Summary
Ce protocole décrit comment mettre en place un système de culture enteroid de souris néonatale ou intestin prématurée de l’homme, mais aussi une méthode efficace pour recueillir le lait de souris.
Abstract
Enteroids intestinales petits humains proviennent des cryptes et lorsqu’il est cultivé dans une niche de cellules souches contiennent tous les types de cellules épithéliales. La capacité d’établir des enteroid humaines ex vivo systèmes de culture sont importantes de physiopathologie intestinale de modèle et d’étudier les réponses cellulaires particuliers impliqués. Ces dernières années, enteroids de souris et les humains sont cultivées, repiquées et mis en banque loin pour une utilisation future dans plusieurs laboratoires à travers le monde. Cette plate-forme d’enteroid peut être utilisée pour tester les effets de divers traitements et des médicaments et quels sont les effets sont exercent sur les différents types de cellules dans l’intestin. Ici, un protocole pour l’établissement primaire enteroids intestinale petites cellules souches dérivées provenant de souris néonatales et intestin humain prématuré est fourni. En outre, ce système de culture enteroid a été utilisé pour tester les effets du lait maternel propres à chaque espèce. Lait maternel de la souris peut être obtenu efficacement à l’aide d’un tire-lait humains modifiés et lait exprimé souris peut ensuite être utilisé pour plus amples recherches expérimentales. Nous maintenant de démontrer les effets de souris exprimée, humaine, et lait maternel donneur sur la croissance et la prolifération des enteroids dérivés de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré.
Introduction
L’entérocolite nécrosante (NEC) est la principale cause de décès par maladie gastro-intestinale chez les nouveau-nés prématurés, affectant près de 1 sur 10 enfants nés avant 29 semaines de gestation1,2,3. La moitié des nourrissons avec les progrès de NEC à la forme la plus sévère, où la survie est seulement 10-30 %4,5. Aux États-Unis, environ 2 milliards USD/année sont passées à traiter les enfants avec NEC6,7, mais le taux de survie ni d’une thérapie a changé au cours des 30 dernières années. La pathogenèse de l’entérocolite nécrosante est caractérisée par des lésions intestinales et atteinte muqueuse guérison8,9,10,11, cependant, les voies de signalisation conduisant à un exacerbée la réponse inflammatoire et mécanismes d’inverser l’inflammation restent incomplètement compris.
L’administration de lait maternel s’est avérée pour être la stratégie de protection seulement contre NEC pour les bébés prématurés. Nous avons déjà montré que le lait maternel protège contre NEC développement par le biais de l’inhibition du récepteur toll-like récepteurs immunitaires innées 4 (TLR4) dans l’épithélium intestinal par le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)11de la voie de signalisation. La supplémentation du lait maternel à une formule expérimentale de NEC a atténué la réponse inflammatoire chez NEC, tel que démontré par l’inhibition de l’apoptose de l’entérocyte et restauration des entérocytes prolifération d’une manière qui dépendait de croissance épidermique Factor (EGF) et EGFR11. Dans une autre étude, il a été démontré que des nitrates, une autre composante du lait maternel, contribue à son caractère protecteur en modulant la perfusion intestinale, comparativement aux préparations pour nourrissons, qui manque de nitrate et peuvent contribuer à l’augmentation de la fréquence de l’entérocolite nécrosante dans formule nourris les bébés12,13. Autres composés présents dans le lait maternel qui sont sont révélées être impliquées dans la protection contre le NEC incluent des oligosaccharides de lait humain, L-arginine, glutamine et lactoferrine14,15,16, 17,18,19. Ces éléments bénéfiques du lait maternel révèlent la nécessité de son utilisation dans la prévention de l’entérocolite nécrosante, mais soulignent également l’importance d’étudier les mécanismes de signalisation des voies et les effets cellulaires impliqués dans la façon dont le lait maternel est médiation la protection contre le NEC .
Dans l’ordre afin d’étudier les propriétés protectrices du lait maternel dans un modèle murin de NEC, nous avons développé une technique innovatrice et facile à utiliser, par où la souris le lait maternel peut être extraite d’un barrage anesthésié à l’aide d’un maternel électrique pompe11,12 . Cette stratégie d’acquisition de lait maternel de la souris est avantageuse, non seulement parce que humain tire-laits sont facilement accessibles et efficaces dans l’achat de lait maternel, mais aussi parce que cette méthode permet des analyses de lait maternel propres à chaque espèce. En conséquence, nous permet de comparer les effets du lait maternel de la souris avec celles du lait maternel humain comme donneur humain le lait pasteurisé provenant une banque de lait dans les modèles spécifiques à l’espèce. Cette technique permet l’étude des composants du lait maternel en ce qui concerne leur contribution à la prévention de la NEC. Autres chercheurs ont mis au point des méthodes d’extraction lait maternel, mais ces techniques sont manuelles et nécessitent plus d’un laboratoire membre20,21,22. Une technique simple qui peut être utilisée en modifiant un tire-lait électrique humain pour collecter le lait d’une souris est présentée ici. Cette technique peut également être appliquée à d’autres espèces.
Afin de bien interroger les voies de signalisation impliquées avec NEC, modéliser les systèmes sont nécessaires pour évaluer tous les types de cellules différents connus pour être affectés dans le processus de la maladie. Ici, nous discutons un tel système de modèle - enteroids - et leur mise en place de la souris et de l’intestin humain. Enteroids intestinaux humains (Eih) en particulier fournir des promesses importantes, parce qu’ils offrent un modèle humain novateur, génétiquement diverse le ex vivo pour faciliter l’étude des processus physiopathologiques qui se déroulent dans le tractus gastro-intestinal 23. Enteroids ont été trouvés à être cultivées à long terme et peuvent être congelés pour plus tard utilisation23, et contrairement à l’humain organoïdes intestinale (HIOs), dont les cultures sont développées à partir des cellules souches pluripotentes inductible, enteroids sont générés à partir des cellules souches dans les cryptes intestinales isolées24. Enteroids exigent moins d’entretien, peut être infecté rapidement25et peut être facilement établie puisque des cryptes intestinales sont plus différenciés que HIOs23. Donc, HIEs offrent de nombreux avantages par rapport aux techniques existantes car ils peuvent être développés pour exposer des propriétés de compositions et les fonctions spécifiques à une région de l' épithélium gastro-intestinal humain23. L’utilisation d’enteroids est un choix très efficace lorsque le besoin d’un modèle humain de l’intestin, avec respect des limites propres à chaque région et facilité d’utilisation. Nous démontrons la technique d’isoler et de maintenir les principales cellules souches dérivées petit intestinale enteroids de souris et les humains prématurés.
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Protocol
Toutes les procédures animaux dans cette étude ont été approuvées par soit l’Université de Washington à animalier institutionnels St.Louis et Comité de l’urbanisme (protocole 20160187) ou animalier institutionnel d’Université de Pittsburgh et Comité de l’urbanisme (protocole 14103918). Humain intestin fœtal à moins de 24 semaines de grossesse a été obtenue conformément aux directives marchés publics tissus anatomiques Université de Pittsburgh après approbation Institutional Review Board (protocole PRO14100537) de l’Université de Pittsburgh santé Sciences Banque de tissus grâce à un système intermédiaire honnête. Le lait maternel humain dépersonnalisées ou du lait maternel pasteurisé donneur a été obtenu avec une dispense de consentement de l’Université de Pittsburgh Institutional Review Board.
1. crypte isolement et mise en place d’Enteroids de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré
- Préparation des médias
NOTE : Media doit être préparés dans la hotte la veille de l’isolement de la crypte.- Préparer des milieux de Culture L 1,11. Commencer avec 1 L support de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose et de la L-glutamine et ajouter 110 mL sérum fœtal (SVF) (concentration finale 10 %), 11 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %) et 1,1 mL insuline stérile (final concentration de 0,1 %).
- Préparer 500 mL d’un mélange PBS-antibiotique. Commencer avec 500 mL 1 x tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) avec 10 % FBS et ajouter 5 mL de gentamicine (concentration finale 1 %), 1 mL amphotéricine B (concentration finale 0,2 %) et 5 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %).
- Préparer des milieux de désorganisation cellulaire 30 mL #1. Tout d’abord préparer 30 mL de milieu de Culture. Ajouter 600 µL 0,5 M d’acide tétraacétique (EDTA) (concentration finale 10 mM), 300 µL gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %).
- Préparer des milieux de désorganisation cellulaire 30 mL #2. Tout d’abord préparer 30 mL de milieu de Culture. Ajouter 300 µL 0,5 M EDTA (concentration finale 5 mM), 300 µL gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %).
- Préparer 50 mL de milieu de Culture crypte sans facteurs de croissance. Mesurer 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 et ajouter 10 mL FBS (concentration finale 20 %).
- Ajouter 500 µL pénicilline-streptomycine (concentration finale 1 %), 500 µL L-glutamine (concentration finale 1 %), 500 µL gentamicine (concentration finale 1 %), 100 µL amphotéricine B (concentration finale 0,2 %), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane acide sulfonique (HEPES) (concentration finale de 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-acétylcystéine (concentration finale de 1 mM), 500 µL 100 x N-2 Supplément, 1 mL 50 x sans sérum supplément (par exemple, B-27) moins de vitamine A et 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
- Préparer 1 mL de milieu de Culture crypte présentant des facteurs de croissance. Tout d’abord préparer 1 mL de crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance. Ajouter 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (concentration finale 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL caboche (concentration finale 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (concentration finale 500 ng/mL) et 0,5 µL 100 µg/mL EGF (concentration finale 50 ng/mL).
- Isolement de la crypte
- Place solubilisée extrait de la membrane basale (voir Table des matières) sur la glace pour décongeler avant de commencer.
NOTE : Membrane basale donjon sur glace ou il va polymériser. - Respectant un protocole institutionnel animalier et Comité d’urbanisme pour souris supérieures à 14 jours d’âge, euthanasier souris avec deux méthodes d’euthanasie avec le second constituant une mesure physique pour s’assurer de la mort.
Remarque : Pour les souris sous 14 jours d’âge, la décapitation est la procédure standard à l’aide de ciseaux. - À l’aide de ciseaux et pinces, pratiquer une incision verticale vers le bas de la ligne médiane de l’abdomen, à travers la peau et le péritoine, pour toute la longueur de l’abdomen. L’accise de l’intestin grêle de l’estomac pour le caecum avec des ciseaux et enlever le mésentère avec une pince.
Remarque : Deux semaines mâles et femelles C57BL/6J souriceaux, chacun pesant 5,5-7 g, ont été utilisés pour l’isolement de la crypte. N’importe quel âge ou taille de la souris peut être utilisée pour l’isolement de la crypte. - Pour préparer l’intestin grêle fraîchement récolté pour l’isolement de la crypte, intestin position droite et couper l’intestin longitudinalement sur toute sa longueur à l’aide de ciseaux.
Remarque : La souris et l’intestin humain peuvent être préparés de la même façon. - Propres selles dans l’intestin en le secouant doucement l’intestin en arrière dans un récipient Petri de PBS-antibiotique mélange avec une pincette.
- Ajouter 30 mL de perturbation des cellules Media #1 pour un tube conique de 50 mL. Couper l’intestin en morceaux de longueur 0,5 cm directement dans le tube. Mettre le tube dans un seau à glace et agiter délicatement sur l’agitateur à la vitesse la plus basse pendant 15 min.
- Alors que les tissus sont sur le shaker, procurer des plaques de 24 ou 48 puits pour cultiver des cryptes si les enteroids sont à utiliser pour les ARN, ADN ou isolement de protéine. Utilisation 8 puits chambre diapositives à cultiver des cryptes si les enteroids doivent être utilisés pour tout Mont imagerie confocale.
- Dans la hotte, ajouter 15 µL de membrane basale au fond de chaque puits de la plaque de 24 ou 48 puits. Si vous utilisez des diapositives de la chambre, ajouter 9 µL de membrane basale dans le fond de chaque chambre.
Remarque : Régler le volume de la membrane basale selon la taille de la plaque si nécessaire. - La membrane basale avec l’embout de la pipette se propager rapidement afin que la membrane basale forme une couche mince sur le fond du puits. Placer la plaque à 37 ° C dans l’incubateur pendant 30 min permettre à la membrane basale à polymériser.
Remarque : Les cryptes ne s’attachera pas si la membrane basale n’est pas une mince couche ou si la membrane basale contient des bulles d’air. - Après 15 min sur un agitateur, filtrer le tissu à travers un tamis de 100 µm. Jeter le débit à travers.
- Ajouter 30 mL de cellule perturbation Media #2 dans un nouveau tube conique de 50 mL. Retirer les tissus de crépine et ajouter dans le tube.
- Mettre le tube dans un seau à glace et agiter délicatement sur l’agitateur à la vitesse la plus basse pendant 15 min.
- Après 15 min sur le shaker, filtrer des tissus à travers un tamis de 100 µm. Maintenir les flux grâce à cette étape, au cas où les rendements sont faibles dans les étapes ultérieures.
NOTE : Tous les flux à travers des tubes doit être conservé sur la glace. - Ajouter 15 mL DMEM avec 4,5 g/L de glucose et de la L-glutamine dans un nouveau tube conique de 50 mL. Retirer les tissus de crépine et ajouter dans le tube. Vigoureusement agiter le tube à la main pendant 10 s. filtre à travers un tamis de 100 µm et de recueillir les traversent. Répétez jusqu'à ce que traversent ne contient aucuns particules.
- Dans la hotte, filtrer le flux par le biais de l’étape précédente dans un nouveau tube conique de 50 mL à l’aide de 70 µm crépines pour tissus de souris ou 100 µm crépines pour les tissus humains.
NOTE : Ont des filtres supplémentaires en attente et versez lentement comme crépines seront obturé par des débris. - Centrifuger le tube à 200 x g pendant 8 min à 4 ° C et déposez directement dans un seau à glace dans la hotte. Retirez le surnageant par pipette sans déranger le culot. Resuspendre le culot avec le montant souhaité de la crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance.
Remarque : Les cryptes enrichis sont la couche « sable » de la pastille. Chacun requiert bien 250 µL de crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance.
- Place solubilisée extrait de la membrane basale (voir Table des matières) sur la glace pour décongeler avant de commencer.
- Mise en place d’enteroids
- Plaque de mélange médias crypte directement sur la membrane basale.
- Vérifier les cryptes avec un microscope pour s’assurer que le processus d’isolement a été un succès.
Remarque : Les cellules et les boules de cellules sont souhaitées. Environ 100 des cryptes sont plaqués par puits. - Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 h permettre des cryptes d’adhérer à la membrane basale.
Remarque : Cette incubation est avec crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance. - Retirez lentement les médias et les cryptes excès, impossible d’attacher à l’aide d’une pipette de P-200.
Remarque : Ne pas déranger la membrane basale comme les cryptes ci-joint peuvent se déplacer. - Ajouter lentement 250 µL de crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance à chaque puits.
Remarque : Pour 24, 48 plats ou chambre glisse, 250 µL de crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance est suffisante. - Remplacer les médias tous les 2 jours avec frais crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance pendant 5 jours avant les traitements permettant la croissance et une fixation optimale.
2. souris Breast Milk Collection
- Séparer un barrage qui allaitent C57BL/6J au post-partum 7-12 jours de ses chiots durant 6 h avant la traite.
- Anesthésier le barrage de lactation avec isoflurane via un cône de nez et d’administrer une injection sous-cutanée d’ocytocine à 0,15 UI/kg de poids corporel. Attendre 3 minutes avant d’effectuer la procédure de traite.
- Nettoyer les trayons avec éthanol à 70 % avant la procédure de traite et laissez sécher.
- Extraire le lait de tétines un à la fois en utilisant une pompe électrique maternel avec tube silicone dimensionnée en fonction des tétines de souris dans un tube de prélèvement de 5 mL.
Remarque : Tire-lait optimale possèdent deux paramètres, un pour la vitesse et un pour l’aspiration. Il est préférable de commencer avec les plus petits paramètres de chacun et les deux augmente lentement jusqu'à ce que le lait est extrait. Idéalement, le rendement total sera ~ 500 µL - 1 mL de lait maternel de la souris par barrage de lactation. - Le lait maternel immédiatement aliquote et conserver à-80 ° C.
Remarque : Évitez de gel/dégel cycles. - Traiter les enteroids le jour 5 avec 50 µL/mL de lait maternel souris / mL de milieu de Culture de crypte présentant des facteurs de croissance pendant 24 h à 37 ° C.
3. ensemble de monter la coloration des Enteroids
-
Préparation des réactifs
- Préparer les PBS 1 x 16 mL par 8 puits.
- Préparer 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) en solution de 1 PBS x par 8 puits.
- Préparer 2 mL 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x par 8 puits.
- Préparation de 24 mL PBS Tween (PBST est 0,1 % Tween 20 à 1 x PBS) par 8 puits.
- Préparer 2 mL 10 % âne normal de sérum (NDS) dans 0,1 % PBST (10 % NDS/PBST) par 8 puits.
- Préparer 4 mL 1 % NDS dans 0,1 % PBST (1 % NDS/PBST) par 8 puits.
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Jour 1 de la coloration
- Aspirer au large de traitements et enteroids avec du PBS de lavage. Ajouter 250 µL 4 % PFA / puits. Placer sur rotateur pendant 1-2 h à 4 ° C. Enlever les 4 % PFA avec pipette.
- Laver 4 fois avec 250 µL/puits 1 x PBS. Placer sur rotateur pendant 10 min à température ambiante (RT).
Remarque : Il est possible de stocker la plaque pendant 1 à 2 jours à 4 ° C si nécessaire. - Ajouter 250 µL/puits 0,1 % X-100 Triton. Incuber pendant 1 heure à RT. Remove 0,1 % Triton X-100 avec la pipette.
- Laver 4 fois avec 250 µL/puits 1 x PBS. Placer sur rotateur pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 250 µL/puits 10 % NDS/PBST. Incuber pendant 45 min à RT. Remove 10 % NDS/PBST avec pipette.
- Ajoutez l’anticorps primaire µL/puits 250, 1/250 dilué à 1 % NDS/PBST et incuber une nuit à 4 ° C.
Remarque : La dilution optimale anticorps varie selon le fabricant.
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Jour 2 la coloration
- Laver au moins 5 fois pendant 4-5 h avec 250 µL/puits PBST. Placer sur rotateur à 4 ° C entre chaque lavage.
- Ajouter 250 µL/puits secondaires anticorps, dilué 1/1 000 à 1 % NDS/PBST. Enrouler la plaque au fleuret et incuber une nuit à 4 ° C.
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Jour 3 de coloration
- Ajouter 250 µL/puits nucléaires tache 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 15 min.
Remarque : Maintenir la plaque dans l’obscurité. - Laver 6 fois avec 250 µL/puits PBST. Placer sur rotateur pendant 10 min à 4 ° C entre chaque lavage.
- Lamelle de Mont sur Chambre glisser avec support de montage.
- Prendre des photos avec un 40 X objectif microscope confocal et également restituer dans un raster éditeur graphique (voir Table des matières).
- Ajouter 250 µL/puits nucléaires tache 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 15 min.
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Representative Results
Tout d’abord, nous avons voulu étudier si avec du lait maternel ou du lait maternel pasteurisé donneur a eu un effet sur petit enteroids intestinale. En effet, lait maternel et le lait maternel donneur augmentent la croissance des souris néonatale (Figure 1 a) et prématurée humaine dérivée enteroids (Figure 1 b).
Étant donné que le lait maternel humain a augmenté la croissance des petits enteroids intestinale, nous avons examiné ensuite si le lait maternel a eu un effet sur la prolifération des enteroids humaines prématurée. Nous démontrons que le lait maternel humain augmente la prolifération des prématurés enteroids humaine par rapport au contrôle (Figure 2 a–B, Ki67, coloration rouge). Ce qui est important, lait maternel donneur humain a également augmenté la prolifération enteroid par rapport au contrôle, mais à un degré légèrement moindre que le lait maternel humain non pasteurisé (Figure 2 b–C). Ensuite, nous avons évalué l’expression de l’ARNm de Ki67 dans l’enteroids humaine prématurée et découvert que Ki67 a augmenté chez les enteroids traités par le lait maternel ou lait maternel donateur par rapport au témoin (Figure 2D).
