Summary
Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di cultura enteroid da mouse neonatale o prematura intestino umano così come un metodo efficace per raccogliere il latte dai topi.
Abstract
Enteroids intestinale piccolo umano sono derivate dalle cripte e quando coltivate in una nicchia staminale contengono tutti i tipi delle cellule epiteliali. La capacità di stabilire sistemi di coltura ex vivo enteroid umano sono importanti di patofisiologia intestinale di modello e di studiare il particolare risposte cellulari coinvolti. Negli ultimi anni, enteroids da topi e gli esseri umani sono in coltura, secondarie e sopraelevate distanza per un utilizzo futuro in diversi laboratori in tutto il mondo. Questa piattaforma di enteroid può essere utilizzata per testare gli effetti di vari trattamenti e farmaci e quali effetti sono esercitati sui tipi differenti delle cellule nell'intestino. Qui, un protocollo per stabilire primari derivati da cellule staminali piccolo enteroids intestinale derivato dai topi neonatali e prematuro intestino umano è fornito. Inoltre, questo sistema di coltura di enteroid è stato utilizzato per testare gli effetti del latte materno specie-specifici. Latte materno del mouse può essere ottenuto in modo efficiente utilizzando una pompa di seno umano modificate e latte espresso del mouse può essere utilizzato quindi per ulteriori esperimenti di ricerca. Ora dimostriamo gli effetti del mouse espresso, umano, e latte materno donato sulla crescita e sulla proliferazione di enteroids derivati da topi neonatali o intestino tenue umano precoce.
Introduction
Enterocolite necrotizzante (NEC) è la principale causa di morte per malattie gastrointestinali in bambini prematuri, che interessano quasi 1 in 10 neonati nati prima delle 29 settimane gestazione1,2,3. Metà degli infanti con progresso NEC per la forma più grave, dove la sopravvivenza è solo 10-30%4,5. Negli Stati Uniti, circa 2 miliardi di USD/anno sono spesi nel trattamento di neonati con NEC6,7, eppure terapia né il tasso di sopravvivenza è cambiato nel corso degli ultimi 30 anni. La patogenesi di NEC è caratterizzata dalla lesione intestinale e alterata mucosa guarigione8,9,10,11, tuttavia, le vie di segnalazione che portano a un esacerbato meccanismi per invertire l'infiammazione e la risposta infiammatoria rimangono in modo incompleto capiti.
La somministrazione di latte materno umano è stata trovata per essere la strategia solo protettiva contro NEC per bambini prematuri. Precedentemente abbiamo indicato che il latte materno protegge dallo sviluppo di NEC attraverso l'inibizione del recettore toll-like receptor immune innata 4 (TLR4) nell'epitelio intestinale attraverso il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) signaling pathway11. Il completamento del latte materno per una formula sperimentale di NEC ha attenuato la risposta infiammatoria vista in NEC come dimostrato dall'inibizione dell'apoptosi degli enterociti e restauro di proliferazione degli enterociti in un modo che era dipendente da sviluppo epidermico Factor (EGF) ed EGFR11. In un altro studio, è stato dimostrato che nitrato, un altro componente del latte materno, contribuisce alla sua natura protettiva modulando l'aspersione intestinale, rispetto al latte artificiale, che è carente di nitrato e può contribuire alla frequenza aumentata di NEC in Formula infanti alimentati12,13. Altri composti presenti nel latte materno che sono stati indicati per essere coinvolti nella protezione contro NEC includono gli oligosaccaridi del latte umano, L-arginina, glutamina e lattoferrina14,15,16, 17,18,19. Questi elementi benefici del latte materno rivelano la necessità del suo utilizzo nella prevenzione del NEC, ma anche sottolineano l'importanza di studiare i meccanismi, i percorsi e gli effetti cellulari coinvolte nel come il latte materno è mediare la protezione contro il NEC di segnalazione .
In ordine per studiare ulteriormente le proprietà protettive del latte materno in un modello murino di NEC, abbiamo sviluppato una tecnica di romanzo, facile da usare di mouse che il latte materno può essere estratta da una diga anestetizzata usando un seno umano elettrica pompa11,12 . Questa strategia di acquisizione di latte materno del mouse è vantaggiosa, non solo perché pompe del seno umano sono prontamente disponibili ed efficienti nell'approvvigionamento di latte materno, ma anche perché permette questo metodo di analisi del latte al seno specie-specifici. Di conseguenza, abbiamo possibile confrontare gli effetti del latte materno del mouse con quelle del latte materno umano espresso così come donatore umano latte pastorizzato di una banca del latte nei modelli specifici della specie. Questa tecnica consente lo studio dei componenti di latte del seno in relazione al loro contributo alla prevenzione di NEC. Altri ricercatori hanno sviluppato metodi di estrazione del latte materno, tuttavia, queste tecniche sono manuali e in genere richiedono più di un laboratorio membri20,21,22. Qui è presentata una tecnica semplice che può essere utilizzata modificando un tiralatte elettrico umano per raccogliere il latte da un mouse. Questa tecnica può essere applicata anche ad altre specie.
Per interrogare adeguatamente le vie di segnalazione coinvolte con NEC, sono necessari sistemi di modello per valutare tutti i tipi differenti delle cellule, noti per essere interessati nel processo di malattia. Qui, discutiamo uno tale sistema modello - enteroids - e della loro istituzione da mouse e intestino tenue umano. Enteroids intestinale umano (HIEs) forniscono in particolare promessa significativa, perché offrono un innovativo, geneticamente vario ex vivo modello umano per aiutare nello studio dei processi patofisiologici che avvengono nel tratto gastrointestinale 23. Enteroids sono stati trovati per essere coltivato a lungo termine e può essere congelato per più tardi uso23, e a differenza di Organoids intestinale umano (HIOs), cui culture sono sviluppate da cellule staminali pluripotenti inducibile, enteroids vengono generati da cellule staminali all'interno di cripte intestinali isolato24. Enteroids richiede meno manutenzione, può essere infettato rapidamente25e possono essere create facilmente poiché cripte intestinali sono più differenziati oltre HIOs23. Di conseguenza, HIEs offrono molti vantaggi rispetto alle tecniche esistenti perché possono essere sviluppati per esporre le proprietà specifiche dell'area compositiva e funzionale dell' epitelio gastrointestinale umano23. L'uso di enteroids è una scelta altamente efficace quando hanno bisogno di un modello umano dell'intestino, con l'osservanza delle limitazioni di regione-specific e facilità d'uso. Qui dimostriamo la tecnica di isolare e mantenere primari derivati da cellule staminali piccolo intestinale enteroids da topi e bambini prematuri umani.
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Protocol
Tutte le procedure di animale in questo studio sono state approvate dall'Università di Washington a St. Louis istituzionale Animal Care e uso Comitato (protocollo 20160187) o uso Comitato (protocollo 14103918) e Università di Pittsburgh istituzionali cura degli animali. Intestino tenue umano fetale a meno di 24 settimane di gestazione è stata ottenuta in conformità degli orientamenti di appalti tessuto anatomico Università di Pittsburgh dopo approvazione Institutional Review Board (protocollo PRO14100537) presso l'Università di Banca di tessuti di Pittsburgh salute Scienze attraverso un sistema onesto mediatore. De-identificati latte umano o latte materno pastorizzato donatore è stato ottenuto con una rinuncia di consenso da parte dell'Università di Pittsburgh Institutional Review Board.
1. cripta isolamento e istituzione di Enteroids da topi neonatali o intestino tenue umano precoce
- Preparazione dei terreni
Nota: Media dovrebbe essere preparato nella cappa il giorno prima isolamento cripta.- Preparare terreni di coltura L 1,11. Iniziare con 1 L esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosio e L-Glutammina e aggiungere 110 mL siero bovino fetale (FBS) (concentrazione finale 10%), 11 mL penicillina-streptomicina (1% di concentrazione finale) e 1,1 mL sterile insulina (finale concentrazione 0,1%).
- Preparare 500 mL di miscela di PBS-antibiotico. Iniziare con 500 mL 1 x soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) con 10% FBS e aggiungere 5 mL di gentamicina (concentrazione finale 1%), amfotericina B (concentrazione finale 0,2%), da 1 mL e 5 mL penicillina-streptomicina (1% di concentrazione finale).
- Preparare 30 mL cella perturbazione Media #1. In primo luogo preparare 30 mL di coltura. Aggiungere acido di 600 µ l 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione finale di 10 mM), 300 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%).
- Preparare 30 mL cella perturbazione Media #2. In primo luogo preparare 30 mL di coltura. Aggiungere 300 µ l 0,5 M EDTA (concentrazione finale di 5 mM), 300 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%).
- Preparare terreni di coltura 50ml cripta senza fattori di crescita. Misurare 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 e aggiungere 10 mL FBS (concentrazione finale 20%).
- Aggiungere 500 µ l penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%), 500 µ l L-Glutammina (concentrazione finale 1%), 500 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%), 100 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%), 2,5 µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane acido solfonico (HEPES) (concentrazione finale 0,05 mM), 500 µ l 100 mM N-acetilcisteina (concentrazione finale di 1 mM), 500 µ l 100 x N-2 supplemento, 1 mL 50 x privo di siero supplemento (ad esempio, B-27) meno vitamina A e 500 µ l 1 mM 100 x Y-27632.
- Preparare 1 mL di coltura di cripta con fattori di crescita. In primo luogo preparare 1 mL della cripta di coltura senza fattori di crescita. Aggiungere 2,5 µ l 40 µ g/mL Wnt3a (concentrazione finale 100 ng/mL), 1 µ l 100 µ g/mL Noggin (concentrazione finale 100 ng/mL), 2 µ l 250 µ g/mL R-Spondin (concentrazione finale 500 ng/mL) ed EGF di 0,5 µ l 100 µ g/mL (concentrazione finale di 50 ng/mL).
- Isolamento della cripta
- Posto solubilizzato Estratto di membrana dello scantinato (Vedi Tabella materiali) sul ghiaccio per scongelare prima di iniziare.
Nota: Polimerizzerà della membrana dello scantinato di tenere il ghiaccio o si. - In conformità con il protocollo istituzionale Animal Care e uso Comitato per topi superiori a 14 giorni di età, eutanasia topi con due metodi di eutanasia con la seconda essendo una procedura per garantire la morte fisica.
Nota: Per i topi sotto i 14 giorni di età, decapitazione è la procedura standard, usando le forbici. - Con delle forbici, pinze, praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per tutta la lunghezza dell'addome. Asportare il piccolo intestino dallo stomaco all'intestino cieco con le forbici e rimuovere il mesentere con le pinzette.
Nota: Due-settimana-vecchio maschio e femmina C57BL/6J mouse pups, ogni peso di 5,5-7 g, sono stati utilizzati per l'isolamento di cripta. Qualsiasi età o dimensione del mouse può essere utilizzato per l'isolamento di cripta. - Preparare appena raccolte nell'intestino tenue per l'isolamento di cripta, intestino posizione diritta, e tagliare l'intestino longitudinalmente lungo tutta la sua lunghezza usando le forbici.
Nota: Mouse e intestino umano possono essere preparati allo stesso modo. - Sgabello pulito fuori intestino agitando delicatamente l'intestino in avanti e indietro in una capsula Petri miscela di PBS-antibiotico-riempito usando il forcipe.
- Aggiungere 30 mL di cella perturbazione Media n. 1 a una provetta conica da 50 mL. Tagliare l'intestino in pezzi di lunghezza di 0,5 cm direttamente nella provetta. Impostare il tubo in un secchio di ghiaccio e agitare delicatamente su agitatore a velocità più basse per 15 min.
- Mentre i tessuti sono sull'agitatore, ottenere 24 o 48 pozzetti piastre per crescere cripte se il enteroids devono essere utilizzati per l'isolamento di proteine, DNA o RNA. Uso camera 8 pozzetti diapositive a crescere cripte se il enteroids devono essere utilizzati per intero montare imaging confocale.
- Nella cappa, aggiungere 15 µ l della membrana dello scantinato nella parte inferiore di ciascun pozzetto della piastra 24 o 48 pozzetti. Se utilizzando camera diapositive, aggiungere 9 µ l della membrana dello scantinato alla parte inferiore di ogni camera.
Nota: Regolare il volume della membrana dello scantinato in base alle dimensioni della piastra se necessario. - Si diffuse rapidamente la membrana dello scantinato con la punta della pipetta in modo che la membrana dello scantinato forma uno strato sottile sul fondo del pozzo. Posizionare la piastra a 37 ° C in incubatrice per 30 minuti consentire la membrana dello scantinato polimerizzare.
