Summary
هذه المخطوطة يصف استخدام الصحفيين فلوروجينيك ترميز وراثيا في تطبيق التصوير خلية يعيش لدراسة الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. ويوفر هذا النهج التجريبي القرار الزمانية المكانية لم يسبق لها مثيل، وحساسية، وخصوصية مع تجنب العديد من أوجه قصور الأساليب التقليدية المستخدمة للكشف عن الأكسدة السمية.
Abstract
بينما الأكسدة إليه سمية يكثر ذكرها، الأساليب التقليدية للدراسة فإنه يعاني من عدد من أوجه القصور، بما في ذلك تدمير للعينة، والأخذ بالنتائج الملموسة المحتملة، وعدم وجود خصوصية لرد الفعل الأنواع المعنية. ومن ثم، هناك حاجة الحالية في مجال علم السموم للأساليب غير المدمرة وحساسة ومحددة التي يمكن استخدامها لمراقبة وقياس الاضطرابات الأكسدة داخل الخلايا، أكثر شيوعاً المشار إليها الأكسدة. وهنا نقدم طريقة لاستخدام اثنين من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا، roGFP2 وفرط، لاستخدامها في الدراسات خلية يعيش التصوير لمراقبة ردود الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. roGFP2 اكويليبراتيس مع الجلوتاثيون الأكسدة المحتملة (هالمدفع جريازيف)، بينما فرط مباشرة بالكشف عن فوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). يمكن التعبير عنها في مختلف أنواع الخلايا عن طريق تعداء أو توصيل كل من أجهزة الاستشعار، ويمكن أن تكون مستهدفة لمقصورات الهاتف الخلوي محددة. الأهم من ذلك، يوفر الفحص المجهري خلية يعيش باستخدام أجهزة الاستشعار هذه عالية الدقة المكانية والزمانية التي ليس من الممكن استخدام الأساليب التقليدية. التغيرات في كثافة fluorescence رصدها في 510 نانومتر يخدم كقراءات لكل فلوروجينيك ترميز وراثيا من أجهزة الاستشعار عند التتابع ولع 404 نانومتر و 488 نانومتر الضوء. هذه الخاصية تجعل كلا راتيوميتريك أجهزة الاستشعار، القضاء على الشائعة مجهرية التحف وتصحيح الاختلافات في التعبير الاستشعار بين الخلايا. ويمكن تطبيق هذه المنهجية عبر مجموعة متنوعة من منصات فلوروميتريك قادرة على انبعاثات مثيرة وجمع موجية المنصوص عليها، يجعلها مناسبة للاستخدام مع أنظمة التصوير [كنفوكل] والتقليدية واسع المجال المجهري، ولوحة القراء. استخدمت كل من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، والدراسات السمية لمراقبة الهاتف الخلوي هالمدفع جريازيف والجيل2 2س ح في الوقت الحقيقي. المبين هنا هو أسلوب موحد قابل للتكيف على نطاق واسع عبر أنواع الخلايا ومنصات فلوروميتريك لتطبيق roGFP2 وفرط في خلية يعيش تقييمات السمية للأكسدة.
Introduction
بعد مصطلح "الأكسدة" كثيرا ما يشار إليه في علم السموم، ونادراً ما هو هذا المصطلح هو موضح على وجه التحديد. الأكسدة ويمكن الرجوع إلى العديد من العمليات داخل الخلايا، بما في ذلك توليد الأنواع الأكسجين التفاعلية، والأضرار الناجمة عن الجذور الحرة، أكسدة الجزيئات المضادة للأكسدة، والشلالات حتى تفعيل إشارات محددة. وقد وثقت طائفة واسعة من الملوثات البيئية1،2 و3،وكلاء الدوائية4 لحفز الأكسدة أما العمل المباشر لمجمع إكسينوبيوتيك نفسها5 ،6 أو ثانوي بإنتاج أنواع الأكسدة كجزء من الاستجابة الخلوية7،،من89،10. ولذلك، من مصلحة كبيرة في علم السموم التقيد بدقة وتميز في عمليات الأكسدة مما يؤدي إلى نتائج سلبية. الأساليب التقليدية لقياس الأكسدة تنطوي على تحديد الجزيئات الحيوية المؤكسد11،،من1213،،من1415 أو المواد المضادة للأكسدة16 ،،من1718،،من1920، أو القياس المباشر للأنواع المتفاعلة أنفسهم21،،من2223، 24. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق عادة انقطاع الهاتف الخلوي، الذي كثيرا ما يستهلك العينة، ويلغي القرار المكانية ويحتمل أن يقدم التحف25. تطوير أساليب أكثر حساسية وتحديداً للكشف عن أنواع الأكسدة وعلامات للأكسدة قابل للتطبيق على نطاق واسع للتحقيق في الآثار السلبية للتعرض إكسينوبيوتيك.
