투여 하는 경우 복원 된 존재를 보여줍니다. 미래의 응용 프로그램 특정 약물 특정 유아에 미치는 영향을 볼 수 장 절제술 후 유아에서 얻은 enteroids에 높은 처리량 마약 화면 맞춤된 정밀 의학을 포함할 수 있습니다. 우리 다른 연구소 소장, NEC, 등의 소아 질병의 많은 다른 영역에 이러한 기술을 활용에 잠재적인 성공 찾을 것입니다 희망 함께 찍은, 임상 시급 새로운 치료 전략을 개발 하는.
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Disclosures
저자는 아무것도 공개 및 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
MG은 K08DK101608와 R03DK111473는 건강의 국가 학회 3 월의 천 재단 보조금 No. 5-FY17-79, 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학, 세인트 루이스 아동 병원과의 학과에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 워싱턴 대학 대학원 의학의 세인트 루이스에서 소아과. CJL R01DK104946에 의해 지원 됩니다 (PI: 실버), 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학 및 St. 루이 아동 병원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