Nota: Le cripte non verranno collegato se non uno strato sottile della membrana dello scantinato è o se membrana basale contiene bolle d'aria. - Dopo 15 minuti su un agitatore, filtrare il tessuto attraverso un colino di 100 µm. Scartare il flusso attraverso.
- Aggiungere 30 mL cella perturbazione Media n. 2 una nuova provetta conica 50 mL. Rimuovere il tessuto dal setaccio e aggiungere alla provetta.
- Impostare il tubo in un secchio di ghiaccio e agitare delicatamente su agitatore a velocità più basse per 15 min.
- Dopo 15 minuti sull'agitatore, filtro tessuto attraverso un colino di 100 µm. Mantenere il flusso attraverso a questo punto, nel caso in cui il rendimento è basso nei passaggi successivi.
Nota: Tutto il flusso attraverso i tubi dovrà essere tenuto al ghiaccio. - Aggiungere 15 mL DMEM con 4,5 g/L glucosio e L-glutammina ad un nuovo tubo conico di 50 mL. Rimuovere il tessuto dal setaccio e aggiungere alla provetta. Vigorosamente agitare il tubo a mano per 10 s. filtro attraverso un colino di 100 µm e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere fino a quando il flusso attraverso non contiene particolato.
- Nella cappa, filtrare il flusso attraverso il passaggio precedente in una nuova provetta conica 50 mL utilizzando 70 µm colini per mouse tessuto o 100 µm colini per tessuto umano.
Nota: Avere filtri supplementari in standby e versare lentamente come filtri si intasano con detriti. - Centrifugare la provetta a 200 x g per 8 min a 4 ° C e posto direttamente in un secchio di ghiaccio nella cappa. Eliminare il surnatante mediante pipetta senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet con totale quantità desiderata di cripta cultura Media senza fattori di crescita.
Nota: Le cripte arricchite sono lo strato 'sabbioso' del pellet. Ognuno richiede ben 250 µ l di cripta cultura Media senza fattori di crescita.
- Posto solubilizzato Estratto di membrana dello scantinato (Vedi Tabella materiali) sul ghiaccio per scongelare prima di iniziare.
- Stabilimento di enteroids
- La miscela di media cripta direttamente sulla membrana basale della piastra.
- Verifica cripte con un microscopio per garantire isolamento processo è stato completato.
Nota: Sfere delle cellule e le cellule sono desiderate. Circa 100 singoli cripte sono placcati per pozzetto. - Incubare la piastra a 37 ° C per 3 h per consentire cripte di aderire alla membrana basale.
Nota: al termine dell'incubazione è con cripta cultura Media senza fattori di crescita. - Rimuovere lentamente il media e cripte in eccesso che non è riuscito a collegare utilizzando una pipetta P-200.
Nota: Non disturbare la membrana basale come le cripte associate possono diventare sloggiate. - Lentamente aggiungere 250 µ l di cripta cultura Media con fattori di crescita ad ogni pozzetto.
Nota: Per 24-48 pozzetti, o camera scivoli, 250 µ l di cripta cultura Media con fattori di crescita è sufficiente. - Sostituire i media ogni 2 giorni con fresco cripta cultura Media con fattori di crescita per 5 giorni prima trattamenti per consentire per la crescita e fissaggio ottima.
2. Mouse raccolta per latte materno
- Separare una diga che allattano C57BL/6J al post-partum 7-12 giorni da suoi cuccioli per 6 h prima della mungitura.
- Anestetizzare la diga in allattamento con isoflurano tramite un cono di naso e somministrare un'iniezione sottocutanea di ossitocina a 0,15 UI/kg di peso corporeo. Aspettare 3 minuti prima di tentare la procedura di mungitura.
- Pulire le tettarelle con etanolo al 70% prima della procedura di mungitura e lasciare asciugare.
- Estrarre il latte dal tettarelle uno alla volta utilizzando una pompa di seno umano con tubazione del silicone ridimensionata di tettarelle del mouse in una provetta di raccolta di 5 mL.
Nota: Ottimale del seno pompe hanno due impostazioni, uno per la velocità e uno per l'aspirazione. Si consiglia di iniziare con le impostazioni più basse di ciascuno e aumentare entrambi lentamente fino a quando il latte viene estratto. Idealmente, la resa totale sarà ~ 500 µ l - 1 mL di latte materno del mouse per diga durante l'allattamento. - Latte materno immediatamente aliquotare e conservare a-80 ° C.
Nota: Evitare di gelo/disgelo cicli. - Trattare enteroids il giorno 5 con 50 µ l/mL di latte materno del mouse / mL di terreni di coltura di cripta con fattori di crescita per 24 h a 37 ° C.
3. tutto montare macchiatura di Enteroids
-
Preparazione dei reagenti
- Preparare 16 mL di PBS 1X a 8 pozzetti.
- Preparare 2 mL 4% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS a 8 pozzetti.
- Preparare 2 mL 0,1% Triton X-100 in 1X PBS a 8 pozzetti.
- Preparare 24 mL PBS Tween (PBST è 0.1% Tween 20 in 1X PBS) a 8 pozzetti.
- Preparare 2 mL 10% donkey normale siero (NDS) in 0,1% PBST (10% NDS/PBST) a 8 pozzetti.
- Preparare 4 mL 1% NDS nello 0,1% PBST (1% NDS/PBST) a 8 pozzetti.
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1 ° giorno di colorazione
- Aspirare i trattamenti e lavare enteroids con PBS. Aggiungere 250 µ l 4% PFA per pozzetto. Posizionare il rotatore per 1-2 ore a 4 ° C. Rimuovere i 4% PFA con pipetta.
- Lavare 4 volte con 250 µ l/pozzetto 1 x PBS. Posizionare il rotatore per 10 min a temperatura ambiente (TA).
Nota: È possibile memorizzare piastra per 1-2 giorni a 4 ° C se necessario. - Aggiungere 250 µ l/pozzetto 0.1% Triton X-100. Incubare per 1 h a RT. Remove 0.1% Triton X-100 con pipetta.
- Lavare 4 volte con 250 µ l/pozzetto 1 x PBS. Posizionare il rotatore per 15 minuti a TA.
- Aggiungere 250 µ l/pozzetto 10% NDS/PBST. Incubare per 45 min a RT. Remove 10% NDS/PBST con pipetta.
- Aggiungere 250 µ l/pozzetto primaria dell'anticorpo, diluito 1/250 a 1% NDS/PBST e incubare per una notte a 4 ° C.
Nota: La diluizione di anticorpo ottimale varia a seconda del produttore.
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Giorno 2 di colorazione
- Lavare almeno 5 volte per 4-5 h con 250 µ l/pozzetto PBST. Mettere sull'agitatore a 4 ° C tra ogni lavaggio.
- Aggiungere 250 µ l/pozzetto secondaria dell'anticorpo, diluito 1/1.000 a 1% NDS/PBST. Avvolgere la piastra in un foglio e incubare per una notte a 4 ° C.
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3 ° giorno di colorazione
- Aggiungere 250 µ l/pozzetto nucleare macchia 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per 15 min.
Nota: Tenere la piastra al buio. - Lavare 6 volte con 250 µ l/pozzetto PBST. Posizionare il rotatore per 10 min a 4 ° C tra ogni lavaggio.
- Vetrino coprioggetti Mount sulla camera slide con supporti di montaggio.
- Prendere le immagini con un 40x microscopio confocale oggettivo e ugualmente il rendering in un editor di grafica raster (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 250 µ l/pozzetto nucleare macchia 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per 15 min.
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Representative Results
Abbiamo innanzitutto cercato di indagare se espresso latte materno o latte materno pastorizzato donatore ha avuto un effetto sul piccolo enteroids intestinale. Infatti, latte materno e latte materno donato ha aumentato la crescita del mouse neonatale (Figura 1A) e prematuro umana derivata enteroids (Figura 1B).
Dal momento che il latte materno ha aumentato la crescita del piccolo enteroids intestinale, abbiamo studiato successiva se il latte materno ha avuto un effetto sulla proliferazione di prematura enteroids umana. Dimostriamo che il latte materno aumenta la proliferazione di enteroids prematuro umano rispetto al controllo (Figura 2A–B, Ki67, colorazione rossa). D'importanza, latte materno umano donato anche enteroid la proliferazione aumentata rispetto al controllo, ma in misura leggermente minore rispetto al latte materno umano non pastorizzata (Figura 2B–C). Successivamente abbiamo valutato l'espressione di Ki67 mRNA nella prematura enteroids umana e scoperto che Ki67 era aumentato a enteroids trattati con latte materno o latte materno donato rispetto al controllo (Figura 2D).
Successivamente, abbiamo voluto vedere se questi effetti fossero specie-specifici per quanto riguarda il latte materno. Abbiamo sviluppato un modo per raccogliere il latte materno da allattamento topi utilizzando una pompa di seno umano disponibile in commercio modificate come riferimenti11,12. Raffigurato è una diga che allattano anestetizzata in fase di raccolta del latte utilizzando questo dispositivo (Figura 3). La successiva serie di esperimenti è stata eseguita su mouse enteroids e abbiamo valutato gli effetti di proliferazione del latte materno espresso dal latte materno o del mouse, umani o donatore. Come illustrato nella Figura 4, mouse, umano, e latte materno pastorizzato donatore proliferazione aumentata nel enteroids del mouse rispetto al controllo (Figura 4A–D). Proliferazione nel enteroids del mouse è stata diminuita in presenza di ligando TLR4, lipopolisaccaride (LPS), rispetto al controllo (Figura 4A, E). D'importanza, mouse, umani o donatore seno latte tutto restaurato enteroid proliferazione in presenza di LPS come dimostrato dall'aumento della colorazione Ki67 rispetto a LPS da solo (Figura 4F–H).
Dai nostri esperimenti, indichiamo che enteroids intestinale piccolo derivato dai topi neonatali ed intestino fetale umano precoce possa essere mantenuta in coltura. Forniamo inoltre un metodo di raccolta di latte al seno romanzo che consente di estrarre il latte materno da topi, che possono quindi essere utilizzati per vari esperimenti in modo efficiente. Abbiamo scoperto che il latte materno espresso da esseri umani o topi aumentato la dimensione, la crescita e la proliferazione in mouse ed enteroids umano. Inoltre, mouse, umani e donatore latte materno restaurato la proliferazione di enteroid dopo l'esposizione di LPS. Ciò suggerisce che il latte materno può esercitare effetti antinfiammatori sull'intestino tenue dei topi e nell'uomo.
Figura 1. Latte materno e latte materno donato aumentare le dimensioni e la crescita di mouse e prematuro umano enteroids. Microfotografie di piccolo enteroids intestinale da topi neonatali (p14) o intestino umano precoce trattati con supporti (controllo), latte materno o latte materno donato (50 µ l/mL) per la barra di dimensione h. 24: 1.000 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questo figura.
Figura 2. Latte materno e latte materno donato aumentare la proliferazione delle prematura umano enteroids. (A) micrografie Confocal di prematura enteroids umane coltivate per 5 giorni, trattati con latte materno e latte materno pastorizzato donatore per 24 h e macchiato per il marcatore di proliferazione Ki67 (rosso) e DAPI (nucleare, blu). Barra di dimensioni: 50 µm. (B) qRT-PCR per l'espressione di Ki67 di enteroids umana rispetto al gene housekeeping RPLO. n = 5 per gruppo. p < 0,0001 confronti con test t di Student rispetto al controllo. Dati sono media ± deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Raccolta del latte da un mouse anestetizzato utilizzando una pompa di seno umano modificate. Tubazione della pompa di seno umano sterile immessi sul tettarelle della diga in allattamento anestetizzato dopo iniezione di ossitocina. Mouse il latte viene raccolto utilizzando la pompa di seno umano sulla velocità media e potere in una provetta di raccolta di 5 mL. Volumi collettanei estratti da tutta la gamma tettarelle da 500 µ l a 1 mL per mouse a giorni postnatali 7-12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Mouse, umano, e latte materno pastorizzato donatore migliorare del mouse enteroid proliferazione. (A-H) Micrografie confocal di p14 intestinale piccolo topo enteroids (controllo, un) trattati con latte materno del mouse (MBM, B), latte materno umano (BM, C), o latte materno donatore umano (DBM, D) a 50 µ l/mL dei media per 12 h in assenza ( A-D) o la presenza di lipopolisaccaride (LPS) ad una dose di 25 µ g/mL di media per 12 h, (E-H) e macchiato per il marcatore di proliferazione Ki67 (rosso) e DAPI (nucleare, blu). Barra di dimensioni: 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'epitelio intestinale è composto di molti sottotipi cellulari che sono responsabili per fornire la difesa ospite contro gli agenti patogeni, mantenendo l'integrità della barriera dell'intestino e possono essere violati nella patogenesi di diverse malattie. Mentre modelli animali possono ricapitolare alcuni aspetti della malattia, il modello ex vivo di enteroids derivato dall'intestino tenue dei topi e gli esseri umani fornisce una piattaforma per testare gli effetti dei vari trattamenti. Il significato del modello enteroid permette ai ricercatori di cultura e differenziare cellule staminali intestinali in tutti i sottotipi cellulari epiteliali da ingenuo o animali malati e gli esseri umani che non sono disponibili con i metodi esistenti. Questo sistema modello può essere utilizzato per le infezioni con patogeni umani che non possono essere facilmente traducibili in mouse, ad esempio dell'enterovirus25 o norovirus26 tra gli altri. Il modello enteroid ha diversi vantaggi e usi; Tuttavia, si deve prestare attenzione per garantire la coerenza nei reagenti che sono usati per fare i media e i fattori di crescita esogeni specifici necessari per la sopravvivenza del enteroids.
All'interno del modello di enteroid, diversi passaggi sono di fondamentale importanza per assicurare il successo nella produzione di enteroids. Per minimizzare il tempo ischemico freddo, tessuto deve essere elaborato speditamente. Enteroids può essere prodotta fino a 24 h dopo che il tessuto è raccolto se il tessuto è inserito nel supporto di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a 4 ° C. Se necessario, questo può facilitare l'opzione di spedizione o trasporto. Per l'istituzione di enteroids, la membrana basale deve essere uno strato sottile, piatto nella parte inferiore di ciascun pozzetto per le cripte di allegare e crescere. Se la membrana basale non è piatta o ha bolle presenti, le cripte potrebbero non riuscire ad aderire e verranno rimossi quando il media è cambiato. Dopo aver stabilito la enteroids, possono essere attraversate ogni 7 giorni o congelati in azoto liquido per stoccaggio a lungo termine. Rimozione e aggiunta di terreni di coltura di cripta con fattori di crescita e la gestione di ogni trattamento deve essere fatto lentamente e sul bordo di ciascun pozzetto per evitare di disturbare il enteroids. Rottura della enteroids può causare loro di diventare indipendente e lavati quando il media è cambiato. Per ottenere risultati ottimali, si dovrebbe prestare attenzione per preservare l'integrità della membrana dello scantinato e la enteroids allegata.
In questo studio, segnaliamo che enteroids derivate dai topi neonatali e neonati prematuri possono crescere e proliferare in presenza di diversi tipi di latte materno. Questi studi avanzano la nostra comprensione degli effetti del latte materno sull'intestino prematura. Forniamo un metodo dettagliato su come stabilire enteroid culture in laboratorio da esseri umani e topi. Inoltre, dimostriamo un efficiente metodo di raccolta di latte materno da un mouse in allattamento utilizzando una pompa di seno umano modificate. Indichiamo che il mouse, il latte materno umano e pastorizzato donatore che permettono di migliorare la crescita e la proliferazione di enteroids da topi e nell'uomo. Inoltre, ci mostra la proliferazione di enteroid in diminuzione in presenza di ligando TLR4 LPS, che è stato restaurato quando mouse, umani o donatore il latte materno è stato amministrato per il enteroids. Future applicazioni possono includere la medicina personalizzata precisione con schermi di droga di throughput elevato su enteroids ottenuti da infanti dopo resezione intestinale per vedere come alcuni farmaci possono influenzare l'infante particolare. Presi insieme, speriamo che altri laboratori troverete potenziale successo nell'utilizzo di queste tecniche in molti regni differenti di malattie pediatriche dell'intestino, tra cui NEC, dove c'è un urgente bisogno clinico di sviluppare nuove strategie terapeutiche.
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Disclosures
Gli autori hanno nulla da divulgare e senza conflitti di interesse.
Acknowledgments
MG è sostenuta da sovvenzioni, K08DK101608 e R03DK111473 il National Institutes of Health, marzo Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, i bambini Discovery Institute di Washington University e St. Louis Children Hospital e il dipartimento di Pediatria presso la Washington University School di medicina, St. Louis. CJL è supportato da R01DK104946 (PI: Silverman), ospedale Discovery Institute di Washington University dei bambini e St. Louis Children.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
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