Summary
Denne protokol beskriver, hvordan du opretter en enteroid kultur system fra neonatal mus eller for tidlig human tarmen samt en effektiv metode til at indsamle mælk fra mus.
Abstract
Menneskelige lille tarm enteroids er afledt af krypter og når der dyrkes i en stamcelle niche indeholder alle typer epitelcelle. Evnen til at etablere menneskelige enteroid ex vivo kultur systemer er vigtige for model intestinal Patofysiologi og til at studere de særlige cellular svar involveret. I de seneste år, er enteroids fra mus og mennesker ved at blive kulturperler, passaged, og banken væk til fremtidig brug i flere laboratorier i hele verden. Denne enteroid platform kan bruges til at teste effekten af forskellige behandlinger og lægemidler og hvilken effekt er udøvet på forskellige celletyper i tarmen. Her, en protokol til oprettelse af primære stamcelle-afledt lille tarm enteroids afledt af neonatal mus og tidlig human tarmen er fastsat. Desuden, denne enteroid kultur system var udnyttet til at teste effekten af artsspecifikke modermælk. Musen modermælk kan opnås effektivt ved hjælp af en modificeret menneskelige brystpumpe og udtrykte mus mælk kan derefter bruges til yderligere forskning eksperimenter. Vi nu demonstrere virkningerne af udtrykt mus, menneskelige, og donor modermælk på vækst og spredning af enteroids stammer fra neonatal mus eller for tidlig menneskelige tyndtarmen.
Introduction
Nekrotiserende enterocolitis er (NEC) den førende dødsårsag for gastrointestinal sygdom i for tidligt fødte spædbørn, der påvirker næsten 1 ud af 10 spædbørn født før 29 uger drægtighed1,2,3. Halvdelen af børn med NEC fremskridt til den mest alvorlige form, hvor overlevelse er kun 10-30%4,5. I USA, en anslået 2-3 milliarder USD pr. år er brugt behandling af spædbørn med NEC6,7, men hverken overlevelsesraten eller terapi har ændret sig i de sidste 30 år. Patogenesen af NEC er karakteriseret ved tarm skade og nedsat slimhinde helbredende8,9,10,11, dog signaling veje fører til en forværret inflammatorisk respons og mekanismer til at tilbageføre betændelse forblive ufuldstændigt forstået.
Administration af modermælk er blevet fundet for at være den kun beskyttende strategi mod NEC til for tidligt fødte spædbørn. Vi har tidligere vist, at modermælk beskytter mod NEC udvikling gennem hæmning af medfødte immun receptor toll-lignende receptor 4 (TLR4) i den intestinale epitel via epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) signalering vej11. Tilskud af modermælk til en eksperimentel NEC formel svækket det inflammatoriske respons set i NEC som påvist ved hæmning af enterocyte apoptose og restaurering af enterocyte spredning i en måde, der var afhængige af epidermal vækst faktor (EGF) og EGFR11. I en anden undersøgelse, blev det vist, at nitrat, en anden komponent af modermælk, bidrager til dens beskyttende karakter af modulerende intestinal perfusion, sammenlignet med modermælkserstatning, der mangler nitrat og kan bidrage til øget hyppighed af NEC i formel fodret spædbørn12,13. Andre forbindelser til stede i modermælk, der har vist sig at være involveret i beskyttelse mod NEC omfatter modermælk oligosaccharider, L-arginin, Glutamin og Laktoferrin14,15,16, 17,18,19. Disse gavnlige elementer af modermælk afsløre nødvendigheden af dens brug i forebyggelsen af NEC, men også understrege betydningen af at studere de mekanismer, signalering pathways og cellular effekter involveret i hvordan modermælk mægle beskyttelse mod NEC .
I orden til yderligere undersøgelse de beskyttende egenskaber af modermælk i en musemodel af NEC, udviklede vi en roman, let at bruge teknik af hvilken mus modermælk kan udvindes fra en bedøvede dam ved hjælp af en elektrisk menneskelige bryst pumpe11,12 . Denne strategi for at erhverve mus modermælk er fordelagtigt, ikke kun fordi menneskelige brystpumper er let tilgængelige og effektive i indkøb af modermælk, men også fordi denne metode giver mulighed for artsspecifikke bryst mælk analyser. Som et resultat, vi kan sammenligne effekter af musen modermælk med dem af menneskelige udmalket mælk samt pasteuriseret menneskelige donor mælk fra en mælk bank i artsspecifikke modeller. Denne teknik giver mulighed for undersøgelse af bryst mælk komponenter i forhold til deres bidrag til NEC forebyggelse. Andre efterforskere har udviklet bryst mælk udvindingsmetoder, men disse teknikker er manuelle og typisk kræve mere end en lab medlem20,21,22. Her præsenteres en nem teknik, der kan udnyttes ved at ændre en menneskelig elektrisk brystpumpe til indsamling af mælk fra en mus. Denne teknik kan også anvendes på andre arter.
For at tilstrækkeligt afhøre signaling veje involveret med NEC, modelsystemer er nødvendige for at evaluere alle de forskellige celletyper vides at blive påvirket i sygdomsprocessen. Her diskuterer vi en sådan modelsystem - enteroids- og deres etablering fra mus og human tyndtarm. Menneskelige tarm enteroids (HIEs) give navnlig betydelige løfte, fordi de tilbyder en innovativ, genetisk forskellige ex vivo menneskelige model til støtte i studiet af patofysiologiske processer, der finder sted i mave-tarmkanalen 23. Enteroids har vist sig at være kulturperler langsigtede og kan fryses til senere brug23, og i modsætning til menneskelige tarm Organoids (HIOs), hvis kulturer er udviklet fra inducerbar pluripotente stamceller, enteroids er genereret fra stamceller inden for isolerede intestinal Krypter24. Enteroids kræver mindre vedligeholdelse, kan være smittede hurtigt25, og kan fastsættes let da intestinal crypts er mere differentieret end HIOs23. Derfor tilbyder HIEs mange fordele i forhold til eksisterende teknikker, fordi de kan udvikles til at udstille regionsspecifikke kompositoriske og funktionelle egenskaber af det menneskelige mave-tarm epitel23. Brugen af enteroids er et yderst effektivt valg når behov for en menneskelig model af tarmen, med overholdelse af regionen-specifikke begrænsninger og lethed-i-brug. Her viser vi en teknik, isolere og opretholde primære stamcelle-afledt lille tarm enteroids fra mus og tidlig menneskelige spædbørn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer i denne undersøgelse blev godkendt af enten Washington universitetet i St. Louis institutionelle Animal Care og brug (protokol 20160187) eller University of Pittsburgh institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (protokol 14103918). Menneskelige føtal tyndtarmen på mindre end 24-ugers drægtighed blev fremstillet i henhold til University of Pittsburgh anatomiske væv indkøb retningslinjer efter institutionelle Review Board godkendelse (protokol PRO14100537) fra University of Pittsburgh Health Sciences vævsbank gennem en ærlig mægler system. De identificerede modermælk eller pasteuriseret donor modermælk blev opnået med en ophævelse af samtykke fra University of Pittsburgh institutionelle Review Board.
1. krypt Isolation og etablering af Enteroids fra Neonatal mus eller for tidlig menneskelige tyndtarmen
- Media forberedelse
Bemærk: Medier bør være forberedt i hætten dagen før krypt isolation.- Forberede 1.11 L Kulturmedier. Begynder med 1 L Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 4,5 g/L glukose og L-glutamin og tilføje 110 mL føtalt bovint Serum (FBS) (slutkoncentration 10%), 11 mL Penicillin-Streptomycin (slutkoncentration 1%) og 1,1 mL sterilt insulin (endelig koncentration 0,1%).
- Forbered 500 mL PBS-antibiotikum blanding. Begynder med 500 mL 1 x Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) med 10% FBS og tilsættes 5 mL Gentamicin (slutkoncentration 1%), 1 mL Amphotericin B (slutkoncentration 0,2%), og 5 mL Penicillin-Streptomycin (slutkoncentration 1%).
- Forberede 30 mL celle forstyrrelser Media #1. Først forberede 30 mL dyrkningsmedier. Tilføje 600 µL 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) (slutkoncentration 10 mM), 300 µL Gentamicin (slutkoncentration 1%) og 60 µL Amphotericin B (slutkoncentration 0,2%).
- Forberede 30 mL celle forstyrrelser Media #2. Først forberede 30 mL dyrkningsmedier. Tilføje 300 µL 0,5 M EDTA (slutkoncentration 5 mM), 300 µL Gentamicin (slutkoncentration 1%) og 60 µL Amphotericin B (slutkoncentration 0,2%).
- Forberede 50 mL krypt Kulturmedier uden vækstfaktorer. Måle 33.4 mL 1 x avanceret DMEM/F-12 og der tilsættes 10 mL FBS (slutkoncentration 20%).
- Tilsættes 500 µL Penicillin-Streptomycin (slutkoncentration 1%), 500 µL L-glutamin (slutkoncentration 1%), 500 µL Gentamicin (slutkoncentration 1%), 100 µL Amphotericin B (slutkoncentration 0,2%), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (HEPES) (slutkoncentration 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-acetylcystein (slutkoncentration 1 mM), 500 µL 100 x N-2 supplement, 1 mL 50 x serumfrit supplement (f.eks.B-27) minus a-vitamin og 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
- Forberede 1 mL krypt Kulturmedier med vækstfaktorer. Først forberede 1 mL af Crypt Kulturmedier uden vækstfaktorer. Tilføje 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (slutkoncentration 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL Noggin (slutkoncentration 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (slutkoncentration 500 ng/mL) og 0,5 µL 100 µg/mL EGF (slutkoncentration 50 ng/mL).
- Krypten isolation
- Sted solubilized basalmembranen ekstrakt (Se Tabel af materialer) på isen for at tø før begyndelsen.
Bemærk: Hold basalmembranen på is eller det vil polymerisere. - I overensstemmelse med institutionelle Animal Care og brug Udvalget protokol for mus større end 14 dage gammel, aflive mus med to metoder af eutanasi med andet er en fysisk procedure at sikre død.
Bemærk: For mus under 14 dage gammel, halshugning er den normale procedure ved hjælp af saks. - Ved hjælp af saks og pincet, lave et lodret snit ned midterlinjen af maven gennem huden og bughinde, for hele længden af maven. Punktafgifter tyndtarmen fra maven til coecum med saks og fjerne mesenterium med pincet.
Bemærk: To-uge-forhenværende mandlige og kvindelige C57BL/6J mus pups, hver vejer 5,5-7 g, blev brugt til krypten isolation. Enhver alder eller størrelse musen kan bruges til krypten isolation. - At forberede friskhøstede tyndtarmen til krypten isolation, stilling tarmen straight, og skær tarmen langs langs hele sin længde ved hjælp af saks.
Bemærk: Mus og human tarmen kan tilberedes på samme måde. - Ren afføring ud af tarmen ved forsigtigt ryste tarmen frem og tilbage i en PBS-antibiotikum blanding-fyldt petriskål med pincet.
- Der tilsættes 30 mL af celle forstyrrelser Media #1 til en 50 mL konisk slange. Skær tarmen i 0,5 cm længde stykker direkte ind i røret. Angive rør i en isspand og forsigtigt agitere på shaker ved laveste hastighed i 15 min.
- Mens væv er på shaker, få 24 eller 48 godt plader for at vokse Krypter, hvis enteroids skal bruges til RNA, DNA eller protein isolation. Brug 8-godt kammer dias til at vokse Krypter, hvis enteroids der skal anvendes for hele montere Konfokal billeddannelse.
- Tilføj 15 µL af basalmembranen til bunden af hver brønd af 24 eller 48 godt plade i hætten. Hvis bruger kammer dias, skal du tilføje 9 µL af basalmembranen til bunden af hver afdeling.