Ensuite, nous avons voulu voir si ces effets sont spécifiques à l’espèce en ce qui concerne le lait maternel. Nous avons développé un moyen de recueillir le lait maternel provenant de souris allaitantes utilisant un mis à jour le tire-lait disponibles dans le commerce humain comme références11,12. Représenté est un barrage qui n’allaitaient pas anesthésié en cours de collecte de lait à l’aide de cet appareil (Figure 3). La prochaine série d’expériences a été réalisée sur des souris enteroids et nous avons évalué les effets de la prolifération de lait maternel de la souris, l’homme soit donneur le lait maternel. Tel qu’illustré à la Figure 4, la souris, humain, et du lait maternel pasteurisé donneur prolifération accrue dans l’enteroids de la souris par rapport au contrôle (Figure 4 a–D). Prolifération dans l’enteroids de la souris est diminuée en présence du ligand TLR4, lipopolysaccharide (LPS), par rapport au témoin (Figure 4 a, E). Ce qui est important, souris, homme ou donateurs du sein lait tout restauré enteroid prolifération en présence de LPS tel que démontré par coloration de Ki67 accrue par rapport aux LPS seul (Figure 4F–H).
De nos expériences, nous montrons que petite enteroids intestinal provenant de souris néonatales et intestin foetal humain prématuré peut être maintenue en culture. De plus, nous fournissons une méthode de collecte de lait maternel roman qui fournit un moyen efficace pour extraire le lait maternel de la souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour diverses expériences. Nous avons découvert que le lait maternel de l’homme ou de la souris a augmenté la taille, la croissance et la prolifération de souris et humains enteroids. En outre, souris, homme et donateurs du lait maternel restauré la prolifération d’enteroid après l’exposition de LPS. Ceci suggère que le lait maternel peut exercer des effets anti-inflammatoires sur l’intestin des souris et des humains.
Figure 1. Le lait maternel et le lait maternel donateurs augmentent la taille et la croissance de souris et prématuré humain enteroids. Microphotographies de petites enteroids intestinale de souris néonatales (p14) ou de l’intestin humain prématuré traitement avec médias (contrôle), le lait maternel ou le lait maternel donneur (50 µL/mL) pour barre graduée 24 h. : 1 000 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette Figure.
Figure 2. Le lait maternel et le lait maternel donneur augmentent la prolifération des prématurés humains enteroids. (A) microscopie confocale prématuré enteroids humaines cultivées pendant 5 jours, traités par le lait maternel et le lait maternel pasteurisé donneur pendant 24 h et colorés pour le marqueur de prolifération Ki67 (rouge) et au DAPI (nucléaire, bleu). Barre de taille : 50 µm. (B) qRT-PCR pour Ki67 expression d’enteroids humaine par rapport à la gène de ménage RPLO. n = 5 par groupe. p < 0,0001 comparaisons avec le test t de Student par rapport au témoin. Les données sont moyenne ± écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Collecte du lait d’une souris anesthésié à l’aide d’une pompe de sein humain mis à jour le. Tubulure pompe maternel stérile placé sur tétines du barrage qui n’allaitaient pas anesthésié après avoir reçu l’injection d’ocytocine. Lait de souris est recueilli au moyen de la pompe de sein humain sur la vitesse moyenne et la puissance dans un tube de prélèvement de 5 mL. Volumes collectifs extraites de toute gamme de tétines de 500 µL à 1 mL par souris à 7-12 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Souris, humain, et du lait maternel pasteurisé donneur renforcer la prolifération de souris enteroid. (A-H) Microscopie confocale p14 petite souris intestinale enteroids (commande, A) traités par le lait maternel souris (MBM, B), le lait maternel humain (BM, C), ou le lait maternel humain donneur (DBM, D) à 50 µL/mL des médias pendant 12 h, en l’absence ( A-D) ou la présence de lipopolysaccharides (LPS) à une dose de 25 µg/mL de médias pendant 12 h, (E-H) et colorées pour le marqueur de prolifération Ki67 (rouge) et le DAPI (nucléaire, bleu). Barre de taille : 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’épithélium intestinal est constitué de nombreux sous-types cellulaires qui sont chargé de la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, maintenir l’intégrité de barrière intestinale et peuvent être rompues dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Alors que les modèles animaux peuvent récapituler quelques facettes de la maladie, le modèle ex vivo d’enteroids dérivé de l’intestin des souris et des hommes constitue une plate-forme pour tester les effets de divers traitements. L’importance du modèle enteroid permet aux chercheurs de la culture et de différencier les cellules souches intestinales dans tous les sous-types cellulaires épithéliales des naïfs ou des animaux malades et les humains qui ne sont pas disponibles avec les méthodes existantes. Ce système de modèle peut servir pour les infections par des agents pathogènes humains qui ne peuvent être facilement traduisibles dans la souris, comme les entérovirus25 ou norovirus26 entre autres. Le modèle enteroid a plusieurs avantages et utilisations ; Cependant, il faut pour assurer l’uniformité dans les réactifs utilisés pour rendre les médias et les facteurs de croissance exogènes spécifiques qui sont nécessaires pour la survie des enteroids.