خلية يعيش مجهرية باستخدام جيل جديد من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا برز كأداة قوية لرصد حالة الأكسدة داخل الخلية من الخلايا الحية. عادة ما يعبر عن هذه المجسات باستخدام ناقل تحت سيطرة أحد المروجين الفيروسية التي يتم تقديمها عن طريق منهجيات تعداء أو توصيل. التعبير عالية الكفاءة ليست ضرورية، نظراً للخلايا معربا عن استشعار الفلورسنت يمكن بسهولة تحديد بصريا. لتقييمات السمية، يمكن ملاحظة معربا عن أجهزة الاستشعار هذه الخلايا باستخدام مجهر الأسفار كما أنهم يتعرضون لمركبات إكسينوبيوتيك في الوقت الحقيقي. ويسمح هذا التصميم التجريبي القياسات المتكررة في نفس الخلية، مما يتيح الأساس أنشئت كل خلية بمثابة عنصر التحكم الخاص به. عالية الدقة الزمنية الممنوحة بتصوير خلية يعيش مناسبة تماما للكشف عن أحداث الأكسدة، خاصة تلك التي تعتبر متواضعة في حجمها أو عابرة في الطبيعة. بالإضافة إلى كونها حساسة ومحددة سواء لتلك الجزيئات المستهدفة، يمكن متحمس الأسفار بعض أجهزة الاستشعار هذه باستخدام اثنين من الأطوال الموجية للضوء. يسمح هذا الظاهرة انبعاث الفلورسنت يمكن التعبير عنها كنسبة، مما يسمح بتمييز التغييرات إشارة المرتبطة باستجابات استشعار أصيلة من تلك الناجمة عن المصنوعات اليدوية مثل الاختلافات في التعبير الاستشعار، وسمك الخلية، مصباح كثافة، فوتوبليتشينج، وحساسية الكاشف ومضان26. وهناك ميزة أخرى لاستخدام أجهزة الاستشعار فلوروجينيك هو أن أنها يمكن أن تكون مستهدفة لمقصورات الهاتف الخلوي محددة، إنشاء مستوى القرار المكانية التي لا مثيل لها بالطرق التقليدية25،،من2627.
وضعت عائلة كبيرة من أجهزة الاستشعار وراثيا ترميز استناداً إلى البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وتتميز بتقرير عن مجموعة متنوعة واسعة من العلامات الفيزيولوجية، بما في ذلك درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وتركيزات الكالسيوم، ونسبة ATP/ADP25 ،،من2829،،من3031. وشملت من بين هذه مجسات الجلوتاثيون الأكسدة المحتملة (هالمدفع جريازيف) وفوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). في حين وضعت أجهزة الاستشعار هذه التطبيقات في الأكسدة والاختزال علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاء، كانت أيضا تكييف لدراسة الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. على وجه التحديد، يصف البروتوكول الواردة هنا استخدام roGFP2 الاستشعار الإلكترونيةالمدفع جريازيف وأجهزة الاستشعار2 2س ح فرط.
roGFP2 تقارير بشأن إمكانيات الأكسدة داخل الخلايا الجلوتاثيون مخفضة والمؤكسدة (المدفع جريازيف/جسج) عن طريق تتابع الأكسدة والاختزال التي تنطوي على الجلوتاثيون البيروكسيديز (GPx) وجلوتاريدوكسين (جركس) ريدكتيز الجلوتاثيون (GR) (الشكل 1)25، 32 , 33-الجلوتاثيون هو جزيء المضادة للأكسدة الخلوية الغالبة وهي موجودة أساسا في شكل انخفاض (المدفع جريازيف) تركيزات ميليمولار في25،سيتوسول34. بينما هالمدفع جريازيف لا ترتبط أي نتائج وظيفية، من المسلم كمؤشر هام على حالة الأكسدة داخل الخلايا34. زيادة صغيرة نسبيا في تركيز جسج يؤدي إلى زيادة في هالمدفع جريازيف التي يمكن كشفها بواسطة roGFP2. المثل الهامة، رصد هالمدفع جريازيف استخدام roGFP2 خلال التعرض إكسينوبيوتيك يمكن أن يحتمل أن تكشف الكثير عن إليه العمل في عدة نقاط في التتابع الأكسدة وتحول المسارات المرتبطة بها، مثل فوسفات بنتوز (الرقم 1 )35. أجهزة الاستشعار الثاني مناقشتها هنا، فرط، داخل الخلايا ح2س2 تحقيقا المستمدة من إدخال البروتين نيون أصفر (يفب) في المجال التنظيمي البكتيرية ح2س2-النسخ الحساسة عامل OxyR136. على الرغم من أن سابقا اعتبر أكسجين تفاعلية مدمرة الوسيطة، ح2س2 تحظى باعتراف متزايد كجزيء إشارات داخل الخلايا هامة تحت الظروف الفسيولوجية37، 38، مما يوحي بوجود أدوار غير معروف لح2س2 في علم السموم، وكذلك. على سبيل المثال، يمكن أن يكون ح الزائدة2س2 الناجمة عن تعرض إكسينوبيوتيك تمهيدا للتقلبات في الإشارات الخلوية أو تحولاً في الاستقلاب.
وأعربت كل من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا في عدة خطوط الخلايا المحددة، بما في ذلك خط الخلية الكبدية شرانيه البشرية A431 وخط الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية بياس-2B، لمراقبة التغييرات في هالمدفع جريازيف وح2 س2 في الاستجابة لمجموعة متنوعة من التعرض للسمية. وتشمل هذه الملوثات الغازية (35من الأوزون)، ومكونات قابلة للذوبان من الجسيمات (1، 2 نفتوكينون39،40 والزنك41)، والنيكل جسيمات نانوية (بيانات غير منشورة). وتمثل هذه الدراسات فقط مجموعة فرعية صغيرة من التطبيقات الممكنة لهذه اثنين من أجهزة الاستشعار. من الناحية النظرية، يمكن أن تستخدم أي نوع من الخلايا غير قادرة على تلقي والإعراب عن الحمض النووي لأجهزة الاستشعار هذه من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية التقليدية لتقييم آثار xenobiotics يشتبه في أن يغير حالة الأكسدة الخلوية. وحتى الآن، قد أعربت واحدة أو أكثر من هذه المجسات في مختلف بدائيات النوى وحقيقيات النوى، بما في ذلك عدة الثدييات والنباتات والبكتيريا والخميرة الخلية أنواع25،26،،من3642. قراءات لأجهزة الاستشعار2 2س هالمدفع جريازيف وح تغيير في كثافة fluorescence المنبعثة في 510 نيوتن متر عند الإثارة مع الضوء نانومتر 488 و 404. هذا الأسلوب القدرة على التكيف على نطاق واسع عبر منصات فلوروميتريك، بما في ذلك أنواع مختلفة من الفحص المجهري ([كنفوكل] وواسع المجال) ولوحة من القراء. يسمح الأسلوب الذي قدم إلى هنا للمراقبة حساسة ومحددة من داخل الخلايا هالمدفع جريازيف وح2س2 في نظم السمية في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الخلايا
ملاحظة: هذا الإجراء وصف توصيل لينتيفيرال من خط خلية مخلدة (بياس-2 باء؛ ATCC، ماناساس، خامسا) للتعبير عن المراسل المطلوب (roGFP2 أو فرط). يمكن أن تستخدم خطوط/أنواع الخلايا الأخرى و/أو أساليب نقل الجينات، بما في ذلك تعداء، طالما أنها تسفر عن مستوى مراسل التعبير الملائم لتصور عدد كاف من الخلايا معربا عن استشعار كل مجال الرؤية (عادة 5-10 خلايا). في حالة استخدام أساليب تعداء، ينبغي تنفيذ الإجراء في الطبق الذي سيتم استخدامه في نهاية المطاف لطريقة التحليل (مثلاً، ترانسفيكت الخلايا في نفس الطبق الذي سيقدم إلى المجهر). تفاصيل الخطوات الموضحة أدناه لإعداد ترانسدوكشنز الخلية المراد تنفيذها في صفيحة ثقافة خلية 6-جيدا. إذا لم يكن هذا الشكل حجم مناسب للتطبيق المطلوب، يمكن أن يكون محل سفن أخرى.
- تنمو خلايا إلى حوالي 40-60% في التقاء في وسائط النمو الطبيعي.
ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة خط الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية، بياس-2B، نمت في keratinocyte النمو المتوسطة (كجم). - قبل توصيل، استبدال وسائط النمو على الخلايا مع 500 ميليلتر خالية من المصل الوسائط التي تحتوي على المبلغ المناسب للفيروس، محسوبة بالصيغة:
- لتوصيل الخلايا بياس-2B، استخدم keratinocyte خالية من المصل القاعدي المتوسطة (كبم) لاستبدال وسائط النمو KGM أثناء إينكوبيشنز الفيروسية.
ملاحظة: الحساب المذكور أعلاه توصيل واحد من بئر واحدة من الخلايا في شكل 6-جيدا. إذا لزم الأمر، إجراء ترانسدوكشنز من عدة آبار يمكن تنفيذها بواسطة ضبط الصيغة مع تضاعف عدد من الآبار تكون ترانسدوسيد. بالنسبة ترانسدوكشنز لينتيفيرال، استخدم عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) بين 5 و 20. بالنسبة ترانسدوكشنز أدينوفيرال، استخدم موي بين 100 و 500.
- لتوصيل الخلايا بياس-2B، استخدم keratinocyte خالية من المصل القاعدي المتوسطة (كبم) لاستبدال وسائط النمو KGM أثناء إينكوبيشنز الفيروسية.
- احتضان الخلايا مع الخليط الفيروسية في 37 درجة مئوية ح 4، إعادة توزيع الجسيمات الفيروسية في الطبق كل 30 إلى 60 دقيقة مع هزاز موجزة أو دوامات الحركة.
- أضف 1 مل وسائط النمو الكامل للطبق واحتضان في 37 درجة مئوية ح 4-16 إضافية.
- إزالة جميع وسائل الإعلام، واستبدال وسائط جديدة كاملة النمو.
- لا تزال تنمو وممر الخلايا، والتوسع حسب الحاجة.
ملاحظة: يجب أن تبدأ الخلايا ملموسا معربا عن الاستشعار ضمن ح 12-48. إذا تم استخدام ناقل لينتيفيرال لتوصيل، ينبغي مواصلة التعبير مستقرة من أجهزة الاستشعار المرجوة عبر الممرات. - للتقييمات المستندة إلى الفحص المجهري، القاع الأطباق المجهر خلايا البذور في الزجاج وتنمو لالتقاء المطلوب (إيه سيفن زيرو-80 في المائة) قبل التصوير.
ملاحظة: بذر الكثافة سوف تعتمد على حجم الطبق، ومعدل النمو للخلية الخط قيد الاستخدام، والوقت للتقييم بعد البذر. على سبيل المثال، البذور 300,000 بياس-2B خلايا في صحن 35 ملم تسفر عن التقاء 70-80% تقريبا بعد يوم واحد من النمو.
2-الفحص المجهري البنية
ملاحظة: يتم تنفيذ البروتوكول هو موضح أدناه استخدام مجهر [كنفوكل] مزودة بخطوط الليزر في 404 و 488 نانومتر. ينبغي أن تسفر وسائل أخرى للقيام بتقييمات فلوروميتريك من أجهزة الاستشعار المذكورة ضمن هذا البروتوكول في انبعاث الجسيمات المقررة/أيضا عن بيانات قابلة للتطبيق. الأهم من ذلك، إعدادات المعدات يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً لنوع، والعمر، والشرط من الأداة التي يجري استخدامها؛ وهكذا، قد لا يكون أي صك القيم المذكورة الخاصة بالمعدات المستخدمة في مختبرات أخرى.
- القيام بتحليل التصوير جميع استخدام ضوابط بيئية للحفاظ على درجة حرارة ملائمة (مثلاً، 37 درجة مئوية) ورطوبة (عادة > 95% رطوبة نسبية)، و/أو الغاز تركيز (مثلاً، 5% CO2) مناسبة للخلايا في جميع أنحاء مدة التجربة.
- في حالة استخدام قيم عالية الرطوبة النسبية، إبقاء أي الأسطح التي قد تأتي في اتصال مع الغلاف الجوي هوميديفيد (مثلاً.، هدف المجهر) في أو أعلى قليلاً من درجة الحرارة التي يتم إنشاؤها الرطوبة منعا للتكثيف. وهذا يمكن أن يتحقق باستخدام سخان موضوعية و/أو التدفئة الشريط وعنصر تحكم سخان مناسبة.
- قم بتشغيل كافة مكونات المجهر وإعداد جميع المعدات اللازمة للإثارة متسلسلة في شمال البحر الأبيض المتوسط 488 و 404 مع الانبعاثات في 510 نانومتر. ضمان يتم تعيين جميع عناصر التكوين البصري بشكل مناسب للحصول في الوقت الحقيقي.
- إعداد غرفة بيئية لمرحلة أعلى للحفاظ على درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 الغلاف الجوي، و > رطوبة 95%. قبل البدء بالحصول على الصور، حجته الدائرة البيئية لمالا يقل عن 10 دقيقة بعد الإعداد الأولى لكافة عناصر التحكم البيئي.
ملاحظة: يجوز القضاء على الظروف البيئية أو تعديلها تبعاً لطول التجربة، ونوع الخلية، والتعرض المستخدمة. - ضع طبق الخلايا (1.7 خطوة) على المرحلة-الأعلى داخل الدائرة البيئية.
- مع عدسة الهدف المنشود، تجد المستوى البؤري للخلايا باستخدام العدسة والضوء الأبيض، وأن تضمن مورفولوجيا العادي.
ملاحظة: 1.4 غ 60 X البنفسجي لتصحيح، والنفط مغمورة عدسة الهدف يستخدم عادة، الذي يسمح بتحديد هوية مقصورات داخل الخلايا في حين تحقيق أقصى قدر من الدقة البصرية للنظام [كنفوكل]. - تحقق التعبير صف من الخلايا في مجال الرؤية. القيام بذلك في حين تصور الخلايا تحت الإضاءة الفلورية واسع المجال مع مجموعة عوامل تصفية مناسبة، مثل fluorescein isothiocyanate (فيتك). عند هذه النقطة، استخدام الإضاءة واسع المجال بينما تبحث من خلال العدسة أكثر ملاءمة لأنها أسهل لتحريك الطبق لتحديد حقل خلايا للدراسة. وبصفة عامة، اختر وجهة حقل يحتوي على خلايا على الأقل من 5 إلى 10 التي هي التعبير عن أجهزة الاستشعار، وكما هو مبين الفلورية الخضراء.
- وبدلاً من ذلك، إجراء هذا التقييم كونفوكالي باستخدام الليزر الإثارة في طول موجي آخر متوافق مع أجهزة الاستشعار يجري التعبير عنها (488 نانومتر عادة ما يعمل بشكل أفضل).
ملاحظة: نظراً لخصائصها الجوهرية الفلورسنت، سيكون من الصعب تصور الخلايا معربا عن فرط من تلك roGFP2 عن استخدام أما فيتك أو في 488 نانومتر. ومع ذلك، لا يزال الممكن لترى الخلايا باهتة.
- وبدلاً من ذلك، إجراء هذا التقييم كونفوكالي باستخدام الليزر الإثارة في طول موجي آخر متوافق مع أجهزة الاستشعار يجري التعبير عنها (488 نانومتر عادة ما يعمل بشكل أفضل).
- حالما يتم العثور على مجال رؤية المطلوب، قم بإغلاق قاعة البيئية.
ملاحظة: استخدم ميزة الحفاظ على التركيز، متوفرة غالباً ما تقف مجهر متقدمة، تيسيرا للحفاظ المستوى البؤري مستقرة طوال فترة الدراسة. - إعداد معلمات اقتناء لضمان التقييم الأمثل لاستشعار للفائدة عبر فترة التعرض المرجوة. وفيما يلي التوصيات والنهج لتصوير [كنفوكل] استشعار الاستجابات:
- ضبط قوة الليزر للإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات في 510 نانومتر. اختيار مستوى قوة ليزر يسمح تصور الخلايا، والاحتفاظ هذا ثابتة بين العينات أو تكرار الأطباق.
ملاحظة: لهذه الدراسة، 12% وطاقة الليزر 1.5% تستخدم لخطوط الليزر نانومتر 488 و 404، على التوالي. - استخدام عناصر تحكم [كنفوكل] لاقتناء البرمجيات للتأكد من أن تم تحسين المستوى البؤري المحدد لكثافة الانبعاثات fluorescence القصوى في مركز الخلايا محور (ع) بالمسح في 488 نانومتر بينما ضبط z-الطائرة. يتم إجراء هذا أسهل باستخدام إعداد مكاسب عالية أثناء البحث عن z-الطائرة أن النتائج في الخلايا الأكثر تعرضا زائداً. مرة واحدة تم العثور على الطائرة التنسيق المناسب، عودة المكسب إلى إعداد الذي الأكثر الأمثل للأسفار المراسل يجري استخدامه بدون أوفيرساتوراتينج بكسل ويحتفل.
ملاحظة: الليزر وكسب الإعدادات المناسبة لإيجاد ومراقبة الخلايا أثناء التجريب تعتمد اعتماداً كلياً على النظام [كنفوكل] يجري استخدامها. وبصفة عامة، مرة واحدة وقد تم العثور على الخلايا في مجال الرؤية، من المستحسن أن يكون الحد أدنى من طاقة الليزر المستخدمة (عادة دي تو زيرو %)، كما مسح المفرط للخلايا باستخدام ضوء الليزر ذات الطاقة العالية قد تحدث تغييرات الأكسدة يمكن كشفها بأجهزة الاستشعار. - استخدام المكاسب لصقل fluorescence خط الأساس. مع roGFP2، إنشاء خط الأساس قرب الحد الأعلى (≈ 90% كثافتها النسبية) الصك دون التشبع المفرط، كما سوف تفقد هذه الخلايا 510 fluorescence شمال البحر الأبيض المتوسط الناجم عن 488 نانومتر الإثارة عندما يزيد هالمدفع جريازيف . وفي المقابل، ينبغي أن تكون كثافة الأسفار مع 488 نانومتر الإثارة منخفض (≈ 10% كثافتها النسبية) عند خط الأساس لفرط التعبير عن الخلايا، كما سوف تكتسب هذه الخلايا 510 نانومتر fluorescence كثافة عند الكشف عن ح2س2 .
- كرر الخطوات من 2.9.2 و 2.9.3 مع الإثارة في 404 شمال البحر الأبيض المتوسط والانبعاثات في 510 نانومتر. إعدادات مكسب للطول الموجي الإثارة نانومتر 404 عكس تلك المستخدمة مع 488 نانومتر الإثارة لكل جهاز استشعار (أي خط الأساس المنخفض الفلورية (≈ 10% كثافتها النسبية) في 404 نانومتر ل roGFP2، الأسفار الأساس عالية (≈ 90% كثافتها النسبية) ح2 س2 الاستشعار).
ملاحظة: بشكل عام، الأسفار (510 الانبعاثات) في 404 نانومتر الإثارة سوف تكون أقل بكثير من أن يمكن الحصول عليها مع 488 نانومتر الإثارة في الخلايا الإعراب عن roGFP2 وفرط، كذروة نانومتر 404 إثارة طفيفة نسبيا كحد أقصى لكل من هذه أجهزة الاستشعار.
- ضبط قوة الليزر للإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات في 510 نانومتر. اختيار مستوى قوة ليزر يسمح تصور الخلايا، والاحتفاظ هذا ثابتة بين العينات أو تكرار الأطباق.
3. الحصول على البيانات
- إعداد البرنامج الحصول التتابع تثير موجات الإثارة اثنين (488 الأولى شمال البحر الأبيض المتوسط، ومن ثم 404 nm) وجمع الانبعاثات لكل منهما في 510 نانومتر في فاصل زمني محدد سلفا في جميع أنحاء الطول المطلوب للتجربة (مثل التقاط صور كل 60 s لمدة 60 دقيقة).
- وبدلاً من ذلك، الحصول على الصور يدوياً قبل وبعد التعرض إذا كان التوقيت التقريبي للتغييرات في هالمدفع جريازيف أو ح2س2 معروفة إكسينوبيوتيك يجري اختبارها. ومع ذلك، وهذا قد يؤدي إلى فقدان للأزمنة.
- لتقييم البارامترات التجريبية في الوقت الحقيقي، اختر على الأقل 5-10 خلايا معربا عن استشعار في الميدان وإقامة لهم كمناطق للفائدة ("رويس") لرصد التغييرات الأسفار الخاصة بهم أثناء التجربة.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية، ويمكن أن يؤديها بعد التجربة إذا كانت الملاحظة المباشرة في الوقت الحقيقي غير مرغوب فيه، أو منع القيود برامج الرصد المستمر. اعتماداً على السكان، والخلية اختيار استشعار معربا عن الخلايا رويس قد تمثل مجموعة من مستويات التعبير عبر الخلايا.- لهذه الدراسات، إضافة للسمية البيئية فينانثرينيقوينوني 9 و 10 (9 و 10-الانفصالي) أو فوق أكسيد الهيدروجين (H2O2) بعد فترة أساس 5-مين.
- تحضير جميع المواد الكاشفة لاستخدامها لاحقاً في هذا البروتوكول. حل 9 و 10-الانفصالي في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) بتركيز 15 ملم، وتمييع في وسائط الخلايا القاعدية تسفر عن حل عامل 250 ميكرون. بالإضافة إلى ذلك، تعد حلاً عامل من بيروكسيد الهيدروجين في المياه التي سوف تسفر عن تركيز نهائي من 1 ملم عند الحقن.
- بمجرد تم تعريف المعلمات التجريبية، تبدأ اقتناء دورة الوقت. إنشاء فترة أساس لمدة 5 دقائق على الأقل (أو 5 نقاط البيانات) قبل بدء التعرض إكسينوبيوتيك.
- تعرض الخلايا لأنها سامة ويجري التحقيق في استخدام النهج التقليدية للجرعات في المختبر . إعداد المركبات القابلة للذوبان في الماء أو المذيبات المناسبة الأخرى وحقن مباشرة إلى وسائل الإعلام.
- وإذا لزم المذيبات العضوية (مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو الإيثانول)، إبقاء تركيز المذيبات النهائي في أو أقل من 0.1 في المائة. تحقق من أن المذيب لا ينتج تأثير على هالمدفع جريازيف أو ح2س2 إنتاج مع عنصر تحكم سيارة في طبق منفصل من الخلايا.
- للمركبات مع انخفاض قابلية الذوبان، إضافة خطوة خلط استخدام ميكروبيبيتي على البروتوكول بعد إجراء الحقن. مضخة غازية التعرض مباشرة إلى غرفة البيئية باستخدام خليط الغاز الناقل المناسب.
- رصد التغيرات في الأسفار خلال فترة التعرض. إجراء الحقن اللاحقة حسب الحاجة. رعاية كبيرة ليس إزاحة الطبق أثناء الحقن، حيث أنه يتم اتباع نفس الخلايا طوال طوال الوقت أثناء تصويرها في نفس المستوى البؤري.
