Summary
Direkte injeksjon av kreft-avledet ekstracellulære blemmer (EVs) fører til omprogrammering av benmarg støtte svulst progresjon; men er hvilke celler som megle denne effekten uklart. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for å undersøke EV-mediert svulst-mesenchymal stamceller (MSC) interaksjoner i vivo, avslører en avgjørende rolle for EV-utdannede MSCs i metastasering.
Abstract
I svulst microenvironment bidra bosatt eller rekruttert stamceller (MSCs) til ondartede progresjon i flere typer kreft. Under påvirkning av bestemte Miljøsignaler, kan disse voksen stamceller frigi paracrine meglere fører til akselerert tumor vekst og metastasering. Definere crosstalk mellom svulst og MSCs er av primær betydning å forstå mekanismene bak kreft progresjon og identifisere romanen mål for terapeutisk intervensjon.
Kreftceller produserer store mengder ekstracellulære blemmer (EVs), som kan dypt påvirke atferden til målcellene i svulst microenvironment eller i fjerntliggende områder. Svulst EVs setter funksjonelle biomolecules, inkludert inflammatorisk RNAs og (onco) proteiner, som kan utdanne stromal celler å forbedre metastatisk virkemåten av kreftceller eller delta i pre metastatisk nisje-formasjonen. I denne artikkelen beskrive vi utviklingen av en prekliniske kreft musemodell som aktiverer bestemte evaluering av EV-mediert crosstalk mellom svulst og mesenchymal stamceller. Først beskriver vi rensing og karakterisering av svulst-utskilles EVs og vurdering av EV internalisering av MSCs. Vi da gjøre bruk av en multiplex perle-baserte immunanalyse å vurdere endring av MSC cytokin uttrykk profilen indusert av kreft EVs. Til slutt, vi illustrere generering av en bioluminescent orthotopic xenograft musemodell av osteosarcoma som viser svulst-MSC samspillet og Vis bidrag av EV-utdannede MSCs tumor vekst og metastasering formasjonen.
Vår modell gir mulighet til å definere hvordan kreft EVs forme en svulst-støtte miljø, og vurdere om blokaden av EV-mediert kommunikasjon mellom svulst og MSCs hindrer kreft progresjon.
Introduction
Svulst microenvironment deltar aktivt i de fleste, om ikke alle aspekter av tumorigenesis og kreft progresjon, inkludert metastasering formasjon og utvikling av resistens mot therapeutics1. Dette understreker behovet for prekliniske orthotopic kreft musen modeller at Disseksjon av komplekse svulst-stroma samhandlinger som oppstår i svulst nisje.
I mange mobilnettet komponentene i svulst microenvironment bidra stamceller (MSCs) sterkt til kreft progresjon i flere typer kreft som brystkreft, prostatakreft, hjernesvulster, myelom og osteosarcoma2 ,,3,,4,,5,,6,,7. MSCs er multipotent stamceller som finnes i ulike voksne og fosterets vev, inkludert beinmargen, fettvev, morkaken, navlestrengsblod og andre8,9. Svar på kreft-generert inflammatorisk signaler, MSCs migrere mot svulst nettsteder, innlemme i svulst microenvironment og til slutt skille ut støtte for kreft celler10. Disse kreft-assosiert MSCs gir viktige faktorer (dvs. vekstfaktorer, chemokines, cytokiner og suppressive meglere) for svulst progresjon opptrer både kreftceller og de omkringliggende stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. mens svulst-fremme effekter av kreft-assosiert MSCs har vært undersøkt i mange kreft modeller, mekanismer som kreftceller omprogrammere MSCs å forme en kreft-fremme nisje er dårlig forstått. Her beskriver vi generering av en orthotopic xenograft modell som tillater studiet av pro-tumorigenic samspillet mellom bein kreftceller og MSCs via ekstracellulære blemmer (EVs).
EVs er avgjørende meglere intercellulære kommunikasjon mellom svulst og stromal celler14. EVs bære funksjonelle biomolecules av cellen for opprinnelse, inkludert proteiner og lipider forskrifter RNAs. Når utgitt i ekstracellulære plass, disse vesikler kan tas av omkringliggende celler eller gjennomført til fjerntliggende områder via blodet eller lymfesystemet sirkulasjon, og kan dypt påvirker målet cellen atferd. 15 , 16 , 17 For eksempel opptak av kreft EVs av stromal fibroblaster kan resultere i myofibroblast differensiering støtte angiogenese og akselererende tumor vekst i vivo18,19, internalisering av endothelial cellene kan stimulere svulst angiogenese og øke vaskulær permeabilitet16,20, og interaksjon med immunceller kan føre til undertrykkelse av antitumor immunrespons21.
Vi sist viste, med en bioluminescent orthotopic xenograft musemodell av osteosarcoma, at kreftceller løslate store mengder EVs som ber MSCs til å erverve en pro-tumorigenic og pro-metastatisk fenotypen. Denne effekten av en dramatisk endring i MSC cytokin profilen for expression (referert til som "MSC utdanning"), og kan forebygges ved administrasjonen av en terapeutisk interleukin-6 reseptor (IL-6R) antistoff7. Vårt arbeid har vist at kreft EVs er avgjørende modulatorer MSC atferd, gir en begrunnelse for microenvironment målrettede tilnærminger til stoppe osteosarcoma progresjon. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for å undersøke den EV-mediert svulst-MSC samhandling i vivo. Denne modellen er beregnet til: 1) spesielt definere kreft EV-induserte endringer av MSC i svulst microenvironment, 2) vurdere hvordan denne samhandlingen bidrar til bone tumor vekst og metastasering dannelse, og 3) studie om forstyrrer EV-mediert crosstalk i vivo hindrer kreft progresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelig liggende under adipose vev mesenchymal stamceller isolering var Hentet fra department of Plastisk kirurgi i Tergooi sykehus (Hilversum, Nederland) etter godkjenning av institusjonelle etiske komiteen og skriftlig samtykke. GFP-positive adipose MSCs ble innhentet fra Institutt for medisinsk og kirurgisk Sciences for barn og voksne (Universitetet i Modena og Reggio Emilia).
Dyreforsøk ble utført i henhold til nederlandsk dyr eksperimentering, og protokollen ble godkjent av komiteen på dyr eksperimentering i VU University medical center, Amsterdam, Nederland.
1. isolering av svulst-utskilles ekstracellulære blemmer.
- Klargjør EV-utarmet fosterets Bovine Serum (FBS) ved sentrifugering FBS 70.000 x g natten (16 timer), ingen brems, på 4 ° C med en ultra svingende bøtte rotoren (forventer 1 h for deselerasjon). Nøye samle nedbryting (EV-utarmet FBS) uten å forstyrre pellet. Filtrere EV-utarmet FBS med filtere 0.22 µm.
- Klargjør EV-utarmet kultur medium ved supplere Iscoves endret Dulbecco Medium (IMDM) med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM glutamin (1 x P/S/G) og 5% EV-utarmet FBS.
- Frø 3 x 106 143B celler i 175 cm2 flasker og kultur dem i EV-utarmet kultur medium i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Når cellene er 80-90% confluent (vanligvis etter 36 h til 48 h), samle nedbryting fra 8 x 175 cm2 flasker (28 mL/kolbe) for EV-isolasjon.
- Pre tømme cellen nedbryting for å fjerne celler og celle rusk av differensial sentrifugering (sentrifugering nedbryting av tidligere spinn hver gang) i henhold til følgende protokollen:
- Sentrifuge nedbryting to ganger på 500 x g i 10 min.
- Sentrifuge nedbryting to ganger på 2000 x g i 15 min.
- Sentrifuge nedbryting to ganger på 10 000 x g i 30 min.