Dans le modèle d’enteroid, plusieurs étapes sont d’une importance cruciale pour assurer le succès dans la production d’enteroids. Pour minimiser le temps ischémique froid, tissus doivent être traitées rapidement. Enteroids peut être produit jusqu'à 24h après avoir récolté le tissu si le tissu est placé au milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) à 4 ° C. Cela peut faciliter l’option d’expédition ou de transport si nécessaire. Pour la mise en place d’enteroids, la membrane basale doit être une couche mince et plate au fond de chaque puits pour les cryptes d’attacher et de se développer. Si la membrane basale n’est pas plate ou a bulles présents, les cryptes peuvent échouer d’adhérer et de s’être retiré lorsque le média est modifié. Après l’établissement des enteroids, elles peuvent être repiquées tous les 7 jours ou congelés dans l’azote liquide pour le stockage à long terme. Suppression et ajout de milieux de Culture crypte présentant des facteurs de croissance et l’administration de chaque traitement doivent être effectués lentement et au bord de chaque puits pour éviter de déranger les enteroids. Perturbation de l’enteroids elles risquent de devenir détachée et emporté lorsque le média est modifié. Pour de meilleurs résultats, il faut pour préserver l’intégrité de la membrane basale et l’enteroids ci-jointe.
Dans la présente étude, nous rapportons qu’enteroids dérivé de souris néonatales et prématurés peuvent se développer et proliférer en présence de différents types de lait maternel. Ces études faire progresser notre compréhension des effets du lait maternel sur l’intestin prématurée. Nous fournissons une méthode détaillée sur la façon d’établir des cultures enteroid dans le laboratoire de l’homme et la souris. En outre, nous démontrons une méthode efficace de recueillir le lait maternel d’une souris allaitante à l’aide d’une pompe de sein humain électrique mis à jour le. Nous montrons que la souris, le lait maternel humain et pasteurisé donneur améliorer la croissance et la prolifération des enteroids de la souris et les humains. En outre, nous montrons une diminution enteroid prolifération en présence du ligand TLR4 LPS, qui a été restauré lorsque la souris, l’homme ou du donneur le lait maternel a été administré à l’enteroids. Futures applications peuvent inclure la médecine personnalisée de précision avec des écrans de drogues à haut débit sur enteroids obtenu de nourrissons après résection intestinale de voir comment certains médicaments peuvent affecter l’enfant en particulier. Ensemble, nous espérons autres laboratoires trouverez succès potentiel en utilisant ces techniques dans nombreux différents royaumes de maladies pédiatriques de l’intestin, y compris NEC, où il y a un besoin urgent de clinique d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
MG est pris en charge par des subventions K08DK101608 et R03DK111473 de l’hôpital le National Institutes of Health, mars des Dimes Foundation Grant No 5-FY17-79, l’HME Discovery Institute de Washington University et Saint-Louis pour l’enfance et le service des Pédiatrie à la Washington University School of Medicine, Saint-Louis. CJL est pris en charge par R01DK104946 (PI : Silverman), hôpital Discovery Institute de Washington University des enfants et Saint-Louis pour l’enfance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
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