Bemærk: Justere lydstyrken af basalmembranen efter størrelsen af plade hvis nødvendigt. - Hurtigt sprede basalmembranen med pipette tip, så basalmembranen danner et tyndt lag på bunden af brønden. Pladen anbringes ved 37 ° C i inkubatoren for 30 min til at tillade basalmembranen at polymerisere.
Bemærk: Krypter vil ikke vedhæfte hvis basalmembranen ikke er et tyndt lag eller hvis basalmembranen indeholder luftbobler. - Efter 15 min på en shaker, filtrere vævet gennem en 100 µm si. Kassér flow gennem.
- Der tilsættes 30 mL celle forstyrrelser Media #2 til en ny 50 mL konisk slange. Fjern væv fra si og tilføje til røret.
- Angive rør i en isspand og forsigtigt agitere på shaker ved laveste hastighed i 15 min.
- Efter 15 min på shaker, filtrere væv gennem en 100 µm si. Holde flow igennem på dette trin, hvis udbyttet er lavt i senere trin.
Bemærk: Alle flow gennem rør skal holdes på is. - Tilsættes 15 mL DMEM med 4,5 g/L glukose og L-glutamin til en ny 50 mL konisk slange. Fjern væv fra si og tilføje til røret. Energisk ryste røret ved håndkraft for 10 s. Filter gennem en 100 µm si og indsamle gennemstrømningen. Gentag indtil strømmen gennem indeholder ingen partikler.
- I hætten, filtrere gennemstrømningen fra forrige trin til en ny 50 mL konisk tube bruger 70 µm sier for musen væv eller 100 µm sier for humant væv.
Bemærk: Har ekstra sier på standby, og hæld langsomt da sier vil tilstoppe med snavs. - Der centrifugeres tube på 200 x g for 8 min. ved 4 ° C og sted direkte i en isspand i hætten. Fjern supernatanten ved pipette uden at forstyrre pelleten. Resuspend pellet med samlede ønskede mængde af Crypt Kulturmedier uden vækstfaktorer.
Bemærk: Beriget Krypter er den 'sand' lag af toerstoffet. Hver kræver godt 250 µL af Crypt Kulturmedier uden vækstfaktorer.
- Sted solubilized basalmembranen ekstrakt (Se Tabel af materialer) på isen for at tø før begyndelsen.
- Etablering af enteroids
- Plade krypt media blanding direkte på basalmembranen.
- Kontrollere Krypter med et mikroskop for at sikre isoleret proces var vellykket.
Bemærk: Celler og kugler af celler er ønsket. Ca. 100 individuelle crypts er forgyldt pr. brønd. - Inkuber plade ved 37 ° C til 3 h til at tillade crypts at tiltræde basalmembranen.
Bemærk: Denne inkubation er med krypt Kulturmedier uden vækstfaktorer. - Langsomt fjerne medier og overskydende Krypter, der kunne ikke tilknyttes ved hjælp af en P-200 pipette.
Bemærk: Forstyr ikke basalmembranen, som vedlagte Krypter kan blive forskubbet. - Langsomt tilføje 250 µL af de krypt Kulturmedier med vækstfaktorer til hver brønd.
Bemærk: For 24-48-godt plader eller kammer dias, 250 µL af Crypt Kulturmedier med vækstfaktorer er tilstrækkeligt. - Erstatte medierne hver 2 dage med friske krypt Kulturmedier med vækstfaktorer i 5 dage før behandlinger til at tillade optimal vedhæftet fil og vækst.
2. mus bryst mælk samling
- Adskille en C57BL/6J ammende dam på postpartum 7-12 dage fra sine unger i 6 timer før malkning.
- Bedøver den ammende dam med isofluran via en næsen kegle og administrere en subkutan injektion af oxytocin på 0,15 IU/kg kropsvægt. Vent 3 min før du forsøger malkning procedure.
- Ren patter med 70% ethanol før malkning procedure og lad tørre.
- Uddrag mælk fra patterne én ad gangen ved hjælp af en elektrisk menneskelige brystpumpe med silikoneslanger dimensioneret til at passe mus patter ind i et 5 mL collection tube.
Bemærk: Optimale brystpumper har to indstillinger, en for hastighed og én til suge. Det er bedst at starte med de laveste indstillinger af hver og øge både langsomt, indtil mælken er udvundet. Ideelt, samlede afkast vil være ~ 500 µL - 1 mL mus bryst mælk pr. lakterende dam. - Straks alikvot modermælk og opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Undgå at fryse/tø cykler. - Behandle enteroids på dag 5 med 50 µL/mL af musen modermælk pr. mL af Crypt Kulturmedier med vækstfaktorer i 24 timer ved 37 ° C.
3. hele montere farvning af Enteroids
-
Forberedelse af reagenser
- Forberede 16 mL 1 x PBS pr. 8 brønde.
- Forberede 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS pr. 8 brønde.
- Forberede 2 mL 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS pr. 8 brønde.
- Forberede 24 mL PBS Tween (PBST er 0,1% Tween 20 i 1 x PBS) pr. 8 brønde.
- Forberede 2 mL 10% normal æsel serum (NDS) i 0,1% PBST (10% NDS/PBST) pr. 8 brønde.
- Forbered 4 mL 1% NDS i 0,1% PBST (1% NDS/PBST) pr. 8 brønde.
-
Farvning dag 1
- Opsug af behandlinger og vaske enteroids med PBS. Tilsæt 250 µL 4% PFA pr. brønd. Sted på rotator i 1-2 timer ved 4 ° C. Fjern 4% PFA med pipette.
- Vask 4 gange med 250 µL/brønd 1 x PBS. Sted på rotator i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Det er muligt at gemme plade for 1-2 dage ved 4 ° C, hvis det er nødvendigt. - Tilføje 250 µL/brønd 0,1% Triton X-100. Inkuber i 1 time på RT. Fjern 0,1% Triton X-100 med pipette.
- Vask 4 gange med 250 µL/brønd 1 x PBS. Sted på rotator for 15 min på RT.
- Tilføje 250 µL/brønd 10% NDS/PBST. Inkuber i 45 min. ved RT. Fjern 10% NDS/PBST med pipette.
- Tilsættes 250 µL/brønd primære antistof, fortyndet 1/250 i 1% NDS/PBST, og der inkuberes natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Den optimale antistof fortynding varierer alt efter producenten.
-
Farvning dag 2
- Vask på mindst 5 gange for 4-5 h med 250 µL/brønd PBST. Sted på rotator ved 4 ° C mellem hver vask.
- Tilføje 250 µL/brønd sekundær antistof, fortyndet 1/1.000 i 1% NDS/PBST. Wrap pladen i folie og inkuberes natten over ved 4 ° C.
-
Farvnings-dag 3
- Tilføje 250 µL/brønd nukleare pletten 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 15 min.
Bemærk: Holde pladen i mørke. - Vask 6 gange med 250 µL/brønd PBST. Sted på rotator i 10 min. ved 4 ° C mellem hver vask.
- Mount coverslip på kammer skub med montering medier.
- Tage billeder med en 40 X objektive Konfokal mikroskop og lige så render i en raster grafik editor (Se Tabel af materialer).
- Tilføje 250 µL/brønd nukleare pletten 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Først søgte vi at undersøge om udtrykt modermælk eller pasteuriseret donor modermælk havde en effekt på lille tarm enteroids. Faktisk, modermælk og donor modermælk øget vækst af neonatal mus (figur 1A) og tidlig menneskelige afledte enteroids (figur 1B).
Da modermælk øget vækst af små tarm enteroids, undersøgte vi næste hvis modermælk havde en virkning på spredning af for tidlig menneskelige enteroids. Vi demonstrere, at modermælk øger spredningen af for tidlig menneskelige enteroids i forhold til kontrol (figur 2A-B, Ki67, røde pletter). Vigtigere, øget menneskelige donor modermælk også enteroid spredning i forhold til kontrol, men i lidt mindre grad end ikke-pasteuriseret modermælk (figur 2B-C). Vi næste evalueres udtrykket Ki67 mRNA i den tidlig menneskelig enteroids og opdagede at Ki67 blev øget i enteroids behandlet med enten modermælk eller donor modermælk i forhold til kontrol (figur 2D).
Dernæst ønskede vi at se, om disse effekter var artsspecifikke med hensyn til modermælk. Vi udviklet en måde at indsamle modermælk fra ammende mus ved hjælp af en modificeret kommercielt tilgængelige menneskelige brystpumpe som henvisninger11,12. Afbildet er en bedøvede ammende dam gennemgår mælk samling bruger denne enhed (figur 3). Den næste række eksperimenter blev udført på mus enteroids og vi evalueret spredning virkningerne af udmalket mælk fra mus, menneskelige eller donor modermælk. Som vist i figur 4, mus, menneskelige, og pasteuriseret donor bryst mælk øget spredning i mus enteroids i forhold til kontrol (figur 4A-D). Spredning i mus enteroids var faldet i nærværelse af TLR4 liganden, LPS (LPS), i forhold til kontrol (figur 4A, E). Vigtigere, mus, menneskelige eller donor bryst mælk alle restaureret enteroid spredning i overværelse af LP'ER som påvist ved øget Ki67 farvning i forhold til LP'ER alene (figur 4F-H).
Fra vores eksperimenter viser vi, at små tarm enteroids afledt af neonatal mus og tidlig menneskelige føtal tarmen kan opretholdes i kultur. Vi leverer yderligere en roman bryst mælk samling metode, der giver en effektiv måde at udtrække modermælk fra mus, som derefter kan bruges til forskellige eksperimenter. Vi opdagede, at udmalket mælk fra mennesker eller mus øget størrelse, vækst og spredning i mus og menneskelige enteroids. Desuden, mus, menneskelige og donor modermælk restaureret enteroid spredning efter LPS eksponering. Dette tyder på, at modermælk kan udøve anti-inflammatoriske virkninger på tyndtarmen af mus og mennesker.
Figur 1. Modermælk og donor modermælk øge størrelsen og vækstraten af mus og tidlig menneskelig enteroids. Mikrofotografier af lille tarm enteroids fra neonatal mus (p14) eller for tidlig human tarmen behandlet med enten medier (kontrol), modermælk eller donor modermælk (50 µL/mL) for 24 h. størrelse bar: 1.000 µm. venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Modermælk og donor modermælk øge udbredelsen af for tidlig menneskelig enteroids. (A) Konfokal micrographs af for tidlig menneskelig enteroids kulturperler for 5 dage, behandlet med modermælk og pasteuriseret donor modermælk i 24 timer og farves for spredning markør Ki67 (rød) og DAPI (nuklear, blå). Størrelse bar: 50 µm. (B) qRT-PCR for Ki67 udtryk for menneskelige enteroids i forhold til husholdning gen RPLO. n = 5 pr. gruppe. p < 0.0001 sammenligninger med Student t -test i forhold til kontrol. Data er gennemsnit ± standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Indsamling af mælk fra en bedøvede mus ved hjælp af en modificeret menneskelige brystpumpe. Sterile menneskelige bryst pumpe slangen placeret på patter bedøvede ammende Dam efter at have modtaget oxytocin injektion. Musen mælk er indsamlet ved hjælp af den menneskelige brystpumpe på medium hastighed og kraft i en 5 mL collection tube. Kollektive diskenheder udvundet fra alle patter spænder fra 500 µL til 1 mL per musen på postnatal dage 7-12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mus, menneskelige, og pasteuriseret donor modermælk forbedre mus enteroid spredning. (A-H) Konfokal micrographs af p14 lille tarm mus enteroids (kontrolelementer,)behandlet med musen modermælk (kød-og benmel, B), modermælk (BM, C), eller menneskelige donor modermælk (DBM, D) i 50 µL/mL af medier til 12 h i fravær ( A-D) eller tilstedeværelsen af LPS (LPS) i en dosis på 25 µg/mL af medier til 12 h, (E-H) og farvede for spredning markør Ki67 (rød) og DAPI (nuklear, blå). Størrelse bar: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intestinale epitel består af mange cellulære undertyper, der er ansvarlige for at levere vært forsvar mod patogener, opretholde gut barriere integritet, og kan brydes i patogenesen af flere sygdomme. Mens dyremodeller kan sammenfatte nogle facetter af sygdommen, giver ex vivo -model af enteroids stammer fra tyndtarmen af mus og mennesker en platform for at teste effekten af forskellige behandlinger. Betydningen af enteroid modellen gør det muligt for forskere at kultur og differentiere intestinal stamceller i alle epitelial cellulære undertyper fra naiv eller syge dyr og mennesker, ikke der er tilgængelige med eksisterende metoder. Denne modelsystem kan bruges til infektioner med menneskelige patogener, der ikke kan umiddelbart oversættes til musen, såsom enterovirus25 eller norovirus26 blandt andre. Enteroid modellen har flere fordele og anvendelser; dog skal sørges at sikre sammenhæng i de reagenser, der bruges til at gøre medierne og de specifikke eksogene vækstfaktorer, der er nødvendige for overlevelsen af enteroids.
Inden for enteroid modellen er flere trin af afgørende betydning at sikre succes i at producere enteroids. For at minimere kolde iskæmisk tid, bør væv behandles hurtigt. Enteroids kan produceres op til 24 timer, når vævet er høstet hvis vævet placeres i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium ved 4 ° C. Dette kan lette mulighed for forsendelse eller transport, hvis det er nødvendigt. For etablering af enteroids, skal basalmembranen være en tynd, flad lag i bunden af hver brønd for Krypter vedhæfte og vokse. Hvis basalmembranen ikke er flad eller har bobler stede, Krypter kan ikke overholde og vil blive fjernet, når medierne er ændret. Efter at enteroids er etableret, kan de passaged hver 7 dage eller frosset i flydende nitrogen til langtidsopbevaring. Fjernelse og tilføjelse af Crypt Kulturmedier med vækstfaktorer og administrationen af hver behandling skal ske langsomt og til kanten af hver brønd, at forstyrre enteroids. Afbrydelse af enteroids kan få dem til at blive skilt og vasket bort, da medierne er ændret. For de bedste resultater, bør der udvises forsigtighed at bevare integriteten af basalmembranen og den vedlagte enteroids.
I den aktuelle undersøgelse meddele vi, at enteroids stammer fra neonatal mus og for tidligt fødte børn kan vokse og formere sig i nærværelse af forskellige typer af modermælk. Disse undersøgelser fremme vores forståelse af virkningerne af modermælk på for tidlig tarmen. Vi giver en detaljeret metode om hvordan at etablere enteroid kulturer i laboratoriet fra mennesker og mus. Derudover viser vi en effektiv metode til indsamling modermælk fra en ammende mus ved hjælp af en modificeret elektrisk menneskelige brystpumpe. Vi viser denne mus, menneskelige, og pasteuriseret donor modermælk styrke vækst og spredning af enteroids fra mus og mennesker. Derudover viser vi nedsat enteroid spredning i nærværelse af den TLR4 ligand LP'ER, som blev restaureret når musen, menneskelige eller donor modermælk blev administreret til enteroids. Fremtidige ansøgninger kan omfatte personlige præcision medicin med høj overførselshastighed drug skærme på enteroids fremstillet af spædbørn efter tarm resektion at se, hvordan visse former for medicin kan påvirke det særlige spædbarn. Taget sammen, vi håber andre laboratorier vil finde potentielle succes i at udnytte disse teknikker i mange forskellige riger af pædiatriske sygdomme i tarmen, herunder NEC, hvor der er et presserende kliniske behov for at udvikle nye terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har noget at afsløre og ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
MG er støttet af tilskud K08DK101608 og R03DK111473 fra den National Institutes of Health, marts af Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, børnenes Discovery Institute of Washington University og St. Louis children's Hospital og Institut for Pædiatri på Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL er understøttet af R01DK104946 (PI: Silverman), børnenes Discovery Institute of Washington University og St. Louis children's Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
