تتالي الانزيمية ردود لتوليف الكحوليات الأمينية مراوان L-يسين
Summary
الكحوليات الأمينية مراوان جزيئات تنوعاً للاستخدام السقالات في التوليف العضوي. بدءاً من L-يسين، نحن توليف الكحوليات الأمينية بفعل تتالي الانزيمية الجمع بين أكسدة دياستيريوسيليكتيفي ح ج تحفزها ديوكسيجيناسي متبوعاً بانشقاق مجموعة حمض الكربوكسيلية الأحماض الأمينية هيدروكسيل المقابلة من ديكاربوكسيلاسي.
Abstract
الكحوليات الأمينية مركبات تنوعاً مع طائفة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، فقد استخدمت مراوان السقالات في التوليف العضوي. على توليف بالكيمياء العضوية التقليدية وغالباً ما يتطلب عمليات التوليف متعددة خطوة شاقة، مع صعوبة السيطرة على نتائج الخبراء. نقدم بروتوكول انزيماتيكالي سينثيتيزي الكحوليات الأمينية بدءاً من L-يسين متاحة بسهولة في 48 ساعة. هذا البروتوكول ويجمع بين اثنين من التفاعلات الكيميائية التي يصعب جداً القيام بتجميع العضوية التقليدية. في أول خطوة ريدجو-ودياستيريوسيليكتيفي أكسدة السندات ح ج اونكتيفتد ليسين هو الجانب-سلسلة تحفزها ديوكسيجيناسي؛ أكسدة ريدجو ودياستيريوسيليكتيفي ثانية تحفزها ديوكسيجيناسي ريجيوديفيرجينت يمكن أن يؤدي إلى تشكيل 1، 2-ديولس. في الخطوة الأخيرة، هو المشقوق كاربوكسيليك مجموعة الحمض الأميني ألفا من ديكاربوكسيلاسي pyridoxal-فوسفات (حزب العمال التقدمي) (DC). هذه الخطوة ديكاربوكسيلاتيفي يؤثر فقط على الكربون ألفا من الأحماض الأمينية، الاحتفاظ بمركز ستيريوجينيك هيدروكسي استبداله في وضع بيتا/غاما. ولذلك يتم إثراء الكحوليات الأمينية الناتجة بصريا. البروتوكول تم تطبيقها بنجاح على توليف سيميبريباراتيفي-مقياس للكحوليات الأمينية الأربعة. رصد ردود الفعل التي أجرى بها كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) بعد derivatization 1-مخفضات-2، 4-دينيتروبينزيني. تنقية مباشرة باستخراج المرحلة الصلبة (SPE) أتاحت الكحوليات الأمينية مع المحاصيل ممتازة (93 في المائة إلى > 95%).
Introduction
على الرغم من المزايا التي تتيحها بيوكاتاليسيس، تكامل الخطوات بيوكاتاليتيك في المسارات الاصطناعية أو مجموع طرق بيوكاتاليتيك يظل معظمها يقتصر على القرارات الحركية الانزيمية. تستخدم هذه الطرق على نطاق واسع كخطوة أولى في توليف الكيماوي الانزيمية غير متماثلة، ولكن بيوكاتاليسيس يوفر العديد من الإمكانيات أكثر في المجموعة الوظيفية إينتيركونفيرسيونس مع ستيريوسيليكتيفيتي عالية1،2،3 . وعلاوة على ذلك، كردود فعل بيوكاتاليتيك تجري في ظروف مماثلة، أنه من الممكن ولذلك القيام بسلسلة من ردود الفعل في وعاء واحد أزياء4،5.
مراوان الكحوليات الأمينية جزيئات تنوعاً للاستخدام كمساعدين أو السقالات في توليف العضوية6. كثيرا ما يتم العثور على مجموعة الأمينية الكحول في نواتج الأيض الثانوية والمكونات الصيدلانية الفعالة (API). كحول β الأمينية الأساسية متوفرة بسهولة من الأحماض الأمينية α المقابلة بالتوليف الكيميائي التقليدية، ولكن الوصول إلى كحول γ الأمينية مراوان أو الكحوليات الأمينية الثانوية يتطلب في أغلب الأحيان مملة المسارات الاصطناعية جنبا إلى جنب مع الحساسة مراقبة الفراغية7،،من89،10. نظراً لأن ستيريوسيليكتيفيتي عالية، بيوكاتاليسيس قد توفر طريقا اصطناعية متفوقة على هذه اللبنات مراوان11،12،،من1314.
نحن سابقا عنها التوليف من مونو-ودي-هيدروكسي-L-ليسينيس دياستيريوسيليكتيفي هيدروكسيليشن الانزيمية تحفزها ديوكسيجيناسيس الحديد (II)/α-كيتواسيد-تعتمد على الأسرة أوكسيجيناسي (αKAO) (الشكل 1)15. على وجه الخصوص، بدءاً من L-يسين، ديوكسيجيناسي KDO1 يحفز التشكيل (ق3)-هيدروكسي مشتقة من (1)، بينما (ص4)-يتشكل مشتق (2) برد فعل مع ديوكسيجيناسي KDO2. هيدروكسيليشنز ريجيوديفيرجينت المتعاقبة ب KDO1 و KDO2 يؤدي إلى التشكيل (3ص،ص4)-ديهيدروكسي-L-يسين (3) في شكل نقي بصريا. ومع ذلك، يعوق الركازة محدودية نطاق هذه الإنزيمات الاستفادة منها كبيرة في التوليف الكيميائي، خاصة في هيدروكسيليشن الأمينات البسيطة، كما ضروري لنشاط16مجموعة حمض الكربوكسيلية في α-موقف المجموعة الأمينية.
رقم 1: تحويلات بيوكاتاليتيك من L-يسين- تحويل (3ق)-هيدروكسي-L-يسين (1) تحفزها ديوكسيجيناسي KDO1؛ (4ص)-هيدروكسي-L-يسين (2) تحفزها ديوكسيجيناسي KDO2؛ و (3ص،ص4)-ديهيدروكسي-L-يسين (3) فعل تتالي تحفزها تباعا ديوكسيجيناسيس KDO1 و KDO2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
إزالة رد فعل مشترك في الأيض17. على وجه الخصوص، الأحماض الأمينية DCs (EC 4.1.1) هي خالية من مساعد (بيروفويل-التابعة) أو الإنزيمات تعتمد على حزب العمال التقدمي، وتحفيز إزالة الأحماض الأمينية إلى بوليامينيس المقابلة في البكتيريا والكائنات أعلى18،19 , 20 , 21 , 22-مونو-وديهيدروكسي المركبات (الشكل 3) 4–7، 10–11 تناظر الهيدروكسيلية كادافيريني، ديامينى التي حصل عليها إزالة L-يسين. كادافيريني لبنة أساسية للصناعة الكيميائية، وعلى وجه التحديد مكون بوليمرات البولي أميد والبولي. ولذلك، الإنتاج القائم على السيرة الذاتية لهذا ديامينى من الموارد المتجددة جذبت الاهتمام كبديل للمسار القائم على النفط، والكائنات الحية الدقيقة المختلفة وقد تم تصميمها لهذا الغرض. في هذه المسارات الأيضية، يسين DC (أقل البلدان نمواً) هو إنزيم الرئيسية. أقل البلدان نمواً إنزيم تعتمد على حزب العمال التقدمي المنتمين إلى ألانين راسيماسي (ع) هيكلية الأسرة23. حزب العمال التقدمي-تعتمد على وحدات تحكم المجال Dc (حزب العمال التقدمي-DCs) معروفة لتكون الركيزة الخاصة بدرجة عالية. ومع ذلك، تملك الإنزيمات قليلة القدرة على المجون طفيف، بنشاط نحو L ornithine و L-يسين من الأحماض الأمينية، كما على سبيل المثال أقل البلدان نمواً من روميرانتيوم سيلينوموناس (سروممن أقل البلدان نمواً)، الذي لديه ثوابت الحركية مماثلة ل يسين و ornithine إزالة24،25. هذه الركيزة الموسعة خصوصية يجعل هذا الإنزيم مرشح جيد لإزالة من مونو-ودي-هيدروكسي-L-يسين. وبالإضافة إلى ذلك، للبحث عن وحدات تحكم المجال Dc النشطة نحو مشتقات جذور الهيدروكسيل ليسين، قمنا بدراسة سياق الجينوم الجينات ترميز الإنزيمات αKAO. وفي الواقع، في جينومات بدائية الجينات ترميز الإنزيمات المشاركة في نفس مسار السكروز هي عموما شارك مترجمة في مجموعات الجينات. تم العثور على الجين KDO2 (من بينينسيس تشيتينوفاجا) المترجمة يشترك مع أحد جينات ترميز المفترضة حزب العمال التقدمي-DC (الشكل 2). وفي المقابل، لا ترميز الجينات للعاصمة قد وجد عند تحليل سياق المجينية ديوكسيجيناسي KDO1. ولذلك اختير البروتين حزب العمال التقدمي-العاصمة من بينينسيس جيم (DCCpin) كمرشح واعدة لتحفيز هذه الخطوة إزالة من رد فعل تتالي.
رقم 2: سياق المجينية جين KDO2 في بينينسيس جيم-– الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ونتيجة لذلك، قمنا بتصميم تتالي الانزيمية ردود الفعل التي تنطوي على ديوكسيجيناسيس ووحدات تحكم المجال Dc لتحقيق توليف كحول الاليفاتيه مراوان β و γ-الأمينية من الأحماض الأمينية (الشكل 3). وكما ذكر سابقا، يدخل أكسدة ج-ح تحفزها αKAO مركز ستيريوجينيك هيدروكسي استبداله مع مجموع دياستيريوسيليكتيفيتي؛ سيتم الاحتفاظ عدم التطابق Cβ/γ في الخطوة ديكاربوكسيلاتيفي، الذي يؤثر فقط على الكربون Cα من مجموعة من الأحماض الأمينية16.
رقم 3: تحليل ريتروسينثيتيك- ريتروسينثيسيس (A) من الكحوليات الأمينية β و γ (R)-1، 5-ديامينوبينتان-2-ol (4) من (5ص)-هيدروكسي-L-يسين، وديامينوبينتان (S)-1، 5–2-الرتب الأخرى (5) و 1، 5-ديامينوبينتان-3-الرتب الأخرى (6) من L-يسين. (ب) ريتروسينثيسيس β، γ-وبيتا، δ الأمينية ديولس (2ق، 3S)-1، 5-ديامينوبينتاني-2، 3-ديول (10) و (2ص، 4S) ديامينوبينتاني-1، 5–2، 4-ديول (11) بدءاً من (5ص)- هيدروكسي-L-يسين، و (2ص، 3R) ديامينوبينتاني-1، 5–2، 3-ديول (7) بدءاً من L-يسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بدءاً من L-يسين وبه (ص5)-مشتق هيدروكسي، نحن تقرير هنا اثنين/ثلاثة الخطوة، وعاء واحد، الإجراء الانزيمية الجمع بين ديوكسيجيناسيس ووحدات تحكم المجال Dc–حزب العمال التقدمي للحصول على الهدف الكحوليات الأمينية. قبل تركيب على نطاق المختبر من الجزيئات المستهدفة، طور الأسلوب في جدول تحليلي لضبط شروط رد فعل، مثلاً، وتركيزات الإنزيم، المطلوبة للسماح للتحويل الكامل لانطلاق المواد؛ أننا نقدم هذا الإجراء أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
مراوان الكحوليات الأمينية ومشتقاتها لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، من المساعدين مراوان للتوليف العضوي للعلاج بالأدوية. التوليف متعددة الخطوات لإنتاج الكحوليات الأمينية بتوليف العضوية التقليدية عديدة، ولكن قد لا تكون دائماً فعالة بسبب الخطوات مملة الحماية/deprotection جنبا إلى جنب مع عنصر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون بيريت العين، كريستين Pellé، فيرونيك دي بيراردينيس لمناقشة مثمرة وسيرفين بيغي للدعم التقني.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
- Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
- Turner, N. J., O’Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
- Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
- Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
- Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
- Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
- McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
- Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
- Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
- Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
- Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
- Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
- Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).
- Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
- Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
- Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. Ch. 4. Polyamines. 4, 47-59 (2015).
- Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
- Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
- Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
- Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
- Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
- Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
- Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
- Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
- Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
- Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
- . Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017)
- Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
- Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
- Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
- Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
- Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).