- Utføre alle centrifugations på 4 ° C med maksimal akselerasjon og deselerasjon hastighetsinnstillinger. Etter hver trinn nøye samle EV inneholder nedbryting, etterlot ca 1 mL. Fortsette umiddelbart for å gå 1.5 eller lagre den pre-ryddet betinget medium ved-80 ° C til EV isolasjon.
- Isolere EVs ved sentrifugering pre-ryddet betinget mediet når 70.000 x g 1t, langsom brems, på 4 ° C i ultra-sentrifuge rør (siste bindet 38,5 mL/tube) med et ultra svingende bøtte rotoren.
- Nøye fjerne nedbryting, forlater ca 1 mL bak, resuspend EV inneholder pellets i gjenværende volumet, samle dem alle i en ultracentrifuge tube og legge fosfat-bufret saltvann (PBS) til fullstendig tube fylling (siste bindet 38,5 mL).
- Sentrifuger igjen på 70.000 x g 1t ved 4 ° C, uten brems (forventer 1 h for deselerasjon). Nøye fjerne nedbryting uten å forstyrre pellet og etterlate 100-200 µL.
- Resuspend EV-pellets og Juster det endelige volumet til 200 µL med PBS (standardisert for alle EV-isolasjoner). Bruke EV forberedelse umiddelbart eller lagrer ved-80 ° C før bruk22.
Merk: EVs kan lagres til 6 måneder på-80 ° C.
2. EV karakterisering.
Renset EVs kan visualiseres overføring elektronmikroskop (TEM)23.
- Mix EV forutbetalt med en lik mengde 4% paraformaldehyde i fosfatbuffer.
- Lag 200 maske Formvar-karbon-belagt nikkel TEM rutenett med 5 µL av EV suspensjon for 20 min ved romtemperatur.
- Fixate EV prøvene på TEM rutenett med 1% glutaraldehyde inne 0.1 M fosfatbuffer (pH 7.0), kontrast med uranyl oksalat (pH 7.0), og bygge inn i en blanding av 4% uranyl acetate og 2% metyl cellulose i en 1:9-forholdet på is.
- Fjern rutenett med rustfritt stål looper og blot overskytende væske med filter papir å sikre en passende tykkelse av methyl cellulose filmen.
- Etter tørking, undersøke rutenett med transmission elektron mikroskop og ta bilder med et digitalt kamera koblet til den tilsvarende programvaren.
3. opplæring av MSCs av svulst-avledet EVs.
- Klargjør MSC kultur medium ved supplere alpha-minimum viktig medium (alpha-MEM) med 4% EV-utarmet menneskelige Lysate blodplater (hPL)24, heparin (10 U/mL) og 1 x P/S/G.
Merk: EV-utarmet hPL oppnås fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 1.1. - Frø 1.4 x 106 liggende under adipose-avledet MSCs per 75 cm2 kolbe og kultur dem i EV-utarmet MSC-kultur medium i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
- Når celler nå 70% samløpet, legge 143B osteosarcoma - eller kontrollere menneskelig fibroblaster (hf)-EVs, 10 µL EV forberedelse/cm2 av kultur kolbe. Inkuber i 24 timer og legge samme mengde EVs for flere timer. Merk: Menneskelig fibroblaster er kultivert i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) 10% FBS og EVs er isolert som beskrevet i del 1.
- Samle MSC nedbryting, sentrifuge 1 x 500 x g i 5 min på 4 ° C (med maksimal akselerasjon og deselerasjon hastighetsinnstillinger), overføre til en ny tube og lagre ryddet nedbryting ved-80 ° C å aktivere fremtidige cytokin analyse (del 5).
- In vivo eksperimenter (inndelingen 6), utdanne GFP-positive MSCs25 som beskrevet i avsnittene 3.1 til 3.3, samle cellene og resuspend dem i PBS på en siste konsentrasjon av 106 celler per 100 µL. holde celler på is til injeksjon.
4. EV internalisering analysen.
For å visualisere EV opptak av MSCs, etiketten EVs med en grønn-fluorescerende koblingsfunksjonalitet fargestoff (GFLD) (kommersielt tilgjengelig) etter produsentens protokoll:
- Kort, legge til 180 µL av fortynner 200 µL EV prep. Fortynne 1 µL GFLD fargestoff i 50 µL av fortynningsmiddel, og Legg til 20 µL utvannet fargestoff utvannet EV prep.
- Forsiktig blanding av pipettering og ruge for 3 min i romtemperatur i mørket.
- Legge til 5 mL 0,1% BSA i PBS, overføre til ultra-sentrifuge rør og fylle røret med PBS (siste bindet 38,5 mL/rør).
- Sentrifuge 1 x 70 000 x g 1t ved 4 ° C, uten brems (forventer 1 h for deselerasjon). Nøye fjerne nedbryting og resuspend merket EV-pellets i et siste volum på 200 µL (Juster volumet med PBS).
- Legger til merket EVs til MSC kultur eller lagre dem på-80 ° C. Etter natten inkubasjon vurdere vesicle internalisering av fluorescens mikroskopi og flow cytometri7.
5. vurdering av MSC cytokin uttrykk profil.
- For multiplex kvantifiseringen interleukin-8 (IL-8), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumor nekrose faktor (TNF) og interleukin - 12p 70 (IL - 12p 70) protein nivå i MSC betinget medium (se trinn 3.4), bruk en tilsvarede cytometric perle matrise (CBA) for menneskelig inflammatoriske cytokiner følge instruksjonene fra produsenten.
- Kort, bland antistoff-konjugerte fange perler og legge dem til alle analysen rør. Legg cytokin standard fortynninger eller betinget middels prøvene til rør.
- Legge til gjenkjenning reagensen og ruge 3 timer på RT.
- Vask perler med den medfølgende vask løsningen. Mål prøver ved å bruke en flow cytometer og analysere dataene i henhold til produsentens instruksjoner.
6. generasjon av en Orthotopic Xenograft musemodell Osteosarcoma.
- At seks-uke-gamle, kvinnelig, Athymic naken-Foxn1nu mus til akklimatisere seg i minst en uke før de eksperimentelle prosedyrene.
- En dag før den kirurgiske prosedyren og peri-operative analgesi legge paracetamol i drikkevannet. Fortynne "paracetamol løsning for barn" (se Tabell for materiale) med vann for å få en endelig konsentrasjon av 2 mg/mL. Basert på en gjennomsnittlig vanninntak av 150 mL/kg/dag, og en gjennomsnittlig kroppsvekt 20 g, denne dose er tilstrekkelig til å nå en dose på 6 mg/mus/dag (300 mg/kg/dag).
- Fortsett smertestillende behandling til 24 timer etter operasjonen, eller lenger hvis dyrene vise tegn på smerte.
- Ved den kirurgiske prosedyren, samle helstøpt luciferase-positive (Fluc) 143B celler (tidligere generert av lentiviral signaltransduksjon) ved sentrifugering 300 x g i 10 min og resuspend cellene i en konsentrasjon av 2 x 105 celler/µL i PBS. Hold celle suspensjon på is opp til 6 timer.
- Autoclave kirurgisk utstyr. Forberede og rengjør arbeidsområdet og plassere sterilisert saks og pinsett i sterilt ark. Tjue minutter før den kirurgiske prosedyren (trinn 6.8), injisere dyrene subcutaneously med buprenorfin (0,05 mg/kg, fortynnet i 0,9% saltløsning) som smertestillende med 0,5 mL insulin sprøyter (29-gauge p).
- Like før anesthetizing hvert dyr, fylle 10 µL sprøyte med minst 1 µL av konsentrert (Fluc) 143B celle suspensjon (se trinn 6,4).
- Bedøve dyret med isoflurane innånding anestesi (2-3% i oksygen). Kontroller nivået av anestesi ved toe-knipe dyret. Når Dyret ikke reagerer på knipe, dvs. det er dypt anesthetized, gjelde salve på øynene å hindre tørrhet under anestesi.
- Plasser dyret på ryggen med hodet i en bedøvelse maske og bena mot operatør. Flex venstre kneet. Tørke huden med 70% etanol og bruke lidocaine (2%) med en bomull Tips 3 ganger som lokale smertestillende.
- Bruk en steril kirurgisk kniv for å lag et lite innsnitt (ca. 5 mm) på huden like under kneet å avsløre tibia. Bore et pinhole i tibia, omlag 2 mm under kneet med en 0,8 mm mikro vri drill. Vær forsiktig med å bore gjennom begge tibia halvdelene.
- Injisere 1 µL celle suspensjon (ca 2 x 105 celler) sakte (i ca 5 sekunder) i hullet med en 26-gauge nål. Lukke hullet med et slippverktøy vev lim å hindre tilbakestrømning av suspensjon.
- Lukk huden med monofilament suturer og en dråpe vev limet. La dyr gjenopprette i et godt oppvarmet miljø (bruk en varmelampe). Ikke la dyr uovervåket før de har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Etter at dyrene er helt tilbake fra anestesi, returnere dem til sine egne burene.
- To dager etter svulst inoculation, injisere EV utdannet eller naive GFP-positive MSCs (106 celler i 100 µL PBS, se trinn 3,5) intravenøst med en 0,5 mL insulinsprøyte i halen stemning av mus.
- Følg tumor vekst av bioluminescens imaging26 to ganger i uken. Dette injiserer mus-IP med 150 µL D-luciferin (30 mg/mL) med en insulinsprøyte. Ti min etter injeksjon, plasserer dyrene i bioluminesens tenkelig system og måle Foton-fluks generert av kreftceller.
- Dessuten, måle diameteren på den primære Ben-svulsten med en tykkelse. Svulst volumet (i mm3) anslås bredde x lengde2 x 0,5.
- Merk: Human endepunkter er definert som tumor diameter > 15 mm eller vekt tap > 15%.
7. vurdering av lunge Nodule nummer
- Når en av dyrene når Human sluttpunktet definert i trinn 6.14 (i ca 3-4 uker), avslutte eksperimentet og samle og analysere alle relevante vev.
- Ti minutter før euthanization, injisere 150 µL D-luciferin (30 mg/mL) med en 0,5 mL insulinsprøyte.
- Bedøve dyrene med isoflurane innånding anestesi (se trinn 6,7). Bekreft dybden av anestesi ved fravær av reaksjoner på musen på tå-knipe. Euthanize musene av cervical forvridning27.
- Samle lungene, lever, milt og nyrer bruke steriliserte saks og pinsett. Vask organer i PBS å fjerne blod spor og sette dem på en Petriskål.
- Plass Petriskål med organer i bioluminesens tenkelig system. Måle bioluminescens signalet på begge sider av organer. Umiddelbart etter måling, stupe organene i 4% formalin til fixate dem (24-72 timer, på RT) for fremtidige histologiske analyse.
- Behandle innhentet bilder med passende programvare ved manuell terskelverdi. Telle antall lung knuter på hvert bilde. Telle antall lung knuter på begge sider av lungene.
8. histologiske analyse
- For histologiske analyse av lunge vev:
- Bygge formalin-fast organer i parafin og forberede 6 µm vev lysbilder.
- Deparaffinate lungevev lysbilder og utføre antigen henting ved å koke dem i 15 min 0,01 M citrate buffer (pH 6).
- Inkuber lysbildene horisontalt ved romtemperatur med anti-menneskelige vimentin antistoff (200 µg/mL) fortynnet 1:150 i antistoff-fortynner (kommersielt tilgjengelig) og deretter sekundært, HRP-merket antistoffer (0,5 mg/mL, fortynning 1:500). Stain vev med 3-diaminobenzidine (DAB) og hematoxylin counter flekker.
- Observere farget vev lysbildene bruker en optisk mikroskop koblet til tilsvarende kamera og programvare.
- Å vurdere tilstedeværelsen av GFP-positive MSCs i musen tibias:
- Avkalke tibias i ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) 0,24 M, pH 7.2-7.4. Oppdater EDTA buffer annenhver dag til Ben bli fleksible (ca 1 uke).
- Tørke tibias og infiltrere dem med parafin. Bygge inn tibias (inkludert osteosarcoma vev) i parafinblokkene.
- Bruk en mikrotom for å forberede 6 µm parafinsnitt. Plass parafinsnitt på glass lysbilder. Etter tørking, lagrer du lysbildene over natten i romtemperatur.
- Utføre varme-mediert antigen henting med citrate buffer (se 8.1.2) og flekken vev med anti-GFP antistoff (hele antiserum) i en 1:900 fortynning i antistoff-fortynner. Counterstain vev med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observere vev lysbildene med fluorescens mikroskop koblet til den tilsvarende tenkelig programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien utforsket vi evne til osteosarcoma-utskilles EVs å utdanne MSCs til et pro-tumorigenic og pro-metastatisk fenotypen. Vi viser at osteosarcoma celler slipper exosome-lignende EVs som er internalisert MSCs. Vi målt endring av MSC cytokin profilen for expression av kreft EVs og vurdert effekten av EV-utdannede MSCs på tumor vekst og metastasering formasjonen. Den generelle representasjonen av studien design er illustrert i figur 1.
EVs utgitt av 143B osteosarcoma celler eller kontroll menneskelig fibroblaster var renset ved differensial sentrifugering. EV renhet ble bekreftet av elektronmikroskop, som viste at forberedelsene hovedsakelig inneholdt blemmer med diameter varierer mellom 40-100 nm (figur 2A). For å vurdere om kreft EVs samhandle med MSCs, vi merket blemmer med en grønn-fluorescerende lipofile koblingsfunksjonalitet fargestoff (GFLD) og inkubert dem over natten med målcellene. Av fluorescens mikroskopi observerte vi effektiv EV opptak av MSCs (figur 2B). Videre viste flyt cytometri analyse at osteosarcoma og kontroll EVs er internalisert sammenlignbare effektivitet (figur 2C). For å undersøke om osteosarcoma EVs endre egenskapene immunmodulerende MSCs, brukte vi en multiplex perle-baserte cytokin immunanalyse, som viste at svulsten EVs bestemmer en 2-fold økning i IL-8 og IL-6 sammenlignet med menneskelige fibroblast kontrollere EVs (figur 2D, E).
For å undersøke om osteosarcoma EVs utdanne MSCs til å vedta en pro-tumorigenic og pro-metastatisk fenotype, ansatt vi en bioluminescent, orthotopic xenograft musemodell av osteosarcoma. Alle dyreforsøk ble utført av en operatør. Metastatisk 143B-Fluc celler ble transplantert inn i tibia athymic naken mus, og, etter to dager, osteosarcoma-xenografted mus ble utsatt for en enkelt administrasjon av GFP-positive EV-utdannede MSCs. mus naiv (ikke-utdannet) MSCs eller ingen MSCs ble brukt som kontroll grupper. Ingen dyr døde før beskrevet endepunktene. Vi viste ved caliper måling og bioluminesens imaging (BLI) som mus behandlet med EV-utdannede MSCs hadde akselerert tumorveksten sammenlignet med kontroll grupper (Figur 3A). Representant bilder av tumor størrelse av hver behandling arm er vist i Figur 3C. Våre data indikerer at en enkelt IV administrasjon av utdannet MSCs påvirker svulst progresjon så tidlig som i dag 10 etter vaksinering (Figur 3B). Dessuten, kan fire dager etter systemisk injeksjon av utdannet/naive GFP-uttrykke MSCs (Figur 4A), vi visualisere GFP-uttrykke cellene i benmargen (Figur 4B) og i tumor vev (Figur 4 C), demonstrere MSC homing til svulst området.
Ex vivo BLI analyse av lunger, lever, nyre og milt (data ikke vist) viste lunge nodule formasjon i lungene i mus alle behandling armene (Figur 4D-F). Påfallende, utdannet mus mottar EV-utdannede MSCs ikke hadde høyere antall lunge metastaser sammenlignet med mus mottar-utdannede MSCs eller ingen MSCs (Figur 4G), tyder på at i svulst microenvironment MSCs økning i metastatisk potensialet i osteosarcoma celler i vivo7.
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av studien design. Menneskets primære MSCs er utdannet med EVs isolert fra kulturperler metastatisk osteosarcoma (143B) celler. Kreft EV renhet vurderes av elektronmikroskop og internalisering av MSCs er visualisert ved fluorescens mikroskopi og analysert av flowcytometri. Endringer i profilen for MSC cytokin expression evalueres etter cytometric bead array (CBA). Definere rollen EV utdannet MSC på tumor vekst og metastasering formasjon, osteosarcoma rentebærende mus er injisert med EV-utdannede (eller naiv) MSC. Tumorveksten etterfølges av bioluminescens bildebehandling (BLI) og caliper måling, mens metastasering formasjon evalueres eksperimentelle end-point av ex vivo BLI og histologiske analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Rensing av EVs og deres samspill med MSCs. (A) overføring elektronmikroskop mikroskop-bilde av EVs isolert fra 143B celler (skala bar: 100 nm). (B) opptak av GFLD-merket 143B EVs av MSCs vurdert av fluorescens mikroskopi (skala bar: 10 µm). (C) internalisering av GFLD-merket 143B EVs (oransje) eller kontroll (menneskelige fibroblast, hf) EVs (grønn) av MSCs som analyseres av flowcytometri. (D) Multiplex påvisning av inflammatoriske cytokiner i supernatants av MSCs utsatt for 143B (143B EV-MSC) eller hf-EVs (hf EV-MSC) av cytometric bead array. 143B-MSC express høyere nivåer av IL-6 og IL-8 sammenlignet kontroll (ubehandlet og hF EV-behandlet) MSCs. De purpurprikkete linjene angir skifte i cytokiner produksjonen. (E) IL-8 og IL-6 protein konsentrasjon i betinget media av EV-behandlet MSCs som analysert av cytometric bead array, uttrykt som brett induksjon i forhold til kontrollen ubehandlet. Dataene er uttrykt som betyr ± SD, n = 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Bioluminescent, orthotopic xenograft musemodell av osteosarcoma. (A) estimering av svulst kvantum benytter caliper målinger og (B) tumor vekst målt ved bioluminescens imaging (BLI). Tumor størrelse uttrykkes Foton flux (fotoner/sek). p < 0,01, ikke-utdannet MSC (n = 6) vs utdannet MSC (n = 6), unpaired t-test. Data uttrykkes som betyr ± SEM. (C) representant BLI bilder av mus med etablerte osteosarcoma svulster (topp panel). Fargeskala bar varierer fra 7,7 x 107 (lilla) til 2.6 x 108 (rød) fotoner/sek. I det nedre panelet, er svulst området visualisert uten BLI overlegg. Pilene angir svulst bulk. Skalere barer: 0,6 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Bildebehandling MSCs og ex vivo lungevev. (A) fluorescens mikroskopi bilde av kultivert GFP-positive liggende under adipose-avledet MSCs (grønn). (B) Immunofluorescence farging av GFP-positive MSCs i beinmargen og (C) i tumor vev av MSC-mottak mus (grønn: MSCs, blå: DAPI farget kjerner; skala bar 10 µm). (D-F) Ex vivo bioluminescens imaging (BLI) viser høyere tall i metastatisk fokus i mus mottar EV-utdannede MSCs (F) i forhold til mus mottar naiv MSC (E) eller ingen MSC (D). Skala fargesøylen varierer fra 1 x 106 (lilla) til 1,5 x 106 (rød) fotoner/sek. (G) kvantifisering av lunge metastasering tall som visualisert ved BLI (linjene representerer medianen; * p < 0,05, ensidig t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Svulst-utskilles ekstracellulære blemmer (EVs) kan endre fysiologi av lokale og fjerntliggende mesenchymal celler til å generere en svulst-støttende miljø. Her beskriver vi generering av en prekliniske musemodell osteosarcoma som lar Disseksjon av EV-mediert samspillet mellom kreftceller og mesenchymal stamceller (MSCs) i vivo. Vi viser at systemisk injeksjon av menneskelig svulst EV-utdannede MSCs i mus med osteosarcoma xenografts sterkt fremmer kreft vekst og metastasering dannelse av IL-6/STAT3 signalnettverk veien7.
Nyere studier har vist at kreft EVs kan hjelpe i dannelsen av pre metastatisk nisje ved å endre virkemåten til lokale eller Ben margtransplantasjon-avledet stromal celler16,28,29. Disse studiene er hovedsakelig utført ved å injisere direkte kreft-avledet blemmer i mottakerens musen, noe som kompliserer identifikasjon av celletyper ansvarlig for svulst-fremme effekter. I vår protokollen oppstår utdanning av MSCs med kreft EVs i vitro før MSC injeksjon. Denne tilnærmingen kan adressering av bidraget av svulst-MSC crosstalk til kreft progresjon, og minimerer forvirrende indirekte effekter av kreft EVs andre komponenter av lokale eller systemisk miljøet.
For å vurdere om de utdannet MSCs hjem til svulst området, injisert vi systemisk GFP-positive MSCs i halen stemning av svulst rentebærende mus. Hale blodåre injeksjoner er en avgjørende, men teknisk utfordrende trinn i mange eksperimentelle protokoller. For å sikre minimale variasjoner blant injeksjoner skal prosedyren utføres av erfarne etterforskere. Riktig intravenøs administrasjon kan bekreftes visuelt ved å observere bevegelsen av væsken gjennom åre. Hvis en hvit vises på halen eller motstand ved skyving under injeksjon, var vaskulære tilgang ikke oppnådd. I dette tilfellet skal prosedyren gjentas ved å sette inn nålen over første injeksjonsstedet. Fordi MSCs lett hjemme i på svulst, kan vellykket administrasjon av (GFP-positive) MSCs bli bekreftet av immunofluorescence farging av tumor vev og bein margtransplantasjon fire dager etter injeksjon (Figur 4B, C).
Vi viser at kreft-utskilles EVs induserer en svulst-støttende fenotypen i MSCs ved å endre produksjonen av inflammatoriske cytokiner. Dette funnet er spesielt relevant siden immun modulering svulst immun evasion er viktige mekanismer i ondartet progresjon. Våre data tyder på at kreft EVs kan direkte, som rapportert av uavhengige studier21,30,31,32,33, eller indirekte (via MSCs) påvirke medfødt eller adaptive immunsystemet komponenter. Men begrenser bruk av en xenograft (immunsupprimerte) modell muligheten til å undersøke dette aspektet av EVs. Dermed må liknende tilnærminger i immunkompetente eller humanized musen modeller foretas for å definere hvilken rolle EV-mediert svulst-MSC-immune celle interaksjoner i kreft.
Til slutt, fordi MSCs kan bli rekruttert fra benmargen eller andre vev kilder til svulster, vår metode er ikke begrenset til studiet av bein kreft, men kan brukes for å undersøke hvilken rolle svulst EV-utdannede MSCs i flere kreft typer2, 3 , 4 , 5 , 6, som studier i melanoma og lymfom modeller bekrefte34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Løping Baglio ble støttet av et fellesskap av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) delfinansiert av EU. I tillegg har dette prosjektet mottatt støtte fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under Marie Sklodowska-Curie grant avtalen ingen 660200 (til SR Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