- في نهاية التجربة، تعرض الخلايا إلى عناصر التحكم المناسبة. لكل من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا، إضافة تركيزات معينة من المركبات المعروفة لأكسدة والحد من هذه المجسات في مظاهرة أشار لاستجابتها راتيوميتريك. ح2س2 وديثيوثريتول (DTT) بمثابة الضوابط المناسبة لأكسدة والحد من كل من أجهزة الاستشعار. عادة، بتركيز نهائي من 100 1,000 ميكرومتر ح2س2، تليها ديثيوثريتول 1-5 مم (DTT)، يسمح للمستخدم بالكامل أكسدة والحد من هذه المجسات.
- لهذه الدراسات، استخدم 1 مم ح2س2 تليها 5 مم DTT لتحديد استجابة استشعار الحد الأقصى.
- انتظر على الأقل 5 دقائق للسماح لأجهزة الاستشعار للاستجابة، وثم حقن عامل تخفيض، مثل DTT، الحد سينور وإعادته إلى مستوى الأسفار في أو بالقرب من خط الأساس الخاص بها المنشأة.
ملاحظة: استخدام عناصر التحكم في هذه الخطوة هو أمر حاسم للتطبيع، وينبغي أن يقوم في نهاية كل تجربة لتحديد دينامية مجموعة من أجهزة الاستشعار في كل خلية. ل roGFP2، يمكن أيضا إضافة الدريثيول في نهاية التجربة. الدريثيول يتجاوز التتابع roGFP2 الأكسدة والاختزال لأكسدة الاستشعار مباشرة. وهذا مفيد لتقييم وظيفة استشعار عقب التعرض إكسينوبيوتيك.
4. تحليل البيانات
- إذا لم تكن قد أنشأت، رسم رويس حول الخلايا يتم تحليلها. استخدام البرامج المناسبة لقياس كثافة الأسفار كل عائد الاستثمار في كل طول موجي طوال الوقت. التأكد من أن الخلايا لم يتحرك أو لا تحول اللوحة أثناء التشغيل.
ملاحظة: يتم إنشاء رويس الأكثر سهولة باﻻعتماد منطقة مغلقة أن يتبع نمط التعبير الفلورسنت لكل خلية. لمواصلة المساعدة في هذه العملية، يمكن أن يكون مضافين صورة الضوء (أو برايتفيلد) منقولة من الخلايا ضمن مجال الرؤية الراسخة على الصورة الفلورية في الجهود الرامية إلى تحديد حدود الخلية. ومع ذلك، يتطلب استخدام صورة الخفيفة المنقولة للمستخدم لالتقاط قناة إضافية (مجموعة من الصور) طوال فترة التجربة. بدلاً من ذلك، إدراج بعض المصنعين الخوارزميات في البرمجيات التصوير التي تستخدم معلمات محددة مثل كثافة عتبات لتأسيس رويس في طريقة أكثر كمية وأقل ذاتية،. - تصدير البيانات إلى برمجيات التحليل المطلوب (مثل جداول البيانات الإلكترونية).
- حساب استجابة استشعار راتيوميتريك لكل عائد الاستثمار في كل نقطة وقت استخدام الصيغ:
- لكل نقطة من الزمن، متوسط قيم محسوبة راتيوميتريك رويس كافة.
- حساب قيمة الأساس، التي سيتم استخدامها لتطبيع البيانات، عن طريق حساب متوسط القيم المحسوبة سابقا راتيوميتريك (الخطوة 4، 4) التي تم جمعها قبل إضافة إكسينوبيوتيك (مثلاً، النقاط الخمس-الوقت الأول).
- تطبيع القيم راتيوميتريك من الخطوة 4، 4 بتقسيم كل قيمة بقيمة الأساس تحسب 4.5. نسب طبيعية سوف تتمحور حول قيمة 1 عند خط الأساس، مع زيادات في هالمدفع جريازيف أو ح2س2 الحقن التالية سوف يسبب نسبة زيادة. تقييمات إكسينوبيوتيك التي تسبب تغيرات الأكسدة تميل إلى أن تسفر عن القيم في مجموعة من 3-6 مرات قيمة الأساس.
- للمساعدة في المقارنة بين ردود داخل وعبر التجارب، تعبر عن تطبيع البيانات كنسبة مئوية من استجابة استشعار القصوى بتحديد الاستجابة للأكسدة التحكم (على سبيل المثال، 1 مم ح2س2) بنسبة 100%.
ملاحظة: إذا كان التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من استجابة استشعار القصوى، أنها حاسمة لضمان أن يستخدم نفس تركيز الأكسدة التحكم دائماً عبر التجارب. كافة البيانات المستمدة من تحليل التصوير خلية يعيش قابلة للتحليل الإحصائي لبير وجروبويسي التقليدية يتم اختياره وفقا لتقدير المحقق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم استخدام roGFP2 وفرط في الكشف عن التغييرات في هالمدفع جريازيف وداخل الخلايا ح2س2 جيدا الموصوفة سابقا25،36،،من4243 ، ويتضح هنا. [كنفوكل] صور من الخلايا معربا عن roGFP2 في خط الأساس، والإضافة التالية من ح2س2 و DTT مبينة في الشكل 2. ثم تصدير البيانات من الصور التي تم جمعها من خلال التجربة وتحليلها كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول. كما هو موضح، إضافة خارجية ح2س2 كعنصر إيجابي وتنتج استجابات استنساخه عندما يتم تطبيع البيانات لخط الأساس الخاصة بكل منها، وهو إنشاء مجموعة ديناميكية معرفة من خلال إضافة خارجية معروفة التأكسد/تأشيب (أي، ح2س2 و DTT) (أرقام 3 و 4، و 5).
الاستجابة للمحفزات السمية عادة أكثر تقلباً من تلك الناجمة عن عناصر التحكم. هذا المتوقع، كما قد يكون مركبات إكسينوبيوتيك بليوتروبيك من آثار على الخلايا، بدءاً من الأكسدة الدراجات إلى إيراد بروتينات داخل الخلايا. أمثلة من roGFP2 وفرط الاستجابات الناجمة عن التعرض للسمية 9 و 10-الانفصالي، الملوثات جوية مؤكسدة التي شكلتها التفاعلات الجوية phenanthrene44، ترد في أرقام 6 و 7. تصوير الرسوم البيانية في هذه الأرقام على تطور كل خطوة المشاركة في تحليل البيانات الواردة في الجزء 4 من البروتوكول. كما هو موضح، تطبيع كل خلية لخط الأساس الخاصة ومراقبة إيجابية (الشكل 6ب)، يقلل من التفاوت بين الخلايا في حجم الاستجابة استشعار من البيانات الخام (الشكل 6A). في الحالات التي يكون فيها الفرق في الاستجابة الخلوية للفائدة، يمكن إجراء تطبيع البيانات تصل إلى هذه النقطة، مع خلايا فردية يمثلها بهم الخطوط في الرسم البياني. يمكن أن تكشف عن التباين في الحجم أو حركية للردود بين الخلايا في الطبق نفس الأفكار الميكانيكية الهامة التي تعكس الاختلافات في دورة الخلية، على سبيل المثال. وبدلاً من ذلك، يمكن عرض متوسط استجابة الخلايا في الطبق جنبا إلى جنب مع الانحراف المعياري (الشكل 6ج). خلاف ذلك، إذا كان يجري تقديم replicates تجارب منفصلة، يمكن تقديم البيانات كقيم الكثافة تطبيع fluorescence النسبي أو نسبة مئوية من الاستجابة القصوى الناجمة عن الأكسدة التحكم (الأرقام 3، 4، 5، و 6 د)، عرض متوسط جميع replicates مصحوبة بالخطأ المعياري للوسط. الكشف عن الهواء المحيط الملوث 9 و 10-الانفصالي المعروف أن cycler الأكسدة قوية، وافترض أننا المسؤولة عن القمم الدورية لإنتاج بيروكسيد الهيدروجين الكشف عنها بواسطة هايبر (الشكل 7) ويزيد تدريجي هالمدفع جريازيف بواسطة roGFP2 ( الرقم 6 د).
الشكل 1 . ترحيل الأكسدة الجلوتاثيون roGFP2. الجلوتاثيون بيروكسيداسيس (GPx) أكسدة الجلوتاثيون (المدفع جريازيف) مخفضة إلى جسج ردا على بيروكسيد الهيدروجين (حاء2يا2)، مما يؤدي إلى زيادة الأكسدة الجلوتاثيون المحتملة (هالمدفع جريازيف). RoGFP2 استشعار فلوروجينيك اكويليبراتيس مع ه داخل الخلاياالمدفع جريازيف عندما تتأكسد من جلوتاريدوكسين (جركس). في مسار التخفيض، يحفز جركس الحد roGFP2 عن طريق ديجلوتاثيونيليشن بانخفاض مستويات جسج ويتم إعادة تأسيس مستويات طبيعية من المدفع جريازيف ريدكتيز الجلوتاثيون (GR) على حساب نادف. نادف توفرها الجلوكوز عن طريق المسار فوسفات بنتوز (تعادل القوة الشرائية). مقتبس من جيبس-فلورنوي et al35. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . صور مجهرية [كنفوكل] من الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية خط بياس-2B معربا عن roGFP2 سيتوسوليك- كانت مضاءة الخلايا في 488 نانومتر (أ-د)، تليها 404 نانومتر (ه-ه). صور تظهر الأسفار المنبعثة في 510 نيوتن متر للشروط التالية: خط الأساس (أ، ه)، 100 ميكرومتر حاء2يا2(ب، و)، 1 ملم ح2س2 (ج، ز)، و 5 ملم DTT (د، ح). 60 X VC Apo خطة الهدف. تمثل أشرطة مقياس 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . الجرعة تعتمد التغييرات في roGFP2 الناجمة عن ح2س2 في الخلايا بياس-2. وقد اكويليبراتيد الخلايا مدة 30 دقيقة في الإعلام القاعدي (كبم) keratinocyte الفينول الأحمر مجاناً قبل التعرض. جميع الإضافات من ح2س2 حدث بعد فترة خط أساس من 5 كحد أدنى roGFP2 fluorescence المنبعثة في 510 نانومتر تم تجميعها باستخدام مسار فرقة 525/30 نانومتر تصفية عقب الليزر الإثارة في 404 و 488 نانومتر. تم تطبيع الاستجابات الخلوية لخط الأساس الخاصة بكل منها واستجابة استشعار الحد الأقصى بعد إضافة 1 مم ح2س2. وترد القيم ± يعني الخطأ القياسي، n = 3، حيث n يتكون من متوسط 5-10 خلايا مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . استجابة الجلوكوز تجويع الخلايا بياس-2B معربا عن roGFP2 بجرعات مختلفة من ح2س2- وقد اكويليبراتيد الخلايا لمدة ساعتين في متوسط ملح الحد أدنى الذي لا يحتوي على السكر قبل التعرض. جميع الإضافات من ح2س2 حدث بعد فترة خط أساس من 5 كحد أدنى roGFP2 fluorescence المنبعثة في 510 نانومتر تم تجميعها باستخدام مسار فرقة 525/30 نانومتر تصفية عقب الليزر الإثارة في 404 و 488 نانومتر. تم تطبيع الاستجابات الخلوية لخط الأساس الخاصة بكل منها واستجابة استشعار الحد الأقصى بعد إضافة 1 مم ح2س2. يتم عرض القيم ك ± يعني الخطأ القياسي، ن = 3، حيث n يتكون من متوسط 5-10 خلايا متميزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5. استجابة الخلايا بياس-2B معربا عن فرط جرعات مختلفة من ح 2 O 2 . وقد اكويليبراتيد الخلايا مدة 30 دقيقة في كبم الفينول الأحمر مجاناً قبل التعرض. جميع الإضافات من ح2س2 حدث بعد فترة خط أساس من 5 دقيقة Fluorescence المنبعثة في 510 نانومتر تم تجميعها باستخدام مسار فرقة 525/30 نانومتر تصفية عقب الليزر الإثارة في 404 و 488 نانومتر. تم تطبيع الاستجابات الخلوية لخط الأساس الخاصة بكل منها واستجابة استشعار الحد الأقصى بعد إضافة 1 مم ح2س2. يتم عرض القيم ك ± يعني الخطأ القياسي، ن = 3، حيث n يتكون من متوسط 5-10 خلايا متميزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. الردود التي يسببها الانفصالي 9 و 10 خلايا بياس-2B معربا عن roGFP2. وقد اكويليبراتيد الخلايا مدة 30 دقيقة في كبم الفينول الأحمر مجاناً قبل التعرض. إضافة 25 ميكرومتر 9 و 10-الانفصالي مع خلط وقع في 5 دقائق، تليها إضافة 1 مم ح2س2 في 20 دقيقة و 5 ملم DTT في 24 دقيقة الفريق A يصور roGFP2 الخام نسبة الخلايا الفردية في الطبق، كل خلية يمثله خط منفصل. تظهر لوحة ب تطبيع القيم من كل خلية فردية للأسفار الاستشعار الأساس، والمتوسط والانحراف المعياري لهذه البيانات يتم فرضه على نسب طبيعية منفردة في لوحة ج. ويرد في الفريق دالنسبة المئوية للاستجابة القصوى من أجهزة الاستشعار في المتوسط عبر كافة الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 -ردود الانفصالي المستحثة 9 و 10 من الخلايا بياس-2B معربا عن فرط. وقد اكويليبراتيد الخلايا مدة 30 دقيقة في كبم الفينول الأحمر مجاناً قبل التعرض. إضافة 25 ميكرومتر 9 و 10-الانفصالي مع خلط وقع في 5 دقائق، تليها إضافة 1 مم ح2س2 في 20 دقيقة و 5 ملم DTT في 25 دقيقة Fluorescence المنبعثة في 510 نانومتر تم تجميعها باستخدام مسار فرقة 525/30 نانومتر تصفية عقب الليزر الإثارة في 404 و 488 نانومتر. تم تطبيع الاستجابات الخلوية لخط الأساس الخاصة بكل منها واستجابة استشعار الحد الأقصى بعد إضافة 1 مم ح2س2. يتم عرض القيم كمتوسط 5-10 خلايا متميزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام roGFP2 وفرط في الكشف عن التغييرات في داخل الخلايا هالمدفع جريازيف وح2س2، على التوالي، وقد وصفت جيدا في السابق الدراسات الفسيولوجية وسمية 25،35،36 ،،من3940،41،،من4243. البروتوكول الواردة هنا التقارير وسيلة فعالة لتنفيذ هذه المجسات الأكسدة المرمزة وراثيا في الدراسات السمية وأشار تهدف إلى تقييم الاضطرابات الناجمة عن إكسينوبيوتيك من التوازن الأكسدة داخل الخلايا. الأهم من ذلك، الاستخدام السليم لأجهزة الاستشعار هذه الروابط أي التغيرات التي لوحظت على زوج الأكسدة محددة أو روس (هالمدفع جريازيف أو ح2س2)، في نهاية المطاف توضيح عدم وجود خصوصية مع العديد من النهج التقليدية الأكسدة. في ضمان نوعية البيانات الناتجة من هذه المجسات، بضعة جوانب يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم التجارب وتحليل تفسير البيانات. وهي تشمل: 1) استخدام الضوابط المناسبة، 2) تحقق استجابات المناسبة من أجهزة الاستشعار، و 3) التلاعب بمعلمات التجريبية توضيح آليات. هذه إضافة خارجية ح2س2 والقيمة كعناصر تحكم في نهاية فترة الملاحظة يخدم أغراضاً متعددة. أولاً، فإنه يتيح فرصة لتقييم مدى الاستجابة للتعرض السمية بالنسبة للإشارات القصوى والدنيا يمكن تحقيقها من أجهزة الاستشعار. هذا مفيدة للغاية في تطبيع الاستجابات لإجراء مقارنات بين التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم تنتهي التجربة بالإضافة إلى قوي خارجية للأكسدة والمحفزات التخفيض أثر التعرض السابق على استشعار/ترحيل سلامة. وعلاوة على ذلك، يمكن إضافة الدريثيول في نهاية تشغيل لتجاوز التتابع واختبار الأداء الوظيفي لاستشعار مباشرة للأضرار المحتملة التي قد ألحقت التعرض إلى فلوروفوري نفسه.
تماما كما هو الحال مع غيرها من التقنيات، عند تطبيق هذه المنهجية لدراسة نتائج سمية محددة، من المهم جعل التقييمات النوعية فيما يتعلق بالدقة للملاحظات التي أدلى بها. عند استخدام roGFP2 أو فرط مع أي إكسينوبيوتيك جديدة من المهم أولاً باختبار مجموعة من الجرعات، مع ضمان أن كثافة الفلورية (510 نانومتر الانبعاