Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Vergelijkbare Decellularization van foetale en volwassen cardiale weefsel explantaten als 3D-achtige platformen voor In Vitro Studies

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

De cardiale extracellulaire matrix (ECM) is een complex netwerk van moleculen die orkestreren van belangrijke processen in weefsels en organen terwijl blijvende fysiologische remodelleren gedurende het hele leven. Gestandaardiseerde decellularization van foetale en volwassen hart toelaat vergelijkende experimentele studies van beide weefsels in een 3D-kader door het vastleggen van inheemse architectuur en biomechanische eigenschappen.

Abstract

Huidige kennis van extracellulaire matrix (ECM)-cel communicatie vertaalt naar grote tweedimensionale (2D) in vitro Cultuurwetenschappen waar ECM componenten worden gepresenteerd als een oppervlaktecoating. Deze cultuur systemen vormen een vereenvoudiging van de complexe aard van het weefsel ECM die biochemische samenstelling, structuur en mechanische eigenschappen omvat. Beter wordt geëmuleerd doordat de ECM-cel communicatie vormgeven van de cardiale communicatie, ontwikkelden we een protocol waarmee voor de decellularization van het hele foetale hart en volwassen linkerventrikel weefsel explants gelijktijdig voor vergelijkende studies. Het protocol combineert het gebruik van een hypotone buffer, een detergens van anionogene oppervlakteactieve stof eigenschappen en DNase behandeling zonder enige eis voor gespecialiseerde vaardigheden of apparatuur. De toepassing van dezelfde decellularization strategie over weefselmonsters van onderwerpen van verschillende leeftijd is een alternatieve benadering vergelijkende studies te verrichten. Dit protocol maakt de identificatie van unieke structurele verschillen over foetale en volwassen cardiale ECM mesh en biologische cellulaire reacties. Bovendien, de hierin methodologie toont een bredere toepassing wordt met succes toegepast in andere weefsels en soorten met kleine aanpassingen, zoals in de menselijke darm biopsieën en muis longkanker.

Introduction

De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamisch netwerk van moleculen die belangrijke cellulaire processen, namelijk de lot-besluit, de proliferatie en differentiatie van de1,2te reguleren. Het onderzoek van de cel-ECM interacties heeft verricht voornamelijk in tweedimensionale (2D) in vitro culturen bekleed met ECM componenten, die vormen een vereenvoudiging van de inheemse ECM eigenschappen gevonden in vivo. Decellularization genereert Acellulair 3D-achtige ECM bioscaffolds dat grotendeels de extracellulaire architectuur en samenstelling van inheemse weefsels en organen3,4 behouden. Naast bioactieve steigers voor weefselengineering bijeenkomen, zijn decellularized 3D ECM biomaterialen opkomst als nieuwe platformen te beoordelen van de biologie van de cel-ECM die parallel de in vivo milieu.

Beoordeling van het differentiële rol van de ECM-componenten van verschillende weefsels, organen en leeftijd zullen profiteren met het gebruik van soortgelijke protocollen van het genereren van de inheemse bioscaffolds. In het hart, hebben we een veelzijdige protocol voor decellularization van foetale en volwassene afkomstige monsters, ontwikkeld als een alternatieve benadering voor het uitvoeren van vergelijkende studies van de orgel-communicatie. Met behulp van deze methode, wij gevangen de inheemse cardiale communicatie en toonde dat foetale ECM hogere opbrengsten van de herbevolking van hartcellen5 bevordert. Decellularization verstrekt verdere identificatie van resident structurele verschillen tussen de foetale en volwassen ECM op het niveau van de kelder lamina en pericellular matrix mesh regeling en vezel samenstelling5. Voorafgaand aan dit werk, is er alleen head-to-head vergelijking van weefsels in verschillende ontogenic stadia met behulp van dezelfde decellularization aanpak gemeld voor rhesus monkey nieren en knaagdier harten. Bovendien, verslag een beperkt aantal studies foetaal weefsel/orgel decellularization per se5,6,7. Dit werd bereikt met behulp van SDS als een agent van de unieke decellularization; echter, verschillende SDS concentraties werden gebruikt voor de decellularization van foetale en volwassen cardiale weefsel7,8. SDS is een van de meest effectieve Ionische detergentia voor goedkeuring van de cytoplasmatische en nucleair materiaal, en op grote schaal gebruikt in de decellularization van verschillende weefsels en specimens9,10. Oplossingen met hoge concentraties van SDS en langere blootstellingsduur hebben zijn gecorreleerd met denaturatie van eiwit, glycosaminoglycaan (GAGs) verlies en verstoring van collageen fibrillen10,11, en dus een evenwicht tussen ECM behoud en cel verwijdering is noodzakelijk. Als u wilt dezelfde procedure foetale en volwassen hartweefsel, het protocol hierin beschreven is verdeeld in drie opeenvolgende stappen: lysis van de cel door osmotische schok (hypotone buffer); solubilisatie van DNA-eiwit, lipide-eiwit en eiwit-eiwit interacties (0,2% SDS); en nucleaire materiaal verwijderen (DNase behandeling).

Ons protocol toont verschillende voordelen: ik) de mogelijkheid van gelijkwaardige decellularization van de cardiale weefsels leeftijds-specifieke door de toepassing van dezelfde decellularization strategie; II) geen vereisten voor gespecialiseerde methoden of apparatuur; III) klaar aanpassing aan andere weefsels en soorten als het succesvol is vereffend met kleine veranderingen in de menselijke darm biopsieën12 en muis Long13; en, belangrijker, iv) ECM biomechanische eigenschappen terwijl het toelaten van de vergadering van 3D-achtige organotypic culturen dat meer nauw na te de moleculaire eigenschappen van het oorspronkelijke weefsel communicatie bootsen kunnen worden aangepakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle van de beschreven methoden werden goedgekeurd door de i3S dier ethische Commissie en Direção Geral de Veterinária (DGAV) en zijn volgens de Europese Parlement richtlijn 2010/63/EG.

1. bereiding van de oplossingen van de decellularization

Opmerking: Alle decellularization oplossingen moeten worden gefilterd door een 0,22 μm membraanfilter en opgeslagen voor een maximum van 3 maanden, behalve anders vermeld.

  1. Voor 1 x PBS: Meng 8 g NaCl, 1.01 g nb2HPO4 KCl, 200 mg en 200 mg KH2PO4 met 900 mL gedeïoniseerd water (DI water). Breng oplossing pH 7.5 en het volume van de eindoplossing omhoog om 1 L. Filter, autoclaaf, en sla de oplossing op kamertemperatuur (RT).
  2. Voor hypotone Buffer (10 mM Tris, 0,1% EDTA): Los 1,21 g van TrisBASE en 1 g van EDTA in 900 mL gedeïoniseerd water. PH van de oplossing op 7,8 met NaOH/HCl en het volume van de definitieve oplossing aan 1 L. Filter aanpassen, steriliseren in autoclaaf en opslaan op RT.
  3. Voor 0,2% SDS oplossing (0,2% SDS, 10 mM Tris): 0.6 g TrisBASE en 1 g natrium dodecyl sulfaat (SDS) in 400 mL zuiver DI water toevoegen en roer bij 60 ° C tot volledige opgeloste ontbinding. Laat de oplossing afkoelen RT. Adjust oplossing pH ten slotte op 7,8 en het volume van de definitieve oplossing tot 500 mL. Steriliseren oplossing door filtratie.
    Opmerking: De SDS oplossing moet worden bereid vóór gebruik. Filter oplossing slechts na complete SDS ontbinding, anders de SDS onoplosbare deeltjes het filter, verandert de eindconcentratie van SDS en bijgevolg beïnvloeden weefsel decellularization efficiëntie zal verzadigen.
  4. Voor hypotone was Buffer (10 mM Tris): Meng 1,21 g van TrisBASE in DI 900 mL water. PH van de oplossing op 7,8 en het eindvolume aan 1 L. Filter aanpassen, steriliseren in autoclaaf en opslaan op RT.
  5. Voor DNase behandeling (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): los 2.42 g TrisBASE en 2 mL 1 M MgCl2 in 900 mL DI water. PH ten slotte op 7,8 en het volume van de definitieve oplossing aan 1 L. Filter aanpassen en oplossing door autoclaaf steriliseren. Opslaan van de oplossing bij RT. toevoegen DNase ik (50 U/mL) voorafgaand aan het gebruiken.
  6. Voor DNase ik stockoplossing: bereiden van een buffer van de DNase met 50% glycerol, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, en aan te passen aan een eindoplossing volume van 10 mL met DI water. Voeg de DNase ik poeder aan de buffer DNase en meng zachtjes tot volledige ontbinding in een laminaire flow hood. Steriliseren oplossing door 0,22 μm filter. Bereiden 1 mL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C.

2. de weefsels oogsten en cryopreservatie

  1. Euthanaseren volwassen zwangere vrouwtjes 18 dagen van de dracht (E18 foetussen) via CO2 verstikking. Het uitvoeren van een keizersnede op de vrouwtjes met een chirurgische schaar en verzamelen de baarmoeder horens, rekening houdend met de foetale muizen aan een petrischaal met ijskoude 1 x PBS twee getande pincet met gekromde uiteinden (één pincetten aan weerszijden van de hoorn).
    1. Open de baarmoeder horens en vruchtwater sac te isoleren van de foetussen. De foetussen overbrengen in een nieuwe petrischaal met ijskoude 1 x PBS anesthetize hen te onthoofden met een schaar.
    2. 7-8 weken oud mannelijke C57BL/6 muizen met behulp van CO2 verstikking euthanaseren. Het uitvoeren van een incisie op elke muis borst en verzamelen van het hart.
    3. Kort spoelen foetale en volwassen harten met ijs koud 1 x PBS.
  2. Verwijder de atria van volwassen hart met behulp van een scalpel. Een sneetje op de rechterventrikel uitvoeren en verwijderen met behulp van rechte kleine schaar. De binnenwand van de linkerventrikel bloot door het verwijderen van het tussenschot. In een nieuwe petrischaal, verdeel het linkerventrikel gratis-muur in longitudinale stroken met 2 mm dikte en verwijder de papillaire spier met behulp van een scalpel en gekartelde pincet met gekromde uiteinden.
    1. Accijnzen kleine weefsel explantaten met behulp van een scalpel met behulp van een 2 x 2 mm raster (gedetailleerde beschrijving in aanvullende Figuur 1-5). Kort spoelen weefsel explantaten met 1 x PBS.
  3. Voeg ~ 250 µL van de temperatuur van de optimale scherpe (OCT) samengestelde gesteriliseerde met autoclaaf 1,5 mL microcentrifuge buizen. Hele foetale hart en volwassen cardiale explantaten overbrengen naar de buizen met 250 µL van LGO en bevriezen ze met droogijs-gekoelde tolueen en winkel bij-80 ° C (tot een maximum van 6 maanden).
    Opmerking: Het gebruik van cardiale weefsel explantaten cryopreserved voor meer dan 6 maanden zal de efficiëntie van de decellularization, vooral in de volwassen hart weefsel explantaten aanzienlijk verminderen.

3. de weefsels decellularization

Opmerking: Cardiac weefsel decellularization wordt uitgevoerd in een 24-well weefselkweek plaat met één monster per putje. 1 mL van de oplossing van elke decellularization wordt toegevoegd aan elk individu goed. Alle decellularization stappen moeten worden uitgevoerd met agitatie bij 165 t/min (incubator shaker met een orbitale diameter van 20 mm) en bij 25 ° C, tenzij anders is bepaald. Voor meer details, Raadpleeg de regeling op figuur 1A. Amfotericine B (bijvoorbeeld fungizone) en gentamicine zijn vers toegevoegd aan alle decellularization oplossingen voor gebruik aan een eindconcentratie 2.5 μg/mL of 0,01 μg/mL, respectievelijk. Te kwantificeren van de hoeveelheid DNA bewaard in decellularized weefsels, de steekproef massa moet worden vastgesteld vóór het begin van het decellularization-protocol. Het DNA kwantificering protocol is verder beschreven in punt 5.1.

  1. DAG 1
    1. Verwijderen van weefselmonsters uit de diepvries-80 ° C. Laat de 1,5 mL microcentrifuge buizen op RT tot OCT wordt gedeeltelijk gesmolten. Het blok van de cardiale weefsel van de nog steeds bevroren LGO overbrengen in een petrischaal met 1 x PBS.
    2. Nadat de LGO smelt, verplaatst u het cardiale weefsel naar een nieuwe petrischaal met 1 x PBS. Wash monsters in 1 x PBS en op 60 rpm met een shaker voor 10-15 min. herhalen ten minste tweemaal
    3. Voeg 1 mL hypotone Buffer per putje van de plaat van een steriele 24-well weefselkweek werken. Overdracht van één monster per putje met behulp van een pincet.
    4. De 24-well weefselkweek plaat met de monsters naar een incubator shaker bij 25 ° C en begin van de 18 h incubatie met hypotone Buffer.
  2. DAG 2
    1. Bereid de 0,2% SDS oplossing zoals beschreven in punt 1.3.
    2. De hypotone Buffer gecombineerd en wassen van de monsters met 1 x PBS voor 1 h. Herhaal 3 keer.
      Opmerking: Pauze punt: weefsel onder decellularization in 1 x PBS bij 4 ° C voor 18u in statische toestand kan worden gehouden.
    3. Verwijder de 1 x PBS, voeg 1 mL vers gemaakte SDS oplossing (stap 1.3) per putje en incubeer monsters gedurende 24 uur.
      Opmerking: (Zie punt) Post SDS incubatie, zorgen dat monsters een witte tot doorschijnend uiterlijk vertonen. Bij deze stap SDS behandeld monsters zijn gedrenkt in DNA, een gelatine-achtige consistentie tonen. Verwijderen van SDS oplossing langzaam om te voorkomen dat monster hechting op het uiteinde van de pipet.
  3. DAG 3
    1. De monsters met hypotone wassen Buffer (1 mL per putje) voor 20 min. Herhaal 3 keer wassen.
      Opmerking: Bij deze stap, het is normaal dat het observeren van een afname van de grootte van de steekproef als gevolg van de verwijdering van resten van de cel. PAUZE punt: Weefsel onder decellularization kan worden gehouden in hypotone was Buffer bij 4 ° C voor 18u in statische toestand.
    2. Voeg 1 mL DNase behandeling oplossing per putje en Incubeer de monsters gedurende 3 uur bij 37 ° C.
    3. De DNase behandeling oplossing gecombineerd en wassen van de monsters met 1 x PBS (1 mL per putje) voor 20 min. Herhaal 3 keer. Uitvoeren van een definitieve wassen met 1 x PBS (1 mL per putje) 's nachts op RT en schudden op 60 rpm.
    4. (Check point) Na de DNase behandeling, ervoor zorgen dat de decellularized monsters de gelatine-achtige consistentie hebben verloren.
      Opmerking: Na de DNase behandeling, verwijder en voeg 1 x PBS voorzichtig omdat monsters kunnen gemakkelijk worden in de val gelokt en gekoppeld aan het uiteinde van de pipet.

4. beoordeling van de decellularized weefsel cel verwijderen

  1. De monsters in een 24-well weefselkweek plaat, 1 monster per putje, te corrigeren door toevoeging van 1 mL van versgemaakte 10% formaline neutrale buffer met 0,03% waterige eosine gedurende 2,5-3 uur aan RT.
    Opmerking: Eosine wordt toegevoegd aan de fixatief om vlek het decellularized weefsel en te vergemakkelijken van monster visualisatie tijdens segmenteren en histologische kleuring. De toevoeging van de eosine die niet met de histologische vlekken noch met immunofluorescentie technieken interfereert. Als alternatief, de fixatie kan 's nachts worden uitgevoerd bij 4 ° C.
  2. Verwijder de kleefpoeders oplossing en voeg 1 mL 1 x PBS te wassen van het monster.
  3. Kapselen de vaste bioscaffolds in histologie verwerking gel met behulp van een mal wegwerp vinyl specimen volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Verwijder de histologie gel met het monster van de schimmel en de overdracht ingebed om biopsie Processing/Embedding Cassettes met deksel.
    Opmerking: Een alternatief voor weefsel insluiten in de histologie en verwerking van gel is voor het verwerken van elk monster in twee biopsie sponzen met kleine poriën. De monsters moeten worden gelokaliseerd op het midden van de biopsie sponzen detectie inschakelen. Van de nota kunnen sommige monsters moeilijk te lokaliseren met behulp van deze aanpak.
  5. Verwerken van de monsters voor paraffine insluiten via opeenvolgende incubations (30 min per oplossing) in reeks concentraties alcohol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), solvent alifatische koolwaterstof oplossing (2 incubatie-stations) en paraffine (2 incubatie stations) op 56 ° C.
  6. Monteer de monsters in een blok van paraffine.
  7. Snij 3 μm dik paraffine secties op een microtoom en verzamelen van de secties op glas Microscoop dia's.
  8. Droge paraffine secties overnachting bij 37 ° C.
    Opmerking: (Pauze punt) paraffine secties worden opgeslagen bij 4 ° C tot verder gebruik.
  9. Uitvoeren om te controleren of de efficiëntie van het protocol, Hematoxilin en eosine (H & E) en Masson van Trichrome kleuring (MT) van de decellularized monster afdelingen en secties van niet-gemanipuleerd weefsel volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: H & E kleuring vlekken cel kernen blauw/paars, cytoplasma donker roze/rood en collageen bleke roze en MT vlekken kernen zwart, rood, cytoplasma en collageen en mucin blauw. Efficiënte decellularization wordt bereikt wanneer een poreuze lichtroze (H & E, MT) en blauwe (MT) netwerk wordt waargenomen, in het ontbreken van een nucleaire vlek.

5. beoordeling van de decellularized weefsel nucleaire materiaal verwijderen

Opmerking: De kwantificering van de DNA-inhoud op decellularized weefsel moet worden uitgevoerd in vergelijking met de respectieve niet-gemanipuleerd weefsel.

  1. Weeg voor decellularization, een tube van 1,5 mL microcentrifuge op een hoge precisie digitale weegschaal. Het cardiale weefsel overbrengen in de buis, verwijder de extra hoeveelheid 1 x PBS en wegen van de buis met de monsters. Bereken het natte gewicht van de monsters:
    Monsterversgewicht = gewicht buis met monsters -gewicht lege buis
  2. Decellularize de monsters zoals beschreven in stap 3.
  3. Na de decellularization, de decellularized weefsels in een microcentrifuge-buis te verzamelen.
    1. Wegens de kleine afmetingen en de massa van de afzonderlijke cardiale monsters en kit specificaties, zwembad decellularized weefsels van elke steekproef voorwaarde (foetale hart: 5 hele hart; volwassen LV explantaten: 15 explantaten). Uitvoeren van dezelfde procedure met het niet-gemanipuleerd weefsel.
      Opmerking: (Pauze punt) de monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot DNA-extractie en kwantificering worden uitgevoerd.
  4. Snijd de niet-gemanipuleerd en decellularized weefsels in kleine explantaten met behulp van een scalpel in een schone petrischaal.
    Opmerking: Gebruik een individuele scalpel en de petrischaal voor elk monster. Mechanische verstoring van de monsters met een scalpel vergemakkelijkt hun achterste enzymatische spijsvertering en daarop volgende DNA-extractie.
  5. Gebruik voor DNA-extractie, een spin-kolom gebaseerde DNA-extractiemethode volgens de instructies van de fabrikant.
    1. De mechanisch gedissocieerde monsters van de petrischaal met de master spijsvertering buffer (buffer van de spijsvertering en proteïnase K) volgens de instructies van de fabrikant met een brede opening pipette uiteinde verzamelen.
      Opmerking: De lysis van de weefsel met proteïnase K spijsvertering is sneller in decellularized monsters. Voor het verwerken van verschillende monsters op hetzelfde moment, houd lysed monsters op ijs, totdat alle monsters zijn lysed om te minimaliseren van afbraak. Lysis van de volledige monsters wordt bereikt tussen 4-6 h.
    2. Ga verder met het protocol volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Het vergroten van de opbrengsten van de geëxtraheerde DNA van decellularized en niet-decellularized weefselsteekproeven, elueer de DNA op μL van de 25-50 en 100 μl van elutie buffer, respectievelijk. De eluted DNA verzamelen en laden van de spin-kolom. Incubeer gedurende 1 minuut op RT. Centrifuge de monsters volgens de instructies van de fabrikant.
      Opmerking: (Pauze punt) de DNA geëxtraheerd uit de monsters kan worden opslag bij-20 ° C tot verder gebruik.
  6. Kwantificeren van de geëxtraheerde DNA van de monsters met een fluorescerende dsDNA detectie kit na instructies van de fabrikant.
  7. Normaliseren van de DNA-inhoud als nanogram van DNA per milligram versgewicht van het oorspronkelijke monster (vóór decellularization).

6. decellularized steigers cel zaaien

Opmerking: Alle oplossingen/reagentia moeten steriel en de gehele procedure uitgevoerd onder steriele omstandigheden.

  1. Bereiden 1 x DPBS met 2,5 μg/mL amfotericine B en 1% P/S (penicilline, 100 I.E.; streptomycine 100 µg/mL).
  2. Verwijder de 1 x PBS oplossing uit de laatste decellularization wassen stap (stap 3.3.3) en voeg 500 μl per putje van de vers bereide 1 x DPBS/2.5 μg/mL amfotericine B/1% P/S oplossing. Opslaan van monsters bij 4 ° C van 1-7 dagen.
    Opmerking: Opslag van de monsters bij 4 ° C is belangrijk aan het handhaven van de steriliteit.
  3. P/S cel basale media (zonder FBS en supplementen) tot een uiteindelijke concentratie van 1% toevoegen.
  4. 1 x DPBS/2.5 μg/mL amfotericine B/1% P/S oplossing van de decellularized monsters gecombineerd. Voeg 500 l per putje van cel basale media/1% P/S en laat monsters equilibreer gedurende 1 uur bij 37 ° C of bij 4 ° C voor meer dan 1 h.
  5. Splits de cellen van belang en het bereiden van kleine porties van cellen bij de celdichtheid gewenst.
    Opmerking: Het decellularized weefsel zaaien moet worden uitgevoerd onder een stereoscopische Microscoop en onder steriele omstandigheden. Cel cultuurmedia moet bevatten 1% P/S.
  6. Pipetteer 3-4 μL van DPBS naar het midden van een goed van een 96-wells-plaat. Met behulp van dunne en rechte pincet, de decellularized steigers overbrengen in de daling van de DPBS, de extra DPBS verwijderen door aspiratie en ervoor te zorgen dat het monster niet gevouwen of gekreukt. Laat het aan de randen vast te houden aan het oppervlak goed droog worden.
    Opmerking: Vrijstaande steigers hebben lagere seeding efficiëntie.
  7. Cellen toevoegen aan de steiger door pipetteren de eencellige oplossing langzaam tegen de randen van de put.
    Opmerking: bijvoorbeeld, neonatale rat cardiomyocytes zijn bezaaid met een dichtheid van 7.500 cellen/mm2 en vereeuwigd muis Lin− Sca-1+ cardiale voorlopercellen (iCPCSca-1) bij een dichtheid van 60-1.500 cellen/mm2. Aanpassen volgens de experimentele gedachte van de celdichtheid.
  8. Voeg DPBS toe aan de naburige putjes om snelle verdamping.
  9. 24 uur post cel zaaien, als het celtype gebruikt de weefselkweek polystyreen platen (TCPS), in acht genomen bioscaffolds aan een nieuwe goed overdragen. Anders Vervang het medium niet-aanhanger cellen verwijderen.
  10. Wijzigen zorgvuldig de media volgens de specifieke eisen van het celtype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De efficiëntie van de decellularization moet worden beoordeeld door middel van de drie belangrijkste technieken: macroscopische observatie, histologie en kwantificering van het DNA. De macroscopische verschijning van monsters post-SDS behandeling heeft niet indirect invloed op de werkzaamheid van cel verwijderen. Na een incubatieperiode van SDS, monsters moeten worden weergegeven als doorschijnend onder witachtig (Figuur 1 c). Fetal (E18) decellularized weefsels worden gekenmerkt door een zeer transparante structuur, terwijl volwassen explantaten een doorschijnend onder wit uiterlijk hebben. Een witter verschijning is meestal gecorreleerd aan een netwerk van de ECM exposeren hogere vezel en collageen inhoud, bijvoorbeeld de volwassen ventriculaire en vasculaire vaten ECM mesh (Figuur 1 c). De Haematoxyline en eosine (H & E) en/of Masson van Trichrome (MT) vlekken worden uitgevoerd om efficiënte cel verwijderen te bevestigen door de observatie van een poreuze Maas (lichtroze, H & E, licht roze en blauw, MT) (Figuur 1 c). Bovendien belicht de MT vlek de collageen zitschalen in blauwe5. Goedkeuringvande nucleair materiaal na decellularization wordt benaderd door DNA kwantificering en een vermindering van ongeveer 99,8% is over het algemeen verkregen, in vergelijking met niet-gemanipuleerd weefsels (Figuur 1 c). De aanwezigheid van nucleair materiaal op decellularized steigers is bestempeld als een trigger voor ongewenste inflammatoire respons na implantatie14. Om deze reden is de bevestiging van efficiënte decellularization van essentieel belang vóór native 3D steiger herbevolking experimenten. Decellularized steigers mogen worden opgeslagen onder steriele omstandigheden tot het zaaien met de cellen van belang. Levensvatbaarheid van de cellen wordt gecontroleerd gedurende in vitro cultuur door calceïne kleuring (figuur 2A). Niettemin kunnen calceïne vlek cytotoxisch zijn voor gevoelige celtypes. Terminal analyse van cel herbevolking en distributie in de steigers is uitgevoerd na paraffine verwerking; een momentopname van de herbevolking van het bioscaffold beoordeeld door H & E kleuring op een centraal gedeelte van de bioscaffolds wordt weergegeven (figuur 2B, 2 C).

Figure 1
Figuur 1. Fetal (E18) en de volwassen cardiale weefsel decellularization procedure en de bevestiging van de efficiëntie van de decellularization. (A) het protocol. (B) Decellularization protocol gedetailleerde. (C) macroscopische analyse van cardiale foetale en volwassen weefsel voor en na decellularization. Schaal bar: 2 mm. (D) kwantificering van nucleair materiaal in decellularized versus niet-gemanipuleerd weefsel. Gegevens uitgedrukt als bedoel ± SEM. Student t-test, tweezijdige * p < 0.05. (E) H & E en Masson van Trichrome histologische analyse van cardiale foetale en volwassen weefsel voor en na decellularization. Schaal bar: 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Herbevolking analyse van decellularized steigers bezaaid met Lin - Sca-1+ cardiale voorlopercellen cellijn (iCPCSca-1). (A) levensvatbaarheid van hoge cellen waargenomen bij steigers oppervlak tijdens in vitro cultuur door calceïne vlek (groen). Schaal bar: 100 μm. (B) cel nummer en distributie via steigers beoordeeld via H & E kleuring. Schaal bar: 100 μm. (C) orthogonale weergave van cellen die zijn ingesloten in de decellularized ECM. Confocale afbeelding van 50μm-dikke paraffine sectie. Schaal bar: 10 μm (orthogonale Bekijk XZ, YZ) en 40 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Stap Observatie Mogelijke oorzaak Probleem Oplossing
3.1.2. Weefsel met een bruinachtige kleur Monster Cryofixatie; unstable vriestemperatuur Monster Cryofixatie zal leiden tot inefficiënte verwijdering van cytoplasmatische eiwitten Bevroren weefsel te slaan gedurende kortere perioden. Controleren van de diepvries temperatuur en stabiliteit
3.2.4. Roze-naar-wit dekkend monsters SDS oplossing was niet goed voorbereid; volwassen LV explantaten te groot Inefficiënte verwijdering van cytoplasmatische eiwitten Zorgen voor volledige ontbinding van de SDS. Decellularize monsters van kleinere omvang.
3.3.4. Monsters met een gelatine-achtige uitstraling Inefficiënte DNA verwijdering Inefficiënte nucleaire materiaal goedkeuring Verhoog DNase concentratie en/of incubatie tijd.
4.6. Histologie gel verdichting Lange wachttijd in PBS1X/ethanol vóór de paraffine verwerking Wijziging van decellularized weefsel structuur Start histologische zo spoedig mogelijk verwerken
6.6. Gedroogde decellularized monsters Monsters werden verlaten om droog te lang Permanente ineenstorting van decellularized weefsel. Inefficiënte cel zaaien Toestaan van monsters alleen in de periferie om te worden aangesloten op de bodem van de put tijdens het zaaien lichtjes droge
6.7. Decellularized monster detachement tijdens zaaien Monsters waren niet voldoende gedroogd vóór het zaaien Inefficiënte cel zaaien Verhogen van de droogtijd van het ECM om betere naleving voorafgaand aan cel zaaien

Tabel 1. Oplossen van problemen met tafel voor parallelle decellularization van foetale (E18) en volwassen muis cardiale weefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De extracellulaire matrix (ECM) is een zeer dynamische en complexe Zitschalen van vezelig en zelfklevende glycoproteïnen, bestaande uit een reservoir van tal van bioactieve peptiden en prikroller groeifactoren. Als de grote modulator van cel adhesie, cytoskelet dynamiek, beweeglijkheid/migratie, proliferatie, differentiatie en apoptosis regelt ECM actief cellulaire functie en gedrag. Wetende dat cellulaire gedrag in 2D- en 3D-culturen verschilt, zijn er inspanningen voor de ontwikkeling van nieuwe organotypic modellen die natuurlijke weefsel omgevingen nauwkeurig kunnen repliceren. In de afgelopen jaar heeft weefsel decellularization ontpopt als een alternatieve techniek om weefsel engineering en regeneratieve geneeskunde. Weefsel- en orgaanbanken decellularization is dus op dit moment het middel bij uitstek om te beter ontleden weefsel-specifieke microenvironmental parameters (biochemische, structurele en mechanische) en de biologische activiteit in vitro en in vivo.

We ontwikkelden een protocol dat het gebruik van een hypotone buffer met een schoonmaakmiddel van anionogene oppervlakteactieve stof eigenschappen gevolgd door een DNase behandeling5,12,13 combineert. Dit protocol vormt een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van vergelijkende analyse tussen decellularized foetale en volwassen muis cardiale weefsel. Onze ervaring met andere weefsels, namelijk met tumor monsters afgeleid van kankerpatiënten chirurgische resections en muis longweefsel, blijkt dat dit protocol gemakkelijk aanpasbaar en succesvol in andere omstandigheden is en12,-13modellen. De toepassing van dezelfde decellularization procedure op verschillende monsters kunt vergelijkende studies van de ECM samenstelling, biomechanische eigenschappen, architectuur en cellulaire f eigenschappen in een 3D-kader.

Een van de moeilijkste uitdagingen van weefsel decellularization is het evenwicht tussen regelrechte cel verwijderen, ECM gevlochten behoud en weefsel biocompatibiliteit. Vandaar, verschillende kritische stappen moeten zorgvuldig worden overwogen, zoals de tijd van weefsel cryopreservatie vóór decellularization, de juiste explant grootte, het gebruik van nieuwe oplossingen en de manipulatie van de laatste decellularized weefsel. Tijdens onze studie zien we een directe correlatie tussen lange opslagtijd voor cryopreserved weefsel en het gebruik van lange SDS oplossingen met decellularization inefficiëntie. Lange termijn weefsel opslag leidt tot inefficiënte verwijderen van cellulaire inhoud rendering overblijfselen van dikke cellulaire gebieden (zonder kernen) onder het complex ECM gevlochten. Een soortgelijk ongewenste effect wordt bereikt wanneer lange opgeslagen SDS oplossingen worden gebruikt voor weefsel decellularization, waarschijnlijk omdat SDS oplossingen een korte stabiliteit als gevolg van beperkte oplosbaarheid, hydrolyse en pH wijzigingen over tijd15,16 hebben . Het gebruik van explantaten van het juiste formaat (~1.5 x 1.5 x 1.5 mm) is ook essentieel voor succesvolle volwassen weefsel decellularization, aangezien grotere weefsel resections moeilijker zijn te decellularize, weergave van cel puin aan de oppervlakte in de val gelokt en gearresteerd tussen het dichte netwerk van ECM. Maar dit protocol een efficiënte methode van cardiale weefsel decellularization biedt, kan een kleine fractie van volwassen explantaten presenteren cel overblijfselen, in het bijzonder die van een groter formaat. Histologische analyse van deze monsters verlicht hun identificatie en de daaropvolgende uitsluiting uit de studie. Uiteindelijk, het protocol hierin is veelzijdig en gemakkelijk toepasbaar met verschillende modellen met lichte aanpassingen aan de weefsel explant grootte, SDS concentratie (0,1-0,2% SDS) of oplossing incubatie tijd5,12,13 .

De belangrijkste beperking van de huidige methode is dat de manipulatie van kleine omvang monsters, dat wil zeggen lymfkliertest foetale hart en volwassen hart explants, sommige afhandeling vaardigheden vereist. In feite, zijn zowel de volwassen als de foetale decellularized weefsels delicate structuren die permanent vervormd kunnen wanneer tijdens de procedure gedroogd of in de val gelokt door de dunne Pipetteer tip of tijdens de behandeling met pincet5.

De grote nieuwigheid van dit protocol, naast de parallelle decellularization van foetale muis hart en volwassen linker ventrikel explantaten voor vergelijkende evaluatie van de samenstelling van de ECM (biomechanische analyses) en de bijbehorende biologische functie, is zijn eenvoudige vertaling naar de verschillende weefsels en modellen5,12,-13. De decellularization van weefsels van verschillende leeftijden door het toepassen van de gestandaardiseerde methodologie werd beschreven alleen op de rhesus aap nier en de dwarse secties van volwassen, foetale en neonatale weefsels, die werden onderworpen aan een behandeling SDS 1% voor 10 dagen6 . In een cardiale omgeving, hoewel foetale, Neonatale en volwassen weefsels hebben al decellularized, verschilden de methoden op de mate van mechanische loskomen, SDS concentraties en tijdstip van toepassing7,8. Zoals elke decellularization procedure is van invloed op de ECM op een unieke wijze, kan de vergelijking van decellularized monsters verkregen uit verschillende protocollen leiden tot verkeerde conclusies worden getrokken. Vandaar, dezelfde decellularization procedure toe te passen op verschillende monsters maakt een betrouwbare vergelijkende analyse.

De grote meerderheid van de verkrijgbare decellularized weefsels ontlenen volwassen exemplaren17. Ondanks de groeiende erkenning voor een verhoogde vermogen van foetale microenvironments bij het verstrekken van pro-regeneratieve signalen ten opzichte van hun volwassen tegenhangers, was decellularization van foetale weefsels alleen gerapporteerd in enkele studies5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. begrip ECM dynamiek tijdens het verouderingsproces zal doorslaggevend zijn voor het identificeren van de unieke kenmerken van pro-regeneratieve microenvironments die, beurtelings, zal de invloed van de ontwikkeling van hogere efficiëntie biomimetische-materialen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs zijn dank verschuldigd aan alle leden van Pinto-Ken-Ó laboratorium voor relevante kritische bespreking. Dit werk werd gesteund door Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) kader van het project "CARDIOSTEM-Engineered cardiale weefsels en stamcel gebaseerde therapieën voor cardiovasculaire toepassingen" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. is een ontvanger van een FCT fellowship [SFRH/BD/88780/2012] en M.J.O. is een FCT Fellow (FCT-onderzoeker 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

Bioengineering kwestie 145 Decellularization extracellulaire matrix 3D steigers foetale hart volwassen hart cardiale weefselengineering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Vergelijkbare Decellularization van foetale en volwassen cardiale weefsel explantaten als 3D-achtige platformen voor In Vitro Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter