Chiral amino alkoholer er allsidig molekyler for bruk som stillaser i Organisk syntese. Fra L-lysine, vi syntetisere amino alkoholer av en enzymatisk gjennomgripende reaksjon kombinerer diastereoselective C-H oksidasjon katalysert av dioxygenase etterfulgt av spalting av karboksylsyre moiety av tilsvarende hydroksyl aminosyren av en dekarboksylasehemmer.
Amino alkoholer er allsidig forbindelser med et bredt utvalg av programmer. For eksempel, har de vært brukt som chiral stillaser i Organisk syntese. Deres syntese av konvensjonelle organisk kjemi krever ofte kjedelig flertrinns syntese prosesser, med vanskelige kontroll over stereokjemiske utfallet. Vi presenterer en protokoll til enzymatisk synthetize amino alkoholer fra de tilgjengelige L-lysin i 48 timer. Denne protokollen kombinerer to kjemiske reaksjoner som er svært vanskelig å gjennomføre av konvensjonelle Organisk syntese. I første trinn, regio- og diastereoselective oksidasjon av en unactivated C-H bånd av lysin er side-kjeden katalysert av en dioxygenase; en andre regio- og diastereoselective oksidasjon katalysert av et regiodivergent dioxygenase kan føre til dannelse av 1,2-diols. I det siste trinnet, er karbonoxylsyre gruppen av alpha aminosyren kløyvde av en pyridoxal-fosfat (PLP) dekarboksylasehemmer (DC). Dette decarboxylative trinnet bare påvirker alpha karbon av aminosyrer, beholder den hydroxy-substituert stereogenic center i beta/gamma posisjon. De resulterende amino alkoholer er derfor optisk beriket. Protokollen ble vellykket anvendt på semipreparative skala syntesen av fire amino alkoholer. Overvåking av reaksjonene ble utført av Væskekromatografi (HPLC) etter derivatization av 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Enkel rensing av solid-fase utvinning (SPE) gis amino alkoholer med utmerket avkastning (93% > 95%).
Til tross for fordelene med biocatalysis, fortsatt integrering av biocatalytic trinnene i syntetisk veier eller totale biocatalytic ruter stort sett begrenset til enzymatisk kinetic oppløsninger. Disse rutene brukt mye som et første skritt i asymmetrisk chemo-enzymatisk syntese, men biocatalysis tilbyr mange flere muligheter i funksjonsgruppe interconversions med høy stereoselectivity1,2,3 . Videre som biocatalytic reaksjoner er gjennomført under like forhold, er det derfor mulig å utføre gjennomgripende reaksjoner i en en-potten mote4,5.
Chiral amino alkoholer er allsidig molekyler for bruk som hjelpeforetak eller stillaser i Organisk syntese6. Amino alkohol moiety er ofte funnet i sekundære metabolitter og aktive farmasøytiske råvarer (API). Primære β-amino alkoholer er lett tilgjengelig fra de tilsvarende α-aminosyrer konvensjonelle syntese, men tilgang til chiral γ-amino alkoholer eller sekundær amino alkoholer krever ofte kjedelig syntetiske veier med følsom kontroll av stereokjemi7,8,9,10. På grunn av sin høye stereoselectivity, kan biocatalysis tilby en førsteklasses syntetisk rute til disse chiral byggesteinene11,12,13,14.
Vi har tidligere rapportert syntesen av mono – og di-hydroxy-L-lysines av diastereoselective enzymatisk hydroksylering katalysert av dioxygenases av jern (II) / α-ketoacid-avhengige oxygenase familie (αKAO) (figur 1)15. Spesielt fra L-lysin, KDO1 dioxygenase gir dannelsen av (3S) – hydroxy derivat (1), mens (4R) – derivat (2) dannes ved reaksjon med KDO2 dioxygenase. Etterfølgende regiodivergent hydroxylations av KDO1 og KDO2 føre til dannelse av (3R, 4R) – dihydroxy – L-lysine (3) i optisk ren form. Imidlertid hindrer begrenset substrat rekke disse enzymene stor utnyttelse i syntese, spesielt i hydroksylering av enkel aminer, som en karboksylsyre moiety i α-posisjonen av amino-gruppen er avgjørende for aktivitet16.
Figur 1: Biocatalytic konverteringer av L-lysine. Konvertering til (3S) – hydroxy – L-lysine (1) katalysert av KDO1 dioxygenase; (4R) – hydroxy – L-lysine (2) katalysert av KDO2 dioxygenase; og (3R, 4R) – dihydroxy – L-lysine (3) av gjennomgripende reaksjon katalysert suksessivt av KDO1 og KDO2 dioxygenases. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Dekarboksylering er en vanlig reaksjon i stoffskiftet17. Spesielt aminosyre DCs (EC 4.1.1) er kofaktor-fri (pyruvoyl-avhengige) eller PLP-avhengige enzymer, og katalysere dekarboksylering av aminosyrer i de tilsvarende polyaminer bakterier og høyere organismer18,19 , 20 , 21 , 22. mono- og dihydroxy forbindelser (Figur 3) 4–7, 10–11 tilsvarer hydroxylated cadaverine, diamine ved dekarboksylering av L-lysine. Cadaverine er en viktig byggekloss for kjemisk industri, spesielt det er en del av polyamid og polyuretan polymerer. Derfor bio-basert produksjon av denne diamine fra fornybare ressurser vakte oppmerksomhet som et alternativ til oljebaserte ruten, og ulike mikroorganismer har blitt utviklet for dette formålet. I disse metabolske veier er lysin DC (LDC) nøkkel enzymet. LDC er et PLP-avhengige enzym tilhører alanin racemase (AR) strukturelle familie23. PLP-avhengige DCs (PLP-DCs) er kjent for å være svært substrat-spesifikke. Men noen enzymer eier evnen til liten promiskuitet, å være aktiv mot både L-ornithine og L-lysine aminosyrer, som for eksempel LDC fra Selenomonas rumirantium (LDCSrum), som har lignende kinetic konstanter for lysin og ornithine dekarboksylering24,25. Dette utvidet underlaget spesifisitet gjør dette enzymet en god kandidat for dekarboksylering av mono – og di-hydroxy-L-lysine. I tillegg vil finne DCs aktive mot hydroksyl derivater av lysin, undersøkte vi genomisk sammenheng med genene som koder αKAO enzymer. Faktisk i prokaryote genomer er genene koding enzymer som er involvert i samme biosyntetiske veien generelt Co lokalisert i genet klynger. KDO2 (fra Chitinophaga pinensis) genet ble funnet Co lokalisert med et gen koding antatte PLP-DC (figur 2). Derimot har ingen genet koding for DC funnet når du analyserer genomisk sammenheng med KDO1 dioxygenase. PLP-DC protein fra C. pinensis (DCCpin) ble derfor valgt som en lovende kandidat å katalysere det dekarboksylering trinnet i cascade reaksjonen.
Figur 2: Genomic sammenheng med KDO2 gene i C. pinensis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Derfor designet vi enzymatisk gjennomgripende reaksjoner involverer dioxygenases og DCs å oppnå syntesen av alifatisk chiral β – og γ-amino alkoholer fra aminosyrer (Figur 3). Som tidligere rapportert introduserer C-H oksidasjon katalysert av αKAO AHA-substituert stereogenic sentrum med totalt diastereoselectivity; Cβ/γ chiralitet beholdes i decarboxylative trinn som påvirker bare Cα karbon aminosyre moiety16.
Figur 3: Retrosynthetic analyse. (A) Retrosynthesis av β – og γ-amino alkoholer (R) – 1,5 – diaminopentan-2-ol (4) (5R) – hydroxy – L-lysin, og (S) – 1,5 – diaminopentan-2-ol (5) og 1,5-diaminopentan-3-ol (6) fra L-lysine. (B) Retrosynthesis β, γ – og β, ses-amino diols (2S, 3S) – 1,5 – diaminopentane-2,3-diol (10) og (2R, 4S) – 1,5 – diaminopentane-2,4-diol (11) starter fra (5R)- Aha-L-lysine og (2R, 3R) – 1,5 – diaminopentane-2,3-diol (7) starter fra L-lysine. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fra L-lysine og dens (5R)-hydroxy derivat, vi rapporterer her en to/tre trinn, en pott, enzymatisk prosedyren dioxygenases og PLP-DCs å få målet amino alkoholer. Før syntese på laboratoriet skalaen av målet molekyler, metoden ble utviklet i analytisk skala justere reaksjonen forhold, f.eks, enzym konsentrasjonen, må tillate full konvertering av Start; Vi presenterer denne prosedyren.
Chiral amino alkoholer og derivater har et bredt spekter av applikasjoner fra chiral hjelpestoffer til Organisk syntese til farmasøytiske terapi. Må syntese for å produsere amino alkoholer av konvensjonelle Organisk syntese er mange, men kan ikke alltid være effektive på grunn av kjedelig beskyttelse/deprotection trinn med en følsom kontroll av stereokjemi16. En biocatalytic tilnærming som dispenses med beskyttelse/deprotection trinnene og er vanligvis svært stereoselektiv representerer et…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Véronique de Berardinis til fruktbar diskusjon og Alain Perret, Christine Pellé og Peggy Sirvain for kundestøtte.
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
(5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
Ethanol | VWR | 20825.290 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
Formic acid | Acros | 270480010 | |
Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
300 MHz spectrometer | Bruker | ||
2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |