Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Aur&#233;lie Fossey-Jouenne; Carine Vergne-Vaxelaire; Anne Zaparucha

doi:10.3791/56926

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Chemistry

패-리 신에서 랄 아미노 알콜의 합성을 위한 효소 캐스케이드 반응

Published: February 16, 2018

doi:

10.3791/56926

Aurélie Fossey-Jouenne, Carine Vergne-Vaxelaire, Anne Zaparucha

¹Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob,CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

카이 랄 아미노 알콜 건설 기계 유기 합성에 사용 하기 위해 다양 한 분자입니다. 패-리 신에서 시작, 우리 diastereoselective C H 산화 촉매 dioxygenase에 의해 해당 수 아미노산의 carboxylic 산 moiety의 분열에 의해 다음에 의해 결합 하는 효소 캐스케이드 반응에 의해 아미노 알콜을 합성 한 decarboxylase입니다.

Abstract

아미노 알콜은 다양 한 응용 프로그램으로 다양 한 화합물. 예를 들어, 그들은 유기 합성에서 랄 공중 발판으로 사용 되었습니다. 기존의 유기 화학에 의해 그들의 합성은 종종 stereochemical 결과의 어려운 제어와 지루한 여러 단계의 합성 과정을 필요합니다. 선물이 효소 synthetize 아미노 알콜 48 h에 쉽게 사용할 수 있는 L 리 진에서 시작 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 매우 전통적인 유기 합성 하 여 수행 하기 어려운 두 화학 반응 결합 합니다. 신의 unactivated C H 본드의 첫 번째 단계, regio-와 diastereoselective 산화에 사이드 체인 dioxygenase;에 의해 촉매는 두 번째 regio-와 diastereoselective regiodivergent dioxygenase에 의해 촉매 산화는 1, 2-diols의 형성으로 이어질 수 있습니다. 마지막 단계에서 carboxylic 그룹의 알파 아미노산은 pyridoxal 인산 염 (PLP) decarboxylase (DC)에 의해 죽 습. 이 decarboxylative 단계 베타/감마 위치에 대체 hydroxy stereogenic 센터 유지 아미노산의 알파 탄소를만 영향을 줍니다. 결과 아미노 알콜은 광학 농축 따라서. 프로토콜의 4 개의 아미노 알콜 semipreparative 규모 합성에 성공적으로 적용 되었습니다. 반응의 모니터링 실시 했다 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 derivatization 후 1-플 루 오로-2, 4-dinitrobenzene에 의해. 고체 상 추출 (SPE)에 의해 간단 정화 받으면 우수한 수익률 아미노 알콜 (93% > 95%).

Introduction

Biocatalysis 제공 하는 혜택에도 불구 하 고 합성 경로 또는 총 biocatalytic 노선 biocatalytic 단계의 통합 주로 효소 키네틱 해상도 제한 남아 있습니다. 이러한 노선 비대칭 화학 효소 합성의 첫 번째 단계로 널리 사용 되었습니다 하지만 높은 stereoselectivity^,¹²^,^{3 기능 그룹 interconversions에 더 많은 가능성을 제공 하는 biocatalysis}. 또한, biocatalytic 반응 비슷한 조건에서 실시 하 고로 그것은 가능한 한 냄비 패션⁴^,⁵에서 캐스케이드 반응을 수행 하 따라서.

카이 랄 아미노 알콜은 보조 또는 유기 합성⁶공중 발판으로 사용 하기 위해 다양 한 분자. 아미노 알콜 moiety 이차 대사 산물 및 활성 제약 성분 (API)에 자주 발견 된다. 기본 β-아미노 알콜 랄 γ-아미노 알콜에는 기존의 화학 합성, 하지만 액세스 하 여 해당 α 아미노 산에서 쉽게 사용할 수 또는 보조 아미노 알콜은 종종 민감한 함께 지루한 합성 경로 필요 입체 화학⁷^,⁸^,^,⁹¹⁰의 제어 합니다. 그것의 높은 stereoselectivity 때문에 biocatalysis이 카이 랄 빌딩 블록¹¹^,¹²^,^,¹³¹⁴우수한 합성 경로 제공할 수 있습니다.

우리는 이전 diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines를 보고 / α-ketoacid-종속 oxygenase 가족 (αKAO) (그림 1)¹⁵. 특히, KDO1 dioxygenase-hydroxy 파생 (4R) 하면서 (1)-(3S)의 형성을 catalyzes L-리 신에서 시작, 파생 (2) KDO2 dioxygenase 가진 반응에 의해 형성 된다. KDO1와 KDO2에 의해 연속 regiodivergent hydroxylations-dihydroxy-L (3R, 4R)의 형성으로 이어질-광학적으로 순수한 형태로 lysine (3). 그러나,이 효소의 제한 된 기판 범위 α-아미노 그룹의 위치에 carboxylic 산 moiety 활동¹⁶를 위해 근본적으로 간단한 아민의 hydroxylation에 특히 화학 합성에 큰 사용률을 방해 한다.

그림 1: L-리 신 Biocatalytic 변환. (3S)으로 변환-hydroxy-L-리 신 (1) KDO1 dioxygenase;에 의해 촉매 (4R)-hydroxy-L-리 신 (2) KDO2 dioxygenase;에 의해 촉매 그리고 (3R, 4R)-dihydroxy-L-리 신 (3) 캐스케이드 반응 KDO1 및 KDO2 dioxygenases에 의해 연속적으로 촉매에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Decarboxylation 신진 대사¹⁷에 일반적인 반응입니다. 특히, 아미노산 Dc (EC 4.1.1) 공동 인자 없는 (pyruvoyl) 또는 PLP 의존 효소 이며 박테리아와 더 높은 유기 체¹⁸^,¹⁹ 에 해당 polyamines로 아미노산의 decarboxylation 촉매 ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²². hydroxylated cadaverine, L-리 신의 decarboxylation에 의해 얻은 diamine에 해당 하는 모노-및 dihydroxy 화합물 (그림 3) 4–7, 10,–11 . Cadaverine 화학 산업에 대 한 주요 빌딩 블록, 특히 폴 리아 미드와 폴리우레탄 중합체의 구성 요소입니다. 따라서,이 diamine 재생 가능 자원에서의 바이오 기반 생산 석유 기반 경로 대신 관심을 모으고 있다 그리고 다양 한 미생물이이 목적을 위해 설계 되어 있다. 이러한 대사 경로에서 lysine DC (LDC) 주요 효소 이다. LDC는 알라닌 racemase (AR) 구조 가족²³에 속하는 PLP 의존 효소 이다. PLP 의존 Dc (PLP-DCs) 높은 기판 특정 알려져 있습니다. 그러나 몇 가지 효소 예를 들면 Selenomonas rumirantium (LDC_Srum)에서 LDC로 L ornithine 및 L-리 신 아미노산으로 활성화 되 고 약간의 성행위의 기능을 소유 하는, 유사한 운동 상수에 대 한가 lysine과 ornithine decarboxylation²⁴^,²⁵. 이 확장된 기질 특이성은이 효소 decarboxylation의 모노-및 디-hydroxy-L-리 신에 대 한 좋은 후보. 또한, Dc 찾을 신의 수 파생 상품으로 활성, 우리 인코딩 αKAO 효소 유전자의 genomic 컨텍스트를 검사 합니다. 실제로, prokaryotic 유전자에서 인코딩 효소 같은 생 합성 경로에 관여 하는 유전자는 일반적으로 공동 지역화 유전자 클러스터에. 공동 유전자 인코딩 putative PLP-DC (그림 2)와 지역화 ( Chitinophaga pinensis)에서 KDO2 유전자 발견. 반면, DC에 대 한 인코딩 없이 유전자 발견 되었습니다 KDO1 dioxygenase의 게놈 컨텍스트를 분석할 때. C. pinensis (DC_Cpin)에서 PLP DC 단백질 따라서 캐스케이드 반응의 decarboxylation 단계를 촉매를 유망한 후보자로 선정 되었다.

그림 2: C. pinensis에 KDO2 유전자의 Genomic 맥락. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

따라서, 우리는 dioxygenases 및 아미노산 (그림 3)에서 지방 족 랄 β-및 γ-아미노 알콜의 합성을 달성 하기 위해 Dc 효소 캐스케이드 반응 설계. 이전 보고는 αKAO에 의해 촉매 C H 산화 총 diastereoselectivity;와 hydroxy 대체 stereogenic 센터 소개 Cβ/γ 카이랄성 아미노산 moiety¹⁶의 Cα 탄소에만 영향을 줍니다 decarboxylative 단계에서 유지 됩니다.

그림 3: Retrosynthetic 분석. (R5) (4) β-및 γ-아미노 알콜 (R)-1, 5-diaminopentan-2-ol의 (A) Retrosynthesis-hydroxy-L-라이 신, 그리고 (S)-1, 5-diaminopentan-2-ol (5) 및 1, 5-diaminopentan-3-ol (6)에서 패-리 신입니다. (B) Retrosynthesis의 β, γ-β, δ-아미노 diols (2S, 3S)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (10) 및 (R,S4 2)-1, 5-diaminopentane-2, 4-diol (11) 5 (R)에서 시작- hydroxy-L-라이 신, 및 (R,R3 2)-1, 5-diaminopentane-2, 3-diol (7) L-리 신에서 시작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

패-리 신 (5R)에서 시작-hydroxy 파생, 우리 여기는 2/3 단계, 한 냄비, dioxygenases와 PLP-Dc를 대상 아미노 알콜 효소 절차 보고. 사전 종합 대상 분자의 실험실 규모에서 메서드는 반응 조건, 예를 들면, 원자재;의 전체 변환 수 있도록 하는 데 필요한 효소 농도 조정 분석 규모에서 개발 되었다 우리는 또한이 절차를 제시.

Protocol

1. 효소 준비 표현 하 고 앞에서 설명한26으로 단백질 정화.참고: 재조합 단백질 다음 최종 농도와 가져온: αKAO에서 Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1.35 mg/mL; C. pinensis, UniProtKB ID에서에서 αKAO: C7PLM6 (KDO2), 2.29 mg/mL; PLP-Dc에서 S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), 셀 무료 12.44 mg/mL;에서 총 효소 추출 PLP-DC에서 C. pinensis, UniProtKB ID: C…

Representative Results

우리가 이전에 보고 된 합성의 모노-및 디-hydroxy-L-lysines diastereoselective 효소 hydroxylation 철 (II)의 dioxygenases에 의해 촉매에 의해 / αKAO 가족 (그림 1)16. PLP DC에 의해 촉매 decarboxylation 단계 뒤는 αKAO에 의해 촉매는 하나 또는 두 개의 hydroxylation 단계를 결합 하는 여기, 전체 폭포의 프로토콜 최적화 반응 조건 모두의 요구 사항을 충족 조?…

Discussion

카이 랄 아미노 알콜 및 파생 상품 유기 합성 제약 치료에 대 한 카이 랄 조력자에서 응용 프로그램의 넓은 범위가 있다. 아미노 알콜 기존의 유기 합성에 의해 생산을 위한 다단계 합성 수많은, 하지만 않을 수 있습니다 항상 효율적인 입체 화학¹⁶의 민감한 컨트롤과 함께 지루한 보호/deprotection 단계. Biocatalytic 접근 보호/deprotection 단계 dispenses 이며 일반적으로 매우 stereoselective ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 유익한 토론에 대 한 베로 니 크 드 Berardinis와 알랭 Perret, 크리스틴 Pellé, 및 기술 지원에 대 한 페 기 Sirvain 감사합니다.

Materials

HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L-lysine hydrochloride	Sigma Aldrich	L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine	Sigma Aldrich	GPS NONH	Out sourcing
α-ketoglutaric acid	Sigma Aldrich	75892
Sodium ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate	Acros	201370250
Pyridoxal phosphate (PLP)	Sigma Aldrich	82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)	Sigma Aldrich	D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)	Sigma Aldrich	D1529
Ethanol	VWR	20825.290
Sodium hydrogen carbonate	Sigma Aldrich	71631
HCl 37%	Sigma Aldrich	435570
HCl 0.1M	Fluka	35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS	VWR	83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid	VWR	153112E
Ammonia 28%	VWR	21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS	VWR	83638.32
Formic acid	Acros	270480010
Phosphoric acid 85%	Acros	201145000
Deuterium oxide	Acros	320,710,075
NaOH	Sigma Aldrich	S5881
C18 HPLC column	Phenomenex	00F-4601-Y0
Accela UHPLC System	ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector	ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF	Merck	SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip	VWR	HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh	Sigma Aldrich	217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL	Waters	186000776
Extraction manifold	Waters	WAT200609
Rotary evaporator	Büchi	531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus	Christ	L083302
Micropipette 20 µL	Eppendorf	3121000031
Micropipette 100 µL	Eppendorf	3121000074
Micropipette 500 µL	Eppendorf	3121000112
Micropipette 1000 µL	Eppendorf	3121000120
300 MHz spectrometer	Bruker
2 mL microtube	CLEARLine	CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube	Fischer Scientific	05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23	Fischer Scientific	10353331
100 mL round-bottom flask 29/32	Fischer Scientific	11786183
250 mL round-bottom flask 29/32	Fischer Scientific	11786183
250 mL erlenmeyer flask	Fischerbrand	15496143

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Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).