Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Aur&#233;lie Fossey-Jouenne; Carine Vergne-Vaxelaire; Anne Zaparucha

doi:10.3791/56926

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

Каскад ферментативных реакций синтеза аминокислот хиральных спиртов от L-лизин

Published: February 16, 2018

doi:

10.3791/56926

Aurélie Fossey-Jouenne, Carine Vergne-Vaxelaire, Anne Zaparucha

¹Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob,CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

Хиральных спиртов аминокислоты являются универсальным молекулы для использования как строительные леса в органическом синтезе. Начиная с L-лизин, мы синтезировать амино спиртов реакцией ферментативные Каскад, сочетая окисления diastereoselective C-H, катализируемые dioxygenase следуют расщепления карбоновые кислоты группу соответствующего гидроксила аминокислоты, Декарбоксилаза.

Abstract

Амино спиртов являются универсальным соединений с широким спектром применения. Например они были использованы как хиральные леса в органическом синтезе. Их синтез по органической химии, обычных часто требует утомительной многоступенчатый синтез процессов, с сложным контролем стереохимические итогового документа. Мы представляем протокол для ферментативно synthetize амино спирты, начиная от доступной L-лизин в 48 ч. Этот протокол сочетает в себе два химических реакций, которые очень трудно проводить путем обычного органического синтеза. В первый шаг, regio – и diastereoselective окисление неактивированной C-H Бонд лизина боковой цепи катализируемые dioxygenase; второй regio – и diastereoselective окисления, катализируемые regiodivergent dioxygenase может привести к формированию 1,2-диолов. На последнем шаге карбоксильные группы Альфа-аминокислоты расщепляется, пиридоксальфосфат (ПЛП) Декарбоксилаза (DC). Это decarboxylative шаг влияет только на альфа-углерода аминокислоты, сохраняя гидрокси замещенных stereogenic центр в бета/гамма-положении. Поэтому оптически обогащены результате амино спиртов. Протокол был успешно применен к синтезу semipreparative шкала четырех амино спиртов. Мониторинг реакций проводили высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) после деривации, 1-фтор-2,4-динитробензол. Простая очистка твердофазный экстракцией (SPE) предоставлена амино спиртов с отличные урожаи (93% до > 95%).

Introduction

Несмотря на преимущества, предоставляемые биокатализ интеграция биокаталитической шаги в синтетических пути или всего биокаталитической маршруты основном остается ограниченным ферментативные кинетическая резолюций. Эти маршруты были широко используется в качестве первого шага в асимметричной химио ферментативного синтеза, но биокатализ предлагает много больше возможностей в функциональной группы превращения с высоким стереоселективность¹^,²^,³. Кроме того как биокаталитической реакций проводятся в аналогичных условиях, поэтому целесообразно выполнять Каскад реакций в один горшок моды⁴^,⁵.

Хиральных спиртов аминокислоты являются универсальным молекулы как вспомогательное оборудование или подмости в органическом синтезе⁶для использования. Группу в составе аминокислот алкоголь часто встречается в вторичных метаболитов и активные фармацевтические ингредиенты (API). Первичные спирты β-аминокислоты легко доступны от соответствующего α-аминокислоты обычных химического синтеза, но доступ к хиральных спиртов γ-аминокислоты или вторичные спирты аминокислоты часто требует утомительной синтетических пути вместе с учетом контроль стереохимия⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. Из-за его высокой стереоселективность биокатализ может предоставить улучшенный синтетических маршрут к эти хиральная строительные блоки¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴.

Мы ранее сообщали синтеза из моно – и ди гидрокси L-lysines diastereoselective ферментативные гидроксилирования, катализируемые dioxygenases железа (II) / α-ketoacid зависимой циклооксигеназы семьи (αKAO) (рис. 1)¹⁵. В частности, начиная с L-лизин, KDO1 dioxygenase катализирует образование (3S) – гидроксильные производные (1), время (4R) – производное (2) образуется в результате реакции с KDO2 dioxygenase. Hydroxylations последовательных regiodivergent KDO1 и KDO2 приводят к образованию (3R, 4R) – дигидрокси – L-лизин (3) в оптически чистом виде. Однако ограниченный субстрата спектр этих ферментов препятствует их большие использования химического синтеза, особенно в гидроксилирования простой амины, как остаток карбоновые кислоты в α-положении амино-группы имеет важнейшее значение для деятельности¹⁶.

Рисунок 1: биокаталитической преобразования L-лизин. Преобразование в (3S) – гидрокси – L-лизин (1), катализируемые KDO1 dioxygenase; (4R) – гидрокси – L-лизин (2), катализируемые KDO2 dioxygenase; и (3R, 4R) – дигидрокси – L-лизин (3) Каскад реакции катализированные последовательно, KDO1 и KDO2 dioxygenases. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Декарбоксилирования является общей реакцией метаболизма¹⁷. В частности, аминокислоты DCs (EC 4.1.1) кофактор бесплатно (pyruvoyl зависимых) или ПЛП зависимых ферментов и катализировать декарбоксилирования аминокислот в соответствующий полиаминов в бактериях и высших организмов¹⁸^,¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²². моно – и дигидрокси соединений (рис. 3) 4–7, 10–11 соответствуют Гидроксилированные кадаверин, диамин, полученные декарбоксилирования L-лизин. Кадаверин ключевой строительный блок для химической промышленности, в частности это компонент из полиуретана и полиамидные полимеры. Таким образом био основе производства этого диамин из возобновляемых ресурсов привлекла внимание как альтернатива маршрут на нефтяной основе, и различные микроорганизмы были спроектированы для этой цели. В этих метаболических лизин DC (НРС) является ключевой фермент. НРС является ПЛП зависимых ферментов, принадлежащие аланина racemase (AR) структурные семьи²³. PLP-зависимых DCs (ПЛП-DCs) известны как весьма специфичные для субстрата. Однако, несколько ферментов собственные возможности небольшой распущенность, будучи активной к L-орнитин и L-лизина, аминокислоты, как например НРС от Selenomonas rumirantium (НРС_Srum), который имеет аналогичные кинетические константы для Лизин и орнитин декарбоксилирования²⁴^,-правовая²⁵. Этот расширенный субстрат специфика делает этот фермент является хорошим кандидатом для декарбоксилирования из моно – и ди гидрокси L-лизин. Кроме того чтобы найти DCs активную сторону гидроксильные производные лизина, мы изучили геномной контексте генов, кодирующих ферменты αKAO. Действительно в геномах прокариот генов, кодирующих ферменты, участвующие в же биосинтетических пути обычно совместно локализованы в кластерах гена. Джин KDO2 (от Chitinophaga pinensis) был найден совместно локализованы с геном кодирования предполагаемого ПЛП-DC (рис. 2). В отличие от этого кодировка не гена для DC была обнаружена при анализе геномной контексте KDO1 dioxygenase. Поэтому белка ПЛП-DC от C. pinensis (DC_Cpin) был выбран в качестве перспективного кандидата чтобы катализировать декарбоксилирования шаг Каскад реакции.

Рисунок 2: геномной контексте гена KDO2 в C. pinensis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Следовательно мы разработали каскад ферментативных реакций с участием dioxygenases и DCs для достижения синтеза алифатических хиральная β – и γ-аминокислоты спиртов из аминокислот (рис. 3). Как сообщалось ранее C-H окисления, катализируемые αKAO вводит гидрокси замещенных stereogenic центр с общей diastereoselectivity; Cβ/γ хиральности будут сохранены в decarboxylative шаг, который влияет только на Cα углерода аминокислотный остаток¹⁶.

Рисунок 3: анализ Retrosynthetic. (A) Retrosynthesis β – и γ-аминокислоты спиртов (R) – 1,5 – diaminopentan-2-ол (4) (5R) – гидрокси – L-лизин и (S) – 1,5 – diaminopentan-2-ол (5) и 1,5-diaminopentan-3-ол (6) с L-лизин. (B) Retrosynthesis β, γ – и β, δ-аминокислоты диолов (2S, 3S) – 1,5 – diaminopentane-2,3-диол (10) и (2R, 4S) – 1,5 – diaminopentane-2,4-диол (11) начиная с (5R)- гидрокси L-лизин и (2R, 3R) – 1,5 – diaminopentane-2,3-диол (7) начиная с L-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Начиная с L-лизин и его (5R)-гидроксильные производные, мы приводим здесь два/три шага, один горшок, ферментативные процедуры объединения dioxygenases и ПЛП-DCs для получения целевого амино спиртов. Предварительное обобщение в лабораторном масштабе молекулы-мишени, метод был разработан в аналитической масштабе для настройки условий реакции, например, концентрации фермента, требуемых для полного преобразования исходных материалов; Мы представляем эту процедуру.

Protocol

1. ферментный препарат Экспресс и очистки белков как описано26.Примечание: Рекомбинантных белков были получены следующие окончательные концентрации: αKAO из Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 мг/мл; ΑKAO от C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 мг/мл; PLP-РС от S. rumirantium, UniPr…

Representative Results

Мы ранее сообщали синтеза из моно – и ди гидрокси L-lysines diastereoselective ферментативные гидроксилирования, катализируемые dioxygenases железа (II) / αKAO семьи (рис. 1)16. Для оптимизации протокола всей каскады, представленные здесь, которые сочетают в себе о?…

Discussion

Хиральных спиртов аминокислот и производных имеют широкий спектр применения, от хиральная вспомогательное оборудование для органического синтеза фармацевтической терапии. Многоступенчатого синтеза для производства аминокислот спиртов путем обычного органического синтеза многочи…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Véronique де Berardinis для плодотворного обсуждения и Ален Perret, Кристина Pellé и Пегги Sirvain для технической поддержки.

Materials

HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L-lysine hydrochloride	Sigma Aldrich	L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine	Sigma Aldrich	GPS NONH	Out sourcing
α-ketoglutaric acid	Sigma Aldrich	75892
Sodium ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate	Acros	201370250
Pyridoxal phosphate (PLP)	Sigma Aldrich	82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)	Sigma Aldrich	D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Sigma Aldrich	D1529
Ethanol	VWR	20825.290
Sodium hydrogen carbonate	Sigma Aldrich	71631
HCl 37%	Sigma Aldrich	435570
HCl 0.1M	Fluka	35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS	VWR	83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid	VWR	153112E
Ammonia 28%	VWR	21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS	VWR	83638.32
Formic acid	Acros	270480010
Phosphoric acid 85%	Acros	201145000
Deuterium oxide	Acros	320,710,075
NaOH	Sigma Aldrich	S5881
C18 HPLC column	Phenomenex	00F-4601-Y0
Accela UHPLC System	ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector	ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF	Merck	SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip	VWR	HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh	Sigma Aldrich	217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL	Waters	186000776
Extraction manifold	Waters	WAT200609
Rotary evaporator	Büchi	531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus	Christ	L083302
Micropipette 20 µL	Eppendorf	3121000031
Micropipette 100 µL	Eppendorf	3121000074
Micropipette 500 µL	Eppendorf	3121000112
Micropipette 1000 µL	Eppendorf	3121000120
300 MHz spectrometer	Bruker
2 mL microtube	CLEARLine	CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube	Fischer Scientific	05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23	Fischer Scientific	10353331
100 mL round-bottom flask 29/32	Fischer Scientific	11786183
250 mL round-bottom flask 29/32	Fischer Scientific	11786183
250 mL erlenmeyer flask	Fischerbrand	15496143

References

Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
Turner, N. J., O’Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).
Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. Ch. 4. Polyamines. 4, 47-59 (2015).
Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017)
Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).