Summary
Этот протокол описывает, как создать систему enteroid культуры от новорожденных мыши или преждевременной кишечнике человека, а также эффективным методом для сбора молока от мышей.
Abstract
Человека малого кишечника enteroids являются производными от склепы и при выращивании в нише стволовых клеток содержат все типы эпителиальных клеток. Возможность установить человека enteroid ex vivo культуры систем являются важными модель кишечных патофизиологии и изучения конкретных клеточных реакций участвующих. В последние годы enteroids от мышей и людей будучи культивировали, пассированный и накренился прочь для будущего использования в нескольких лабораториях по всему миру. Этот enteroid платформа может использоваться для проверки последствий различных методов лечения и лекарств и какое воздействие оказываемое на различных типов клеток в кишечнике. Здесь протокол для создания первичного малого кишечника enteroids, стволовых клеток, полученных от новорожденных мышей и преждевременной кишечнике человека предоставляется. Кроме того эта система культуры enteroid был использован для тестирования эффекты вегетационных грудного молока. Мышь грудное молоко можно получить эффективно используя насос груди изменение человека и выразил мыши молоко может затем использоваться для дальнейших научных экспериментов. Мы теперь продемонстрировать последствия выраженных мыши, человека, и донорским грудным молоком на рост и распространение enteroids, полученных от новорожденных мышей или преждевременной человека тонкой кишки.
Introduction
Некротизирующего энтероколита (НЭК) является ведущей причиной смерти от болезни желудочно-кишечного тракта у недоношенных детей, затрагивающих почти 1 из 10 детей, родившихся до 29 недель гестации1,2,3. Половина детей с NEC прогресса наиболее тяжелой форме, где выживание является только4,10-30%5. В Соединенных Штатах примерно 2-3 млрд долларов США в год проводятся лечения грудных детей с NEC6,7, однако выживаемость ни терапия изменилась за последние 30 лет. Патогенез NEC характеризуется кишечных повреждений и нарушениями слизистых оболочек исцеления8,9,10,11, однако, сигнальных путей, ведущих к усугубляется воспалительной реакции и механизмы для обращения вспять воспаление по-прежнему неполно понял.
Было установлено, что администрацией человеческого грудного молока быть только Защитная стратегия против NEC для недоношенных детей. Ранее мы показали, что грудное молоко защищает от NEC развития путем ингибирования innate иммунных рецепторов Толл подобный рецептор 4 (TLR4) в эпителии кишечника через рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) сигнальный путь11. Добавок грудного молока экспериментальной NEC формулу ослабления воспалительной реакции, видели в NEC как показано ингибирование апоптоза энтероцитах и восстановление энтероцитах распространения в манере, которая зависит от роста эпидермиса фактор (EGF) и EGFR11. В другом исследовании было показано, что нитрат, другой компонент грудного молока, способствует ее защитного характера, модулируя кишечных перфузии, по сравнению с младенческой формулы, которая хватает нитрата и может способствовать увеличению частоты NEC в Формула вскармливаемых12,13. Другие соединения присутствует в грудном молоке, которые показали, чтобы быть вовлечены в защиту от NEC включают олигосахаридов грудного молока, L-аргинин, глютамин и лактоферрин14,,1516, 17,18,19. Эти выгодные элементы грудного молока выявить необходимость его использования в профилактике НЭК, но также подчеркивать важность изучения механизмов, сигнальные пути и сотовой эффекты причастны как грудное молоко посредничество защиту от NEC .
В целях дальнейшего изучения защитные свойства грудного молока в мыши модели NEC, мы разработали роман, простой в использовании метод, который мышью грудное молоко могут быть извлечены из наркотизированных плотины, используя электрические человека груди насос11,12 . Эта стратегия приобретения мыши грудное молоко является выгодным, не только потому, что насосы груди человека легко доступных и эффективных закупок грудного молока, но и потому, что этот метод позволяет для вегетационных грудное молоко анализов. В результате мы можем сравнить эффекты мыши грудное молоко с теми, кто выразил человеческого грудного молока, а также пастеризованное молоко человека доноров из молока банка в вегетационных моделей. Эта техника позволяет для изучения компонентов грудного молока по отношению к их вклад в предотвращение NEC. Другие исследователи разработали методы добычи грудное молоко, однако, эти методы ручной и обычно требуют более одной лаборатории член20,21,22. Здесь представлен простой техники, которые могут быть использованы, изменив человека Электрический насос груди для сбора молока от мыши. Этот метод также может быть применен к другим видам.
Чтобы адекватно допросить сигнальных путей, связанных с NEC, модель системы необходимы для оценки всех видов различных клеток, знаны, что будут затронуты в процессе болезни. Здесь мы обсуждаем один такой модели системы - enteroids - и их создание от мыши и человека тонкой кишки. В частности человека кишечные enteroids (ОДРДХ) предоставляют значительные перспективы, потому что они предлагают инновационные, генетически разнообразны ex vivo человека модель для помощи в изучении патофизиологических процессов, которые происходят в желудочно-кишечном тракте 23. Enteroids было установлено быть культивировали долгосрочный и может быть заморожен для последующего использования23, и в отличие от человека кишечные Organoids (HIOs), чьи культуры разработаны от индуцибельной плюрипотентных стволовых клеток, enteroids генерируются из стволовых клеток в течение24изолированных кишечные крипты. Enteroids требуют меньше обслуживания, могут быть заражены быстро25и может быть создана легко, поскольку кишечные крипты продифференцированы более чем HIOs23. Таким образом ОДРДХ предлагают много преимуществ над существующие методы, потому что они могут быть разработаны выставлять конкретного региона композиционные и функциональных свойств человека желудочно-кишечного эпителия23. Использование enteroids является весьма эффективным выбором когда нуждающихся человека модель кишечника, с соблюдением ограничений конкретного региона и простота в использовании. Здесь мы продемонстрировать технику изоляции и поддержания первичного стволовых клеток малого кишечника enteroids от мышей и недоношенных детей человеческих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры в этом исследовании были утверждены либо в университете Вашингтона в Сент-Луисе институциональных животное уход и использование Комитета (протокол 20160187) или Университет Питтсбурга институционального ухода за животными и использования Комитета (протокол 14103918). Человеческого плода тонкой кишки в менее чем 24 недели беременности был получен в соответствии с руководящими закупок университета Питтсбурга анатомические ткани после утверждения институциональных Наблюдательный Совет (протокол PRO14100537) из университета Питтсбург здравоохранения наук ткани банк через систему честного брокера. С отказ от согласия в университете Питтсбурга институциональных Наблюдательный Совет был получен обезличенных грудное молоко или пастеризованного донорским грудным молоком.
1. склеп изоляции и создание Enteroids от новорожденных мышей или преждевременной кишка человека
- Подготовка средств массовой информации
Примечание: СМИ должны быть подготовлены в капот за день до склепа изоляции.- Подготовьте 1.11 Л культуры средств массовой информации. Начинаются с 1 Л Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) с глюкозой 4,5 г/Л и Л-глютамина и добавить 110 мл плода Bovine сыворотки (ФБС) (конечная концентрация 10%), 11 мл пенициллин-стрептомицином (конечная концентрация 1%) и 1,1 мл стерильного инсулина (финал концентрации 0,1%).
- Подготовка 500 мл смеси PBS-антибиотик. Начать с 500 мл 1 x Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) с 10% FBS и добавьте 5 мл гентамицин (конечная концентрация 1%), 1 мл амфотерицин B (конечной концентрации 0,2%) и 5 мл пенициллин-стрептомицином (конечная концентрация 1%).
- Подготовьте 30 мл клеток нарушения СМИ #1. Сначала подготовьте 30 мл культуры средств массовой информации. Добавить 600 мкл 0.5 M Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (конечная концентрация 10 мм), 300 мкл гентамицин (конечная концентрация 1%) и 60 мкл амфотерицин B (конечной концентрации 0,2%).
