एल-lysine से चिराल अमीनो शराब के संश्लेषण के लिए एंजाइमी झरना प्रतिक्रियाओं
Summary
चिराल अमीनो शराब कार्बनिक संश्लेषण में पाड़ के रूप में उपयोग के लिए बहुमुखी अणु हैं । एल से शुरू-lysine, हम एक एंजाइमी झरना diastereoselective सी-एच ऑक्सीकरण catalyzed के संयोजन dioxygenase द्वारा इसी carboxylic एमिनो एसिड की moiety एसिड हाइड्रॉक्सिल के बाद एक द्वारा एमिनो शराब संश्लेषण decarboxylase ।
Abstract
अमीनो शराब अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ बहुमुखी यौगिकों हैं । उदाहरण के लिए, वे कार्बनिक संश्लेषण में चिराल पाड़ के रूप में इस्तेमाल किया गया है । पारंपरिक कार्बनिक रसायन विज्ञान द्वारा उनके संश्लेषण अक्सर stereochemical परिणाम की मुश्किल नियंत्रण के साथ, थकाऊ बहु कदम संश्लेषण प्रक्रियाओं की आवश्यकता है. हम ४८ एच में आसानी से उपलब्ध एल-lysine से शुरू synthetize अमीनो शराब enzymatically करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल पारंपरिक कार्बनिक संश्लेषण द्वारा संचालित करने के लिए बहुत मुश्किल हैं कि दो रासायनिक प्रतिक्रियाओं को जोड़ती है. पहले चरण में, lysine पक्ष-शृंखला के एक अनक्रियाशील सी-एच बांड के regio-और diastereoselective ऑक्सीकरण रोधी का catalyzed एक dioxygenase द्वारा किया जाता है; एक दूसरे regio-और एक regiodivergent dioxygenase द्वारा diastereoselective ऑक्सीकरण catalyzed 1, 2-diols के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । अंतिम चरण में, अल्फा एमिनो एसिड के carboxylic समूह एक pyridoxal-फास्फेट (PLP) decarboxylase (डीसी) से सट गया है. इस decarboxylative कदम केवल एमिनो एसिड के अल्फा कार्बन को प्रभावित करता है, hydroxy को बनाए रखने-एक बीटा में stereogenic केंद्र प्रतिस्थापित/ परिणामस्वरूप अमीनो शराब इसलिए ऑप्टिकली समृद्ध कर रहे हैं । प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक चार एमिनो अल्कोहल के semipreparative पैमाने पर संश्लेषण के लिए लागू किया गया था । 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzene द्वारा derivatization के बाद उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा प्रतिक्रियाओं की निगरानी का आयोजन किया गया । ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) द्वारा सीधी शुद्धि उत्कृष्ट पैदावार के साथ अमीनो शराब afforded (९३% करने के लिए > 95%) ।
Introduction
biocatalysis द्वारा की पेशकश की लाभ के बावजूद, सिंथेटिक रास्ते या कुल में उत्प्रेरक कदम के एकीकरण मार्गों ज्यादातर एंजाइमी काइनेटिक संकल्प तक ही सीमित रहता है । इन मार्गों व्यापक रूप से असममित chemo-एंजाइमी संश्लेषण में एक पहला कदम के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन biocatalysis उच्च stereoselectivity के साथ कार्यात्मक समूह के रूपांतरणों में कई और अधिक संभावनाएं प्रदान करता है,2,3 . इसके अलावा, के रूप में एक समान स्थितियों में, यह एक एक पॉट फैशन4,5में झरना प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए व्यवहार्य है ।
चिराल अमीनो शराब कार्बनिक संश्लेषण में सहायक या पाड़ के रूप में उपयोग के लिए बहुमुखी अणुओं रहे है6। एमिनो अल्कोहल moiety अक्सर माध्यमिक चयापचयों में और सक्रिय दवा सामग्री (एपीआई) में पाया जाता है । प्राथमिक β-एमिनो अल्कोहल पारंपरिक रासायनिक संश्लेषण द्वारा इसी α-अमीनो एसिड से आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन चिराल γ के लिए उपयोग-अमीनो शराब या माध्यमिक अमीनो शराब अक्सर संवेदनशील के साथ एक साथ थकाऊ सिंथेटिक रास्ते की आवश्यकता है stereochemistry7,8,9,10का नियंत्रण । अपने उच्च stereoselectivity के कारण, biocatalysis इन चिराल बिल्डिंग ब्लॉकों के लिए एक बेहतर सिंथेटिक मार्ग11,12,13,14प्रदान कर सकता है ।
हम पहले के संश्लेषण की रिपोर्ट मोनो-और di-hydroxy-L-lysines द्वारा diastereoselective एंजाइमी hydroxylation catalyzed द्वारा dioxygenases आयरन (II)/α-ketoacid-निर्भर oxygenase परिवार (αKAO) (चित्रा 1)15. विशेष रूप से, एल से शुरू lysine, KDO1 dioxygenase (3एस) के गठन के catalyzes-hydroxy व्युत्पंन (1), जबकि (4आर)-व्युत्पंन (2) KDO2 dioxygenase के साथ प्रतिक्रिया द्वारा बनाई गई है । ऑप्टिकली रूप से शुद्ध रूप में (3आर, 4आर)-dihydroxy-एल-lysine (3) के गठन के लिए KDO1 और KDO2 नेतृत्व द्वारा उत्तराधिकारी regiodivergent hydroxylations । हालांकि, इन एंजाइमों की सीमित सब्सट्रेट रेंज रासायनिक संश्लेषण में उनके बड़े उपयोग, विशेष रूप से सरल अमीन के hydroxylation में, एमिनो समूह की α-स्थिति में एक carboxylic एसिड moiety के रूप में बाधा उत्पन्न होती है गतिविधि के लिए आवश्यक है16.
चित्र 1: L-lysine का उत्प्रेरक रूपांतरण । (3एस) में रूपांतरण-hydroxy-L-lysine (1) catalyzed द्वारा KDO1 dioxygenase; (4R)-hydroxy-L-lysine (2) catalyzed by KDO2 dioxygenase; तथा (३आर, ४आर)-dihydroxy-एल-lysine (३) द्वारा झरना अभिक्रिया catalyzed क्रमिक द्वारा KDO1 तथा KDO2 dioxygenases. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Decarboxylation चयापचय17में एक आम प्रतिक्रिया है । विशेष रूप से, अमीनो अम्ल dc (ईसी शुू) cofactor-रहित (pyruvoyl-आश्रित) या PLP-आश्रित एंजाइम होते हैं, और उत्प्रेरित अमीनो अम्ल की decarboxylation में इसी polyamines में बैक्टीरिया और उच्चतर जीवों में18,19 , 20 , 21 , 22. मोनो और dihydroxy यौगिकों (चित्रा 3) 4–7, 10–11 hydroxylated cadaverine के अनुरूप, एल decarboxylation के lysine द्वारा प्राप्त डायमाइन. Cadaverine रासायनिक उद्योग के लिए एक महत्वपूर्ण इमारत ब्लॉक है, विशेष रूप से यह पॉलियामाइड और टुकड़े पॉलिमर का एक घटक है । इसलिए, नवीकरणीय संसाधनों से इस डायमाइन के जैव आधारित उत्पादन ने पेट्रोलियम-आधारित मार्ग के विकल्प के रूप में ध्यान आकर्षित किया है, और इस प्रयोजन के लिए विभिन्न सूक्ष्मजीवों को इंजीनियर किया गया है । इन चयापचय मार्ग में, lysine डीसी (एलडीसी) कुंजी एंजाइम है । एलडीसी एक PLP-निर्भर एंजाइम alanine racemase (एआर) संरचनात्मक परिवार23से संबंधित है । PLP-निर्भर dc (PLP-dc) अत्यधिक सब्सट्रेट-विशिष्ट होने के लिए जाने जाते हैं । तथापि, कुछ एंजाइमों मामूली संकीर्णता की क्षमता ही, दोनों एल ornithine और एल-lysine अमीनो एसिड की ओर सक्रिय किया जा रहा है, उदाहरण के लिए के रूप में Selenomonas rumirantium (एलडीसीSrum) से एलडीसी, जो समान काइनेटिक स्थिरांक के लिए है lysine व ornithine decarboxylation२४,२५. इस विस्तारित सब्सट्रेट विशिष्टता इस एंजाइम मोनो के decarboxylation के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बनाता है-और di-hydroxy-L-lysine. इसके अलावा, lysine के हाइड्रॉक्सिल डेरिवेटिव की ओर सक्रिय dc खोजने के लिए, हम αKAO एंजाइमों एंकोडिंग जीन के जीनोमिक संदर्भ की जांच की । दरअसल, prokaryotic जीनोम में जीन एक ही सिंथेटिक मार्ग में शामिल एंजाइमों कूटबंधन आम तौर पर सह जीन समूहों में स्थानीयकृत रहे हैं । KDO2 ( Chitinophaga pinensisसे) जीन एक जीन एंकोडिंग ख्यात PLP डीसी (चित्रा 2) के साथ सह-स्थानीयकृत पाया गया । इसके विपरीत, KDO1 dioxygenase के जीनोमिक प्रसंग का विश्लेषण करते समय डीसी के लिए कोई जीन एंकोडिंग नहीं मिली है । C. pinensis (dcCpin) से PLP-dc प्रोटीन इसलिए एक होनहार उंमीदवार के रूप में चुना गया था झरना प्रतिक्रिया के decarboxylation कदम उत्प्रेरित ।
चित्रा 2: सी. pinensisमें KDO2 जीन के जीनोमिक प्रसंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
नतीजतन, हम एंजाइमी झरना dioxygenases और dc को शामिल प्रतिक्रियाओं aliphatic चिराल β के संश्लेषण को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन-और γ अमीनो एसिड से एमिनो अल्कोहल (चित्रा 3) । जैसा कि पहले की रिपोर्ट, सी एच αKAO द्वारा catalyzed ऑक्सीकरण कुल diastereoselectivity के साथ hydroxy-प्रतिस्थापित stereogenic केंद्र का परिचय; Cβ/γ chirality decarboxylative चरण में संरक्षित किया जाएगा, जो केवल एमिनो एसिड Cα के moiety कार्बन को प्रभावित करता है16.
चित्र 3: Retrosynthetic विश्लेषण. (क) Retrosynthesis β-व γ-अमीनों मद्य (नि)-1, 5-diaminopentan-2-राजभाषा (4) से (5R)-hydroxy-L-Lysine, और (स)-1, 5-diaminopentan-2-राजभाषा (5) और 1, 5-diaminopentan-3-राजभाषा (6) से L-lysine. (ख) Retrosynthesis β, γ-व β, δ-अमीनो diols (2s, 3s)-1, 5-diaminopentane-2, 3-दिओल (10) और (2आर, 4एस)-1, 5-diaminopentane-2, 4-दिओल (11) से शुरू (5आर)- hydroxy-एल-lysine, और (2आर, 3आर)-1, 5-diaminopentane-2, 3-दिओल (7) से शुरू एल-lysine । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
एल से शुरू-lysine और उसके (5R)-hydroxy व्युत्पंन, हम इस के साथ साथ एक दो/तीन कदम, एक पॉट, एंजाइमी प्रक्रिया dioxygenases और PLP के संयोजन-dc लक्ष्य अमीनो शराब प्राप्त करने के लिए रिपोर्ट । लक्ष्य अणुओं की प्रयोगशाला पैमाने पर संश्लेषण से पहले, विधि विश्लेषणात्मक पैमाने पर विकसित किया गया था प्रतिक्रिया की स्थिति को समायोजित करने के लिए, उदा, एंजाइम सांद्रता, प्रारंभिक सामग्री के पूर्ण रूपांतरण की अनुमति के लिए आवश्यक; हम इस प्रक्रिया को भी प्रस्तुत करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
चिराल अमीनो शराब और डेरिवेटिव अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, चिराल सहायक से दवा चिकित्सा के लिए कार्बनिक संश्लेषण के लिए । पारंपरिक कार्बनिक संश्लेषण द्वारा अमीनो शराब के उत्पादन के लिए Multistep ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों Véronique de Berardinis के लिए उपयोगी चर्चा और Alain पेर्रेट, क्रिस्टीन Pellé, और तकनीकी सहायता के लिए पैगी Sirvain धंयवाद ।
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
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