Vi presenterer en ny tilnærming for å karakterisere kreftceller. Vi kombinert immunofluorescence med DNA fluorescerende –på plass-hybridisering evaluere celler fanget av en functionalized medisinske wire kan i vivo berikende CTCs direkte fra pasienten blod.
Sirkulerende kreftceller er (CTCs) assosiert med dårlig overlevelse i metastatisk kreft. Deres ID, phenotyping og genotyperingteknologi kan føre til en bedre forståelse av svulst heterogenitet og dermed lette valg av pasienter for personlig behandling. Imidlertid er dette hindret på grunn av sjeldenhet av CTCs. Vi presenterer en innovativ tilnærming for prøvetaking et høyt volum av pasientens blod og få informasjon om tilstedeværelse, fenotype og gene translokasjon av CTCs. Metoden kombinerer immunofluorescence flekker og DNA fluorescerende –på plass-hybridisering (DNA fisk) og er basert på en functionalized medisinske wire. Denne ledningen er en innovativ enhet som tillater i vivo isolering av CTCs fra store mengder perifert blod. Blod volumet vist av en 30 minutters administrasjon av ledningen er ca 1,5-3 L. For å demonstrere gjennomførbarheten av denne tilnærmingen, epithelial celle vedheft molekyl (EpCAM) uttrykk og chromosomal translokasjon av ALK-genet ble bestemt i ikke-småcellet lungekreft kreftcelle (NSCLC) linjer av functionalized ledningen og farget med immuno-DNA fisk tilnærming. Vår største utfordring var å utføre analysen på en 3D-struktur, functionalized ledningen, og å finne immuno-fenotypen fisk signalene på dette støtter bruk av konvensjonelle fluorescens mikroskop. Resultatene indikerer at fange CTCs og analysere deres fenotypen og chromosomal omorganisering kan potensielt representerer en ny kameraten diagnostiske tilnærming og gir en innovativ strategi for å forbedre personlig kreft behandlinger.
CTCs representerer et viktig skritt i kreft celle spredning1. Deres tilstedeværelse i perifert blod av pasienter er tilknyttet (metastatisk) tilbakefall og sykdom progresjon2,3. CTC isolering og karakterisering fra blodet av pasienter er en ikke-invasiv flytende biopsi. De siste årene har blitt det stadig tydeligere som overvåking progresjon og svar av svulster på ulike behandlinger bruker denne typen analyser gir viktig klinisk informasjon4,5. Flytende biopsi er enda mer nyttig når kirurgi er ikke gjennomførbart eller når primære tumor vev er ikke tilgjengelig, dvs.for ikke-biopsiable lesjoner. Derfor er denne tilnærmingen lovende i bestemte kreft innstillinger som metastatisk NSCLC, der tilstedeværelse av CTCs har vist seg å ha en negativ prognostiske rolle6. NSCLC er en svulst det har spesielt målrettet terapeutiske metoder7,8,9 designet for å fungere på bestemte molekyler (molekylære mål) kjent være involvert i veksten, progresjon, og spredningen av sykdommen. Derfor er påvisning av konkrete mål under sykdomsprogresjon nødvendig. CTC undersøkelse er en svært interessant diagnostiske tilnærming til å oppdage og overvåke narkotika mål uten behov for primær eller metastatisk vev. For eksempel er oppdagelsen av ALK-genet translocations i NSCLC celler forbundet med følsomhet overfor crizotinib, en spesifikk målrettet terapi10. Men i dag utføres oppdagelsen av ALK translocations bare på fine-nål aspirates eller liten biopsier; som et resultat, uten en svulst er vev ALK analyse ikke mulig. CTCs er et potensielt alternativ til tumor vev-baserte undersøkelser og en lovende følgesvenn diagnostiske tilnærming.
Til tross for deres mulige betydning er CTCs fortsatt gjenstand for stor debatt blant forskning, hovedsakelig på grunn av deres sjeldenhet (1-10 celler/mL perifert blod11). Gjeldende flytende biopsi metoder bruker en begrenset mengde blod (dvs., 1-30 mL)12,13, men dette skaper en situasjon suboptimal følsomhet for gjenkjenning av CTCs. Derfor, forskning er garantert å finne tilnærminger og utvikle enheter å utføre CTC målrettede flytende biopsi på et større volum av perifert blod.
En alternativ enhet, en functionalized medisinske wire (se Tabell for materiale), er blitt bebygget å overvinne blod prøvetaking begrensninger og få et mer representativt analyse av CTCs. Denne functionalized wire er CE godkjent medisinsk utstyr som fanger CTCs direkte fra blodet kreft pasienter1. Det består av en 16-cm lange rustfritt stål wire (figur 1a) med 2-cm lange functionalized tips belagt med et 0,2 µm tykke lag av gull. Laget blir igjen dekket av en 1-5 µm tykke polycarboxylate hydrogel stratum covalently kombinert med antistoffer rettet mot EpCAM, en av de mest uttrykt antigener på overflaten av CTCs14. Functionalized spissen av ledningen er innført i en blodåre armen pasienten og forblir i posisjon for minst 30 min. Denne fremgangsmåten lar isolering av CTCs i vivo, direkte i perifert blod og skjermen ca 1,5 til 3,0 L blod (ca 300-fold mer enn brukes for alternative tilnærminger)1.
Pantel et al. vist effekten av denne tilnærmingen hjelpe CTCs direkte i armen vener lunge kreft pasienter15. De utført wire immunofluorescence flekker for å identifisere CTCs bruke konvensjonelle antistoffer rettet mot EpCAM og pan-cytokeratin og CD45 for gjenkjenning av leucocyte. Ledningen ble undersøkt under en optisk fluorescens mikroskop15. Forfatterne viste at enheten klarte å isolere CTCs, men de ikke undersøke alle terapi-relaterte mål som ALK translocations.
Presentert metoden tar sikte på å identifisere mulige CTCs i NSCLC linjer på grunnlag av phenotypical parametere, f.eks, EpCAM positivitet og tilstedeværelsen av molekylære biomarkers, for eksempel ALK status (figur 1b). Denne 3 dager lange prosedyren kombinerer en functionalized wire og immunofluorescence flekker med DNA fluorescens –på plass-hybridisering (DNA fisk), kalt Immuno-DNA-fisk. At CTCs er sjeldne enheter, er fordelen med denne protokollen at CTCs kan være preget på samme ledning både immunophenotypic funksjoner og DNA rearrangements.
I dette papiret, for første gang, en metode immunofluorescence flekker og DNA fisk, for bruk med functionalized ledningen ble foreslått. Metoden ble kalt Immuno-DNA fisk. Denne teknikken ble utviklet å tillate samtidig identifikasjon av antatte CTCs på en 3D wire på grunnlag av phenotypical parametere, for eksempel positivitet å EpCAM (hendelse 1), og å lette oppdagelsen av molekylære endringer, for eksempel ALK-genet status ( hendelse 2). Samtidige identifikasjon av to hendelser gjør påvisning av deres co lokalisering. Derfor kan denne tilnærmingen skreddersys for å identifisere og karakterisere CTCs Hentet fra blod kreftpasienter. Potensielle effekten av haemo-komponenter og leukocytter på flekker prosedyren påvirker ikke vanligvis prosedyren. Spesielt angitt data rapportert i litteraturen at haemo-komponenter og leukocytter ikke påvirker den immunofluorescence flekker av cellene knyttet til ledningen, det avgjørende skrittet å identifisere faktiske CTCs1,15.
Fluorescens lysstyrken Immuno-DNA fisk er litt mindre markert enn en tradisjonell immunophototyping analysen og er et resultat av den høye temperaturen nødvendig for fisk analysen. Men er immunofluorescence flekker fortsatt betydelige. For eksempel er et svakt signal fortsatt synlig i lav EpCAM-uttrykke celle linjen NCIH1975. Den høye temperaturen som kreves for fisk analysen er den viktigste begrensende faktoren i å velge den riktige fluorochrome knyttet til antistoffer. I denne protokollen, må antistoffer være koblet til en thermostable fluorochrome for å tåle DNA rødsprit temperaturen. For eksempel er phycoerythrin, en thermosensitive fluorochrome, ikke anbefalt i denne innstillingen på grunn av fluorochrome fornedrelse skyldes høy temperatur. Fluorescein isothiocyanate er et godt valg og ofte vanlig fluorochrome ansatt på fisk sonder. Immuno-DNA fisk autofluorescence signalet er svært dårlig på standard 2D støtter. På wire støtte, kan polymer laget indusere en liten autofluorescence signal, spesielt på den røde kanalen. I motsetning til 2D bakgrunnen, et aspecific bakgrunn signal merkbar på ledningen, men påvirker ikke betydelig kjerner identifikasjon eller cellen karakterisering.
Mikroskopet evaluering av ledningen er mye mer fatiguing enn på en 2D støtte på grunn av grensene for en optisk mikroskop lese overflaten av en sylindriske-formet 3D struktur. Men kan dette problemet overvinnes ved roterende wire holderen og anskaffe bildene som er hovedsakelig lokalisert langs midtlinjen av ledningen. Wire abonnenten tillater en 360 ° rotasjon av ledningen. Når fokusert på kjerner, holde endrer fluorescens kanaler ikke nødvendigvis fokus på målet. Derfor er det viktig å opprettholde fokus på indre-celle målområdet.
Denne teknikken kan skreddersys for å oppdage og karakterisere celler i forskjellige typer 3D støtter. Det kan også være mulig å bruke forskjellige antistoffer og FISH sonder. Når du velger å bruke ulike antistoffer, er fluorochrome thermostability og det uttrykket målet antigen på cellemembranen viktige faktorer å vurdere. Intra-cytoplasmatic antigener kan også være farget. Når bruker ulike fisk sonder, er det viktig å sjekke dataarket spesifikasjonene for rødsprit prosedyren og forberede celler FISKEN analysen tilsvarende.
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
H20 | MilliPore | ||
XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |