Summary
Det här protokollet beskriver hur du upprättar en enteroid kultur system från neonatal musen eller förtida mänskliga tarmen samt en effektiv metod att samla in mjölk från möss.
Abstract
Mänskliga små intestinal enteroids härleds från kryptor och när den odlas i en stamcellsnischen innehåller alla epitelial celltyper. Förmåga att upprätta mänsklig enteroid ex vivo kultur system är viktiga att modell intestinal patofysiologi och studera de särskilda cellulära svar inblandade. Under senare år har som enteroids från mus och människa odlas, anpassade och bankas bort för framtida användning i flera laboratorier över hela världen. Denna enteroid plattform kan användas för att testa effekterna av olika behandlingar och läkemedel och vilka effekter utövas på olika celltyper i tarmen. Här, ett protokoll för att skapa primära stamceller-derived små intestinal enteroids härrör från neonatala möss och förtida mänskliga tarmen tillhandahålls. Dessutom var detta enteroid kultur system utnyttjas för att testa effekterna av artspecifika bröstmjölk. Mus bröstmjölk kan erhållas effektivt med hjälp av en modifierad mänskliga bröstcancer pump och uttryckt mus mjölk kan sedan användas för ytterligare forskningsexperiment. Vi visar nu effekterna av uttryckt mus, mänskliga, och givare bröstmjölk på tillväxt och spridning av enteroids härrör från neonatala möss eller för tidig mänsklig tunntarmen.
Introduction
Nekrotiserande enterokolit är (NEC) den ledande dödsorsaken från gastrointestinal sjukdom hos prematura spädbarn, som påverkar nästan 1 av 10 barn födda före 29 veckor dräktighet1,2,3. Hälften av barnen med NEC framsteg till den svåraste formen, där överlevnad är bara 10-30%4,5. I USA, en uppskattningsvis 2-3 miljarder USD/år spenderas behandling av spädbarn med NEC6,7, men varken överlevnaden eller terapi har förändrats under de senaste 30 åren. Patogenesen av NEC kännetecknas av intestinal skada och nedsatt slemhinnor helande8,9,10,11, dock de signalvägar som leder till ett förvärrat inflammatorisk reaktion och mekanismer för att vända inflammationen fortfarande ofullständigt förstådda.
Administrering av bröstmjölk har befunnits vara bara skyddande strategin mot NEC för prematura spädbarn. Vi har tidigare visat att bröstmjölk skyddar mot NEC utveckling genom hämning av medfödd immun receptor toll-like receptor 4 (TLR4) i intestinala epitelet via den epidermal tillväxtfaktor (EGFR) signalering väg11. Tillskott av bröstmjölk till en experimentell NEC formel försvagade den inflammatoriska reaktionen ses i NEC manifesterad genom hämning av enterocyter apoptos och restaurering av enterocyter spridning på ett sätt som var beroende av epidermal tillväxt Factor (EGF) och EGFR11. I en annan studie visades att nitrat, en annan komponent av bröstmjölk, bidrar till dess skyddande natur genom att modulera intestinal perfusion, jämfört med modersmjölksersättning, som saknas nitrat och kan bidra till ökad frekvens av NEC i formeln matas spädbarn12,13. Andra föreningar som finns i bröstmjölk som har visat sig vara inblandade i skyddet mot NEC inkluderar bröstmjölk oligosackarider, L-arginin, glutamin och Laktoferrin14,15,16, 17,18,19. Dessa positiva element av bröstmjölk avslöja nödvändigheten av dess användning i förebyggande av NEC, men betonar också vikten av att studera mekanismerna, signalering vägar och cellulära effekter inblandade i hur bröstmjölk medla skyddet mot NEC .