- Подготовьте 30 мл клеток нарушения СМИ #2. Сначала подготовьте 30 мл культуры средств массовой информации. Добавить 300 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация 5 мм), 300 мкл гентамицин (конечная концентрация 1%) и 60 мкл амфотерицин B (конечной концентрации 0,2%).
- Подготовьте 50 мл склеп культуры СМИ без факторов роста. Мера 33.4 мл 1 x Advanced DMEM/F-12 и добавляют 10 мл FBS (конечная концентрация 20%).
- 500 мкл пенициллин-стрептомицином (конечная концентрация 1%), 500 мкл L-глютамин (конечная концентрация 1%), 500 мкл гентамицин (конечная концентрация 1%), 100 мкл амфотерицин B (конечной концентрации 0,2%), 2,5 мкл 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane перфтороктановой сульфоновой кислоты (HEPES) (конечная концентрация 0,05 мм), 500 мкл 100 мм N-ацетилцистеин (конечная концентрация 1 мм), 500 мкл 100 x N-2 дополнение, 1 мл 50 x сыворотки бесплатные дополнения (например, B-27) минус витамина А и 500 мкл 1 мм 100 x Y-27632.
- Подготовьте 1 мл склеп культуры СМИ с факторами роста. Сначала подготовьте 1 мл из склепа культуры СМИ без факторы роста. Добавьте 2.5 мкл 40 мкг/мл Wnt3a (конечной концентрации 100 нг/мл), 1 мкл 100 мкг/мл Башка (конечной концентрации 100 нг/мл), 2 мкл 250 мкг/мл Р-Spondin (конечная концентрация 500 нг/мл) и 0,5 EGF µL 100 мкг/мл (конечная концентрация 50 нг/мл).
- Склеп изоляции
- Место солюбилизирован экстракт базальной мембраны (см. Таблицу материалы) на лед таять до начала.
Примечание: Держать базальной мембраны на льду, или он будет полимеризоваться. - Соблюдает институциональный уход животных и использования Комитетом протокол для мышей больше, чем 14 дней возраста, усыпить мышей с двумя методами эвтаназии с второй будучи физические процедуры для обеспечения смерти.
Примечание: Для мышей до 14 дней возраста, обезглавливание это стандартная процедура, с помощью ножниц. - С помощью ножниц и щипцы, сделайте вертикальный разрез вниз по средней линии живота, через кожу и брюшины, для всей длины живота. Акцизный кишечник от желудка до слепой кишки с ножницами и удалите брыжейка пинцетом.
Примечание: Две недельных мужские и женские C57BL/6J мыши щенков, каждый весом 5,5-7 g, были использованы для изоляции склеп. Любого возраста или размер мышь может использоваться для изоляции склеп. - Подготовить свежеубранных тонкой кишки для изоляции склеп, позиция прямой кишки и кишечника продольно по всей длине с помощью ножниц вырежьте.
Примечание: Мыши и кишечнике человека могут быть подготовлены аналогичным образом. - Чистой стул из кишечника, осторожно встряхивая кишечника взад и вперед в PBS-антибиотик смесь-заполнены Петри с помощью щипцов.
- Добавьте 30 мл клеток нарушения СМИ # 1 в 50 мл Конические трубки. Нарежьте кишечника 0,5 см Длина непосредственно в трубу. Установить трубу в ведро льда и аккуратно агитировать на шейкер на низкой скорости для 15 мин.
- В то время как ткани находятся на шейкер, получите пластины 24 или 48 хорошо расти склепы, если enteroids будут использоваться для РНК, ДНК или белка изоляции. Используйте слайды камеры 8-хорошо расти склепы, если enteroids будут использоваться для всего смонтировать конфокальная томография.
- В капот мкл 15 базальной мембраны в нижней части каждой скважины 24 или 48 хорошо пластины. Если с помощью камеры слайды, мкл 9 базальной мембраны в нижней части каждой камеры.
Примечание: Регулировка громкости базальной мембраны в зависимости от размера пластины при необходимости. - Быстро распространилась базальной мембраны с кончиком пипетки, так что базальной мембраны образует тонкий слой на дне колодца. Поместите пластины при 37 ° C в инкубаторе для 30 минут, чтобы позволить базальной мембраны для полимеризации.
Примечание: Не склепы присоединит если базальной мембраны не является тонким слоем или базальной мембраны содержит пузырьков воздуха. - После 15 минут на шейкер фильтр ткани через стрейнер 100 мкм. Слейте через поток.
- Добавьте 30 мл клеток нарушения СМИ #2 в новой 50 мл Конические трубки. Удаление ткани из сито и добавить в трубку.
- Установить трубу в ведро льда и аккуратно агитировать на шейкер на низкой скорости для 15 мин.
- После 15 минут на шейкер фильтр ткани через стрейнер 100 мкм. Держите поток через на этот шаг, в случае, если доходность низкая в последующих шагах.
Примечание: Все потока через трубы должны храниться на льду. - Добавьте 15 мл DMEM с глюкозой 4,5 г/Л и Л-глютамина в новой 50 мл Конические трубки. Удаление ткани из сито и добавить в трубку. Энергично встряхнуть трубки вручную для 10 s. фильтра через стрейнер 100 мкм и собирать потока через. Повторяйте до тех пор, пока поток через содержит без частиц.
- В капот фильтр через поток из предыдущего шага в новой 50 мл Конические трубки с помощью 70 мкм Ситечки для 100 мкм Ситечки для человеческой ткани или ткани мыши.
Примечание: Дополнительные фильтры на ожидания и медленно вылейте как фильтры будут забивать с мусором. - Центрифуга трубки на 200 x g 8 мин при 4 ° C и место непосредственно в ведёрке со льдом в капюшоне. Удалите супернатант пипетки не нарушая гранулы. Ресуспензируйте лепешка с желаемой сумму из склепа культуры СМИ без факторов роста.
Примечание: Обогащенный склепы являются «песчаный» слое гранул. Каждый хорошо требует 250 мкл из склепа культуры СМИ без факторов роста.
- Место солюбилизирован экстракт базальной мембраны (см. Таблицу материалы) на лед таять до начала.
- Создание enteroids
- Пластина склеп СМИ смесь непосредственно на базальной мембраны.
- Проверьте склепы с микроскопом, чтобы убедиться, что процесс изоляции был успешным.
Примечание: Клетки и шарики клеток желательны. Около 100 отдельных крипта покрыты за хорошо. - Инкубируйте пластины при 37 ° C, 3 часа позволить склепы присоединиться к базальной мембраны.
Примечание: Этот инкубации — с Crypt культуры СМИ без факторы роста. - Медленно извлеките СМИ и избыток склепы, которые удалось присоединить с помощью пипетки P-200.
Примечание: Не беспокоить базальной мембраны, как может стать выбили прилагаемый склепы. - Медленно добавьте 250 мкл из склепа культуры средств массовой информации с факторами роста каждой скважины.
Примечание: Для 24-, 48-ну плиты, или палаты слайды, 250 мкл культуры СМИ склеп с роста факторов является достаточным. - Замените СМИ каждые 2 дня с свежие склеп культуры СМИ с факторами роста за 5 дней до процедуры для обеспечения оптимального вложения и роста.
2. сбор молока груди мыши
- Отделите C57BL/6J кормящих плотины в послеродовом 7-12 дней от своих детенышей на 6 ч до доения.
- Анестезировать кормящих плотины с изофлюрановая через носовой конус и администрировать подкожная инъекция окситоцина на 0,15 МЕ/кг массы тела. Подождите 3 минуты перед доения процедуры.
- Очистить соски с 70% этанол до доения процедуры и высушить.
- Добывают молоко из сосков один одновременно с помощью электроотсос человека с силиконовой трубки изменен для вмещения мыши сосок в 5 мл трубку коллекции.
Примечание: Оптимальный молокоотсосы имеют два параметра, один для скорости и один для всасывания. Лучше всего начать с самых низких настройках каждого и увеличить так медленно до тех пор, пока молоко добывается. В идеале, общая доходность будет ~ 500 мкл - 1 мл грудного молока мыши на кормящих плотины. - Сразу же аликвота грудное молоко и хранить при температуре-80 ° C.
Примечание: Избежать замораживания/оттаивания циклов. - Лечить enteroids на день 5 с 50 мкл/мл грудного молока мыши мл из склепа культуры средств массовой информации с факторами роста в течение 24 ч при 37 ° C.
3. весь смонтировать окрашивание Enteroids
-
Подготовка реагентов
- Подготовьте PBS 1 x 16 мл за 8 скважин.
- Подготовьте параформальдегида 4% 2 мл (PFA) 1 x PBS на 8 скважин.
- Готовить 2 мл 0,1% тритон X-100 в однократном ПБС в 8 скважин.
- Подготовка 24 мл PBS анимации (PBST-0,1% анимации 20 в однократном ПБС) за 8 скважин.
- Готовить 2 мл 10% нормальной осла сыворотки (NDS) в 0,1% PBST (10% NDS/PBST) на 8 скважин.
- Подготовка 4 мл 1% NDS в 0,1% PBST (1% NDS/PBST) на 8 скважин.
-
Окрашивание день 1
- Аспирационная от лечения и мыть enteroids с PBS. 250 мкл 4% ПФА за хорошо. Место на вращателе для 1-2 ч и при 4 ° C. Удалите 4% PFA с пипеткой.
- Вымойте 4 раза с 250 мкл/хорошо 1 x PBS. Место на вращателе 10 мин при комнатной температуре (RT).
Примечание: Это возможно для хранения пластины для 1-2 дней при температуре 4 ° C, при необходимости. - Добавить 250 мкл/хорошо 0.1% тритон X-100. Инкубировать 1 час на RT. Remove 0.1% тритон X-100 с пипеткой.
- Вымойте 4 раза с 250 мкл/хорошо 1 x PBS. Место на вращателе 15 мин на RT.
- Добавить 10% 250 мкл/хорошо NDS/PBST. Инкубируйте 45 мин на RT. Remove 10% NDS/PBST с пипеткой.
- Добавить 250 мкл/хорошо основное антитело, разбавленных 1/250 в 1% NDS/PBST и инкубировать на ночь при 4 ° C.
Примечание: Оптимальный антитела разрежения варьируется в зависимости от производителя.
-
Окрашивание день 2
- Мыть по крайней мере 5 раз за 4-5 h с 250 мкл в хорошо PBST. Место на вращателе на 4 ° C между каждой стирки.
- Добавьте 250 мкл/также вторичные антитела, разбавленных 1/1000 в 1% NDS/PBST. Оберните пластину в фольгу и инкубировать на ночь при 4 ° C.
-
Окрашивание день 3
- Добавьте 250 мкл/хорошо ядерной пятно 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) за 15 мин.
Примечание: Держите пластины в темноте. - Вымойте 6 раз с 250 мкл в хорошо PBST. Место на вращателе 10 мин при температуре 4 ° C между каждой стирки.
- Гора coverslip на камере слайд с монтажными СМИ.
- Изображения с 40 X объективных конфокального микроскопа и одинаково визуализации в растровый графический редактор (см. Таблицу материалы).
- Добавьте 250 мкл/хорошо ядерной пятно 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) за 15 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы сначала пытались расследовать ли выразил материнском молоке или пастеризованного донорским грудным молоком сказывается на малых кишечных enteroids. Действительно материнском молоке и донорским грудным молоком увеличился рост новорожденных мыши (рис. 1A) и преждевременной человека производные enteroids (рис. 1B).
Так как грудное молоко увеличение роста малого кишечника enteroids, мы далее расследование, если грудное молоко имел влияние на распространение преждевременной человеческого enteroids. Мы демонстрируем, что грудное молоко увеличивает распространение преждевременной человека enteroids по сравнению с контролем (рисунок 2A–B, Ki67, красное окрашивание). Важно отметить, что человека донорским грудным молоком также увеличил enteroid распространения, по сравнению с контролем, но в несколько меньшей степени, чем не пастеризованного человеческого грудного молока (рис. 2B–C). Мы далее вычисляется выражение Ki67 mRNA в преждевременной человеческого enteroids и обнаружил, что Ki67 был увеличен в enteroids, относились с грудным молоком или донорским грудным молоком по сравнению с контролем (Рисунок 2D).
Далее мы хотели бы видеть, если эти эффекты были вегетационных что касается грудного молока. Мы разработали способ для сбора грудное молоко кормящих мышей с использованием модифицированных коммерчески доступных человека груди насос как ссылки11,12. Изображенные является наркотизированных кормящих плотины, проходит сбор молока с помощью этого устройства (рис. 3). Следующая серия экспериментов было проведено на enteroids мыши, и мы оценивали воздействие распространения сцеженное грудное молоко из мыши, человека или доноров грудного молока. Как показано на рисунке 4, мышь, человека, и пастеризованного доноров грудное молоко увеличение распространения в мыши enteroids по сравнению с контролем (рис. 4A–D). Распространение в enteroids мыши уменьшилось в присутствии TLR4 лигандом, липополисахарида (LPS), по сравнению с контролем (рис. 4A, E). Важно отметить, что мышь, человека или доноров груди молоко все восстановил enteroid распространения присутствии LPS, как свидетельствует увеличение Ki67 окрашивание по сравнению с LPS только (Рисунок 4F–H).
От наших экспериментов мы показывают, что малые кишечника enteroids производным от новорожденных мышей и преждевременной человеческого плода кишечника может быть сохранен в культуре. Далее мы предоставляем Роман грудное молоко коллекции метод, который обеспечивает эффективный способ извлечения грудное молоко от мышей, которые затем могут быть использованы для различных экспериментов. Мы обнаружили, что сцеженное грудное молоко из людей или мышей увеличить размер, рост и распространение в мышь и человеческой enteroids. Кроме того мышь, человека и доноров грудное молоко восстановлен enteroid распространения после воздействия ПЛАСТИНОК. Это свидетельствует о том, что грудное молоко может оказать противовоспалительное действие на кишечник мышей и людей.
Рисунок 1. Грудное молоко и донорским грудным молоком увеличить размер и рост мыши и преждевременной человеческого enteroids. Микрофотографиями малого кишечника enteroids от новорожденных мышей (p14) или преждевременной кишечнике человека лечили СМИ (управления), грудное молоко или донорским грудным молоком (50 мкл/мл) для Бар 24 ч. Размер: 1000 мкм. пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этого Рисунок.
Рисунок 2. Грудное молоко и донорским грудным молоком увеличить распространение преждевременной человеческого enteroids. (A) Confocal микроскопии преждевременной человеческого enteroids, культивируемых на 5 дней, материнском молоке и пастеризованного донорским грудным молоком для 24 h и витражи для маркера распространения Ki67 (красный) и DAPI (ядерных, синий). Размер бар: 50 µm. (B) qRT ПЦР для Ki67 выражение человеческого enteroids относительно уборки гена RPLO. n = 5 для каждой группы. p < 0,0001 сравнений с студент t -тест по сравнению с контролем. Данные являются среднее ± стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Сбор молока из наркотизированных мыши, с помощью модифицированных человека молокоотсос. Стерильные человека груди насос трубки помещены на соски наркотизированных кормящих плотины после получения инъекция окситоцина. Мышь молоко собирается, используя насос груди человека на средней скорости и мощности в 5 мл трубку коллекции. Коллективные томов, извлеченные из всех соски варьируются от 500 мкл до 1 мл на мышь на послеродовых дней 7-12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Мышь, человека, и грудное молоко пастеризованное доноров повысить мыши enteroid распространения. (A-H) Конфокальной микроскопии p14 малого кишечника мыши enteroids (управления, A) лечение мыши грудным молоком (MBM, B), материнском молоке (БМ, C), или человека донорским грудным молоком (DBM, D) на 50 мкл/мл СМИ для 12 h в отсутствие ( A-D) или присутствие липополисахарида (LPS) в дозе 25 мкг/мл СМИ за 12 ч, (E-H) и окрашенных для распространения маркер Ki67 (красный) и DAPI (ядерных, синий). Размер бар: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кишечного эпителия состоит из многих клеточных подтипы, которые отвечают за предоставление узла обороны против патогенов, сохранение целостности кишки барьер и может быть нарушено в патогенезе ряда заболеваний. В то время как Животные модели можно резюмировать некоторые аспекты этого заболевания, модель ex vivo enteroids, производного от тонкой кишки мышей и людей обеспечивает платформу для тестирования влияние различных методов лечения. Значение enteroid модель позволяет исследователям культуры и дифференцировать кишечных стволовых клеток во все подтипы эпителиальных клеточных от наивного или больных животных и людей, которые не доступны с существующими методами. Эта модель система может использоваться для инфекции с патогенов человека, которые не могут быть легко переводимые в мышь, таких как энтеровирус25 или норовирус26 среди других. Модель enteroid имеет ряд преимуществ и использует; Однако необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить последовательность в реагенты, которые используются для создания средств массовой информации и конкретных экзогенных факторов роста, которые необходимы для выживания enteroids.
В рамках enteroid модели несколько шагов имеют решающее значение для обеспечения успеха в производстве enteroids. Чтобы свести к минимуму холодное время ишемии, ткани должны быть обработаны целесообразно. Enteroids могут быть произведены до 24 ч после ткани собирают если ткани помещается в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среде при 4 ° C. Это может облегчить возможность доставки или перевозки в случае необходимости. Для создания enteroids базальной мембраны должна быть тонкий, плоский слой в нижней части каждой скважины для склепы прикрепить и расти. Если базальной мембраны не является плоской или пузырьки настоящее, склепы может не присоединиться и будут удалены при изменении средства массовой информации. После того, как установлены enteroids, они могут быть пассированной каждые 7 дней или замороженные в жидком азоте для длительного хранения. Удаление и добавление склеп культуры СМИ с факторами роста и администрация каждого лечения должно быть сделано медленно и к краю каждого также не мешать enteroids. Нарушение enteroids может вызвать их стать отсоединяется и смывается при изменении средства массовой информации. Для достижения наилучших результатов следует позаботиться для сохранения целостности базальной мембраны и вложенное enteroids.
В текущем исследовании мы сообщают, что enteroids производным от новорожденных мышей и могут расти и размножаться в присутствии различных типов грудного молока у недоношенных детей. Эти исследования заранее нашего понимания последствий грудного молока на преждевременное кишечника. Мы предоставляем подробный метод на как установить enteroid культур в лаборатории от людей и мышей. Кроме того мы демонстрируем эффективный метод сбора грудное молоко кормящих мыши с использованием модифицированных человека электроотсос. Мы покажем, что мышь, человека и пастеризованного донорским грудным молоком повышения роста и распространения enteroids от мышей и людей. Кроме того мы показываем распространения снижение enteroid в присутствии TLR4 лигандом LPS, который был восстановлен, когда мышь, человека или доноров грудное молоко вводили к enteroids. Будущих приложений могут включать персонализированные точности медицины с высокой пропускной способностью наркотиков экранов на enteroids, полученные от младенцев после кишечные резекции, чтобы увидеть, как некоторые лекарства могут повлиять на конкретного ребенка. Взятые вместе, мы надеемся, что другие лаборатории найдут потенциальный успех в использовании этих методов во многих различных сферах педиатрических заболеваний кишечника, включая NEC, где есть клинические настоятельная необходимость разработки новых терапевтических стратегий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют ничего, чтобы раскрыть и отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
MG поддерживается грантов, K08DK101608 и R03DK111473 из Департамента и национальных институтов здравоохранения, марта Dimes Фонд Грант № 5-FY17-79, Детская Discovery институт Вашингтонского университета и Сент-Луисе Детская больница Педиатрия в школе университета Washington микстуры, Сент-Луис. CJL поддерживается R01DK104946 (PI: Silverman), Университет Вашингтона Discovery Институт детской и Сент-Луисе Детская больница.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