För att ytterligare en studie de skyddande egenskaperna av bröstmjölk i en musmodell av NEC, vi utvecklat en roman, lättanvänd teknik genom vilken mus bröstmjölk kan extraheras från en sövda dam med en elektrisk mänskliga bröstcancer pump11,12 . Denna strategi att förvärva mus bröstmjölk är fördelaktigt, inte bara eftersom mänskliga bröstpumpar är lättillgängliga och effektiva i upphandling av bröstmjölk, men också för att denna metod möjliggör artspecifika bröst mjölk analyser. Som ett resultat, vi kan jämföra effekterna av mus bröstmjölk med de av uttryckt bröstmjölk samt pastöriserad mänskliga givare mjölk från en mjölk bank i artspecifika modeller. Denna teknik möjliggör studiet av bröst mjölk komponenter i förhållande till deras bidrag till NEC förebyggande. Andra utredare har utvecklat bröst mjölk extraktionsmetoder, men dessa tekniker är manuell och kräver normalt mer än en lab medlem20,21,22. Här presenteras en enkel teknik som kan utnyttjas genom att ändra en mänsklig elektrisk bröstpump för att samla in mjölk från en mus. Denna teknik kan också tillämpas på andra arter.
För att adekvat förhöra signalvägar som är involverade med NEC, behövs modellsystem för att utvärdera alla de olika celltyper som visat sig påverkas i sjukdomsprocessen. Här diskuterar vi en sådan modellsystem - enteroids- och deras etablering från mus och människa tunntarmen. Human intestinal enteroids (HIEs) tillhandahålla i synnerhet betydande löfte, eftersom de erbjuder en innovativ, genetiskt olika ex vivo human modell till stöd i studien av patofysiologiska processer som sker i mag-tarmkanalen 23. Enteroids har befunnits vara odlade långsiktiga och kan frysas för senare användning23, och till skillnad från Human Intestinal Organoids (HIOs), vars kulturer utvecklas från inducerbara pluripotenta stamceller, enteroids genereras från stamceller inom isolerade intestinal kryptor24. Enteroids kräver mindre underhåll, kan vara infekterad snabbt25, och kan fastställas lätt eftersom tarmens kryptor är mer differentierat än HIOs23. Därför erbjuder HIEs många fördelar jämfört med befintliga metoder eftersom de kan utvecklas för att uppvisar region-specifika sammansättning och funktionella egenskaper av mänskliga mag epitel23. Användning av enteroids är ett mycket effektivt val när behov av en human modell av tarmen, med följsamhet till region-specifika begränsningar och välbefinnande-av-använda. Här visar vi tekniken för att isolera och underhålla primära stamceller-derived små intestinal enteroids från möss och prematura mänskliga spädbarn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden i denna studie godkändes av antingen Washington University i St Louis institutionella djur vård och användning (protokoll 20160187) eller University of Pittsburgh institutionella djurens vård och användning kommittén (protokoll 14103918). Mänskliga fostrets tunntarmen på mindre än 24-veckors dräktighet erhölls enligt University of Pittsburgh anatomisk vävnad upphandling riktlinjer efter institutionella Review Board godkännande (protokoll PRO14100537) från University of Pittsburgh Health Sciences vävnadsbank via en ärlig mäklare-system. Avidentifierad bröstmjölk eller pastöriserad givare bröstmjölk erhölls med ett avstående av samtycke från University of Pittsburgh institutionella Review Board.
1. crypt isolering och inrättandet av Enteroids från neonatala möss eller för tidig mänsklig tunntarmen
- Media förberedelse
Obs: Media bör förberedas i huven dagen innan crypt isolering.- Förbereda 1,11 L kulturmassmedia. Börja med 1 L Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 4,5 g/L glukos och L-glutamin och tillsätt 110 mL fetalt bovint Serum (FBS) (slutlig koncentration 10%), 11 mL Penicillin-Streptomycin (slutlig koncentration 1%), och 1,1 mL steril insulin (slutlig koncentrationen 0,1%).
- Förbereda 500 mL PBS-antibiotikum blandning. Börja med 500 mL 1 x Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) med 10% FBS och tillsätt 5 mL Gentamicin (slutlig koncentration 1%), 1 mL amfotericin B (slutlig koncentration 0,2%), och 5 mL Penicillin-Streptomycin (slutlig koncentration 1%).
- Förbereda 30 mL Cell störningar Media #1. Först förbereda 30 mL odlingssubstrat. Lägga till 600 µL 0,5 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (slutlig koncentration 10 mM), 300 µL Gentamicin (slutlig koncentration 1%), och 60 µL amfotericinB (slutlig koncentration 0,2%).
- Förbereda 30 mL Cell störningar Media #2. Först förbereda 30 mL odlingssubstrat. Lägg till 300 µL 0,5 M EDTA (slutlig koncentration 5 mM), 300 µL Gentamicin (slutlig koncentration 1%), och 60 µL amfotericinB (slutlig koncentration 0,2%).
- Förbereda 50 mL krypta kulturmassmedia utan tillväxtfaktorer. Mäta 33,4 mL 1 x avancerad DMEM/F-12 och tillsätt 10 mL FBS (slutlig koncentration 20%).
- Tillsätt 500 µL Penicillin-Streptomycin (slutlig koncentration 1%), 500 µL L-glutamin (slutlig koncentration 1%), 500 µL Gentamicin (slutlig koncentration 1%), 100 µL amfotericinB (slutlig koncentration 0,2%), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonsyra (HEPES) (slutlig koncentration 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-acetylcystein (slutlig koncentration 1 mM), 500 µL 100 x n-2 tillägg, 1 mL 50 x serumfritt tillägg (t.ex., B-27) minus Vitamin A och 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
- Laga 1 mL krypta kulturmassmedia med tillväxtfaktorer. Först förbereda 1 mL av krypta kulturmassmedia utan tillväxtfaktorer. Tillsätt 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (slutlig koncentration 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL skalle (slutlig koncentration 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (slutlig koncentration 500 ng/mL) och 0,5 µL 100 µg/mL EGF (slutlig koncentration 50 ng/mL).
- Crypt isolering
- Plats solubilized basalmembranet extrakt (se Tabell för material) på is Tina innan du börjar.
Obs: Håll basalmembranet på is eller det kommer att polymerisera. - I enlighet med institutionella djur vård och användning kommittén protokoll för möss större än 14 dagars ålder, eutanasi möss med två metoder för eutanasi med andra att vara en fysisk förfarande för att säkerställa död.
Obs: För möss under 14 dagar, halshuggning är det normala förfarandet med sax. - Med sax och pincett, göra ett vertikalt snitt ner mittlinjen av buken, genom huden och bukhinnan, för hela längden av buken. Punktskatt tunntarmen från magen till blindtarmen med sax och ta bort tarmkäxet med pincett.
Obs: Två-vecka-gammal manliga och kvinnliga C57BL/6J musungar, varje vägning 5.5-7 g, användes för crypt isolering. Någon ålder eller storlek mus kan användas för crypt isolering. - För att förbereda nyskördade tunntarmen crypt isolering, placera tarmen rakt och skär tarmen längdriktningen längs hela sin längd med sax.
Obs: Mus och mänskliga tarmen kan tillagas på samma sätt. - Ren pall ur tarmen genom att försiktigt skaka tarmen och tillbaka i en PBS-antibiotikum blandning-fyllda petriskål med pincett.
- Tillsätt 30 mL av Cell störningar Media #1 till en 50 mL konisk tub. Skär tarmen i 0,5 cm längd bitar direkt in i röret. Ställ röret i en ishink och skaka försiktigt på shaker vid lägsta hastighet för 15 min.
- Medan vävnader på shaker, få 24 - eller 48-bra plattor för att växa kryptor om enteroids som ska användas för RNA, DNA eller protein isolering. Användning 8-väl kammaren diabilder att växa kryptor om enteroids som ska användas för hela montera confocal imaging.
- I huven, tillsätt 15 µL av basalmembranet till botten av varje brunn av 24 - eller 48-väl plattan. Om du använder kammare diabilder, tillsätt 9 µL av basalmembranet längst ned i varje kammare.
Obs: Justera volymen av basalmembranet beroende på storleken på plattan om det behövs. - Snabbt sprida basalmembranet med pipettspetsen så att basalmembranet bildar ett tunt lager på botten av brunnen. Placera plattan vid 37 ° C i inkubator för 30 min till tillåta basalmembranet att polymerisera.
Obs: Kryptor kommer inte bifoga om basalmembranet inte är tunt eller om basalmembranet innehåller luftbubblor. - Efter 15 min på en shaker, filtrera vävnaden genom en 100 µm SIL. Kassera flödet genom.
- Tillsätt 30 mL Cell störningar Media #2 till en 50 mL konisk reservrör. Ta bort vävnad från sil och tillsätt till röret.
- Ställ röret i en ishink och skaka försiktigt på shaker vid lägsta hastighet för 15 min.
- Efter 15 min på shaker, filtrera vävnad genom en 100 µm SIL. Hålla flödet genom detta steg, om avkastningen är låg i senare steg.
Obs: Alla flödet genom rören måste hållas på is. - Tillsätt 15 mL DMEM med 4,5 g/L glukos och L-glutamin till en 50 mL konisk reservrör. Ta bort vävnad från sil och tillsätt till röret. Kraftfullt skaka röret för hand för 10 s. Filter genom en 100 µm sil och samla flödet genom. Upprepa tills flödet genom innehåller inga partiklar.
- I huven, filtrera flödet genom från föregående steg in i en ny 50 mL koniska rör med 70 µm silar för mus vävnad eller 100 µm silar för mänsklig vävnad.
Obs: Har extra silar på standby, och Häll långsamt som silar täpper med skräp. - Centrifugera röret vid 200 x g under 8 minuter vid 4 ° C och placera direkt i en ishink i huven. Ta bort supernatanten med pipett utan att störa pelleten. Återsuspendera pelleten med önskat totalbelopp av krypta kulturmassmedia utan tillväxtfaktorer.
Obs: Berikade kryptor är det 'sandiga' lagret av pelleten. Varje kräver väl 250 µL av krypta kulturmassmedia utan tillväxtfaktorer.
- Plats solubilized basalmembranet extrakt (se Tabell för material) på is Tina innan du börjar.
- Etablering av enteroids
- Tallrik crypt media blandningen direkt på basalmembranet.
- Kontrollera kryptor med ett mikroskop för att säkerställa isolering processen lyckades.
Obs: Celler och bollar av celler önskas. Cirka 100 enskilda kryptor är pläterade per brunn. - Inkubera plattan vid 37 ° C för 3 h att tillåta kryptor att följa basalmembranet.
Obs: Denna inkubation är med krypta kulturmassmedia utan tillväxtfaktorer. - Ta långsamt bort media och överflödig kryptor som misslyckades att fästa med P-200 pipett.
Obs: Stör inte basalmembranet som bifogade kryptor kan bli rubbas. - Tillsätt långsamt 250 µL av krypta kulturmassmedia med tillväxtfaktorer till varje brunn.
Obs: För 24, 48 brunnar eller kammare glider, 250 µL av krypta kulturmassmedia med tillväxtfaktorer är tillräcklig. - Ersätta media varannan dag med färska krypta kulturmassmedia med tillväxtfaktorer för 5 dagar före behandlingar för att optimal infästning och tillväxt.
2. mus bröst mjölk samling
- Separera en C57BL/6J lakterande dam postpartum 7-12 dagar från dess ungar för 6 h före mjölkning.
- Söva lakterande dammen med isofluran via en kona och administrera en subkutan injektion med oxytocin på 0,15 IE/kg kroppsvikt. Vänta 3 minuter innan mjölkning förfarande.
- Rengöra spenar med 70% etanol före mjölkning förfarande och låt torka.
- Extrahera mjölk från dinappar en i taget med en elektrisk mänskliga bröstcancer pump med silikon slangar dimensionerad för att passa en 5 mL collection tube mus spenar.
Obs: Optimal bröstpumpar har två inställningar, en för hastighet och en för sugning. Det är bäst att börja med de lägsta inställningarna för varje och öka både långsamt tills mjölk utvinns. Idealiskt, totala avkastningen blir ~ 500 µL - 1 mL bröstmjölk mus per lakterande dam. - Omedelbart alikvotens bröstmjölk och förvaras vid-80 ° C.
Obs: Undvik att frysas och tinas cykler. - Behandla enteroids på dag 5 med 50 µL/mL bröstmjölk mus per mL av Crypt kultur Media med tillväxtfaktorer för 24 timmar vid 37 ° C.
3. hela montera färgning av Enteroids
-
Beredning av reagens
- Förbereda 16 mL 1 x PBS per 8 brunnar.
- Förbered 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS per 8 brunnar.
- Förbered 2 mL 0,1% Triton x-100 i 1 x PBS per 8 brunnar.
- Förbereda 24 mL PBS Tween (PBST är 0,1% Tween 20 i 1 x PBS) per 8 brunnar.
- Förbered 2 mL 10% normala åsna serum (NDS) i 0,1% PBST (10% NDS/PBST) per 8 brunnar.
- Förbered 4 mL 1% NDS i 0,1% PBST (1% NDS/PBST) per 8 brunnar.
-
Färgning dag 1
- Uppsugning av behandlingar och tvätta enteroids med PBS. Tillsätt 250 µL 4% PFA per brunn. Placera på rotator för 1-2 h vid 4 ° C. Ta bort 4% PFA med pipett.
- Tvätta 4 gånger med 250 µL per brunn 1 x PBS. Placera på rotator under 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
Obs: Det är möjligt att lagra plattan för 1-2 dagar vid 4 ° C om det behövs. - Lägga till 250 µL per brunn 0,1% Triton x-100. Inkubera i 1 h på RT. ta bort 0,1% Triton x-100 med pipett.
- Tvätta 4 gånger med 250 µL per brunn 1 x PBS. Placera på rotator för 15 min på RT.
- Lägg till 250 µL per brunn 10% NDS/PBST. Inkubera i 45 min på RT. ta bort 10% NDS/PBST med pipett.
- Tillsätt 250 µL per brunn primär antikropp, utspädd 1/250 i 1% NDS/PBST, och inkubera över natten vid 4 ° C.
Obs: Den optimala antikropp utspädningen varierar beroende på tillverkaren.
-
Färgning dag 2
- Tvätta minst 5 gånger för 4-5 h med 250 µL per brunn PBST. Placera på rotator vid 4 ° C mellan varje tvätt.
- Lägga till 250 µL per brunn sekundär antikropp, utspädd 1/1 000 i 1% NDS/PBST. Linda in plattan i folie och inkubera över natten vid 4 ° C.
-
Färgning dag 3
- Lägga till 250 µL per brunn nukleära fläcken 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) för 15 min.
Obs: Hålla plattan i mörkret. - Tvätta 6 gånger med 250 µL per brunn PBST. Placera på rotator för 10 minuter vid 4 ° C mellan varje tvätt.
- Montera täckglas på avdelningen skjut med montering media.
- Ta bilder med 40 X objektiv confocal Mikroskop och lika återges i ett raster grafikredigerare (se Tabell för material).
- Lägga till 250 µL per brunn nukleära fläcken 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) för 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi försökte först undersöka huruvida uttryckt bröstmjölk eller pastöriserad givare bröstmjölk hade en effekt på små intestinal enteroids. Verkligen, bröstmjölk och givare bröstmjölk ökat tillväxten av neonatal mus (figur 1A) och tidig mänsklig härledda enteroids (figur 1B).
Eftersom bröstmjölk ökade tillväxten av små intestinal enteroids, undersökte vi nästa om bröstmjölk hade en effekt på spridningen av tidig mänsklig enteroids. Vi visar att bröstmjölk ökar spridningen av tidig mänsklig enteroids jämfört med kontroll (figur 2A–B, Ki67, röda färgning). Ännu viktigare, ökat mänskliga givare bröstmjölk också enteroid spridning jämfört med kontroll, men i något mindre grad än icke-pastöriserad bröstmjölk (figur 2B–C). Vi nästa utvärderas uttrycket Ki67 mRNA i den tidig mänsklig enteroids och upptäckte att Ki67 ökades i den enteroids som behandlades med antingen bröstmjölk eller givare bröstmjölk relativt kontrollen (figur 2D).
Nästa ville vi se om dessa effekter var artspecifika när det gäller bröstmjölk. Vi utvecklat ett sätt att samla in bröstmjölk från lakterande möss använder en modifierad kommersiellt tillgängliga mänskliga bröstcancer pump som referenser11,12. Skildras en sövda lakterande dam som genomgår mjölk samling använder denna enhet (figur 3). Nästa serie av experiment utfördes på musen enteroids och vi utvärderat spridning effekterna av uttryckt bröstmjölk från antingen musen, mänskliga eller givare bröstmjölk. Som visas i figur 4, mus, mänskliga, och pastöriserad givare bröst mjölk ökad spridning i mus enteroids jämfört med kontroll (figur 4A–D). Spridning i mus enteroids minskade i närvaro av TLR4 liganden, lipopolysackarid (LPS), jämfört med kontroll (figur 4A, E). Ännu viktigare, mus, mänskliga eller givare bröst mjölk alla återställd enteroid spridning i närvaro av LPS framgår av ökad Ki67 färgning jämfört med LPS ensam (figur 4F–H).
Från våra experiment visar vi att små intestinal enteroids härrör från neonatala möss och förtida mänskliga fostrets tarmen kan upprätthållas i kultur. Vi tillhandahåller ytterligare en roman bröst mjölk samling metod som ger ett effektivt sätt att extrahera bröstmjölk från möss, som sedan kan användas för olika experiment. Vi upptäckte att uttryckt bröstmjölk från människor eller möss ökade storlek, tillväxt och spridning i mus och mänskliga enteroids. Dessutom restaurerade mus, mänskliga och givare bröstmjölk enteroid spridning efter LPS exponering. Detta tyder på att bröstmjölk kan utöva antiinflammatoriska effekter på tunntarmen av möss och människor.
Figur 1. Bröstmjölk och givare bröstmjölk öka storlek och tillväxt av mus och tidig mänsklig enteroids. Mikrofotografier av små intestinal enteroids från neonatala möss (p14) eller för tidig mänsklig tarm behandlades med antingen media (kontroll), bröstmjölk eller givare bröstmjölk (50 µL/mL) för 24 h. storlek bar: 1000 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna Figur.
Figur 2. Bröstmjölk och givare bröstmjölk öka spridningen av tidig mänsklig enteroids. (A) Confocal micrographs av tidig mänsklig enteroids odlade för 5 dagar, behandlade med bröstmjölk och pastöriserad givare bröstmjölk för 24 h och färgas för spridning markören Ki67 (röd) och DAPI (kärnkraft, blå). Storlek bar: 50 µm. (B) qRT-PCR Ki67 uttryck för mänskliga enteroids i förhållande till städning genen RPLO. n = 5 per grupp. p < 0,0001 jämförelser med Student t -test jämfört med kontrollgruppen. Uppgifterna är medelvärde ± standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Insamling av mjölk från en sövda musen använder en modifierad mänskliga bröstpump. Sterila mänskliga bröstcancer pump slangen placeras på spenarna sövda lakterande dam efter injektion av oxytocin. Mus mjölk samlas med mänskliga bröstcancer pumpen på medellång hastighet och kraft i en 5 mL samling röret. Kollektiva volymer ur alla spenar varierar från 500 µL 1 ml per mus på postnatal dagar 7-12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mus, mänskliga, och pastöriserad givare bröstmjölk förbättra mus enteroid spridning. (A-H) Confocal micrographs av p14 liten intestinal mus enteroids (kontroll, en) behandlade med musen bröstmjölk (MBM, B), bröstmjölk (BM, C) eller mänskliga givare bröstmjölk (DBM, D) vid 50 µL/mL av media för 12 h i avsaknad ( A-D) eller förekomst av lipopolysackarid (LPS) vid en dos på 25 µg/mL media för 12 h, (E-H) och färgas för spridning markör Ki67 (röd) och DAPI (kärnkraft, blå). Storlek bar: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intestinal epitel består av många cellulära undertyper som ansvarar för att tillhandahålla värd försvar mot patogener, bibehålla tarmen barriär integritet, och kan brytas i patogenesen av flera sjukdomar. Medan djurmodeller kan sammanfatta några aspekter av sjukdomen, ger ex vivo modellen av enteroids härrör från tunntarmen av möss och människor en plattform för att testa effekterna av olika behandlingar. Betydelsen av den enteroid modellen tillåter forskare att kultur och differentieras intestinal stamceller till alla epitelial cellulära subtyper från naiva eller sjuka djur och människor som inte är tillgängliga med befintliga metoder. Denna modell-systemet kan användas för infektioner med mänskliga patogener som inte kan vara lätt översättas till musen, såsom enterovirus25 eller norovirus26 bland andra. Den enteroid modellen har flera fördelar och ändamål. dock måste vara försiktig att säkerställa konsekvens i de reagens som används för att göra medierna och de specifika exogena tillväxtfaktorer som behövs för överlevnaden av enteroids.
Inom den enteroid modellen är flera steg av avgörande betydelse att säkerställa framgång i att producera enteroids. För att minimera kalla ischemisk tid, bör vävnad behandlas ändamålsenligt. Enteroids kan produceras upp till 24 h efter vävnaden skördas om vävnaden är placerad i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium vid 4 ° C. Detta kan underlätta alternativet av frakt eller transport om så behövs. För etableringen av enteroids vara basalmembranet ett tunt, platt lager längst ned i varje brunn för kryptor att fästa och växa. Om basalmembranet är inte platt eller har bubblor närvarande, kryptor kan misslyckas att följa och kommer att tas bort när media ändras. Efter enteroids är etablerade, kan de överförda varje 7 dagar eller frysta i flytande kväve för långtidsförvaring. Borttagning och tillägg av Crypt kultur Media med tillväxtfaktorer och administreringen av varje behandling måste ske långsamt och till kanten av varje brunn undviks störande i enteroids. Störningar i enteroids kan orsaka dem att bli fristående och tvättas bort när media ändras. För bästa resultat, bör man vara försiktig att bevara integriteten i basalmembranet och den bifogade enteroids.
I den aktuella studien rapportera vi att enteroids härstammar från neonatala möss och prematura barn kan växa och föröka sig i närvaro av olika typer av bröstmjölk. Dessa studier förväg vår förståelse av effekterna av bröstmjölk på förtida tarmen. Vi tillhandahåller en detaljerad metod på hur du upprättar enteroid kulturer i laboratoriet från människor och möss. Dessutom visar vi en effektiv metod för att samla in bröstmjölk från en digivande mus med hjälp av en modifierad elektrisk mänskliga bröstcancer pump. Mänskliga och pastöriserad givare bröstmjölk visar vi denna mus, och förstärka tillväxt och spridning av enteroids från mus och människa. Dessutom visar vi minskade enteroid spridning i närvaro av TLR4 liganden LPS, som återställdes när musen, mänskliga eller givare bröstmjölk administrerades till enteroids. Framtida tillämpningar kan omfatta personlig precision medicin med hög genomströmning drog skärmar på enteroids erhålls från spädbarn efter tarm resektion att se hur vissa mediciner kan påverka särskilt spädbarnet. Sammantaget hoppas vi andra laboratorier finner potentiella framgång i att utnyttja dessa tekniker i många olika sfärer av pediatriska sjukdomar i tarmen, inklusive NEC, där det finns kliniska angeläget att utveckla nya terapeutiska strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja och inga intressekonflikter.
Acknowledgments
MG stöds av bidrag K08DK101608 och R03DK111473 från vid National Institutes of Health, mars av Dimes Foundation Grant nr 5-FY17-79, barnens Discovery Institute i Washington University och St. Louis barns sjukhus och Institutionen för Pediatrik vid Washington University School of Medicine, St. Louis. SIVÖ stöds av R01DK104946 (PI: Silverman), barnens Discovery Institute i Washington University och St. Louis Barnsjukhus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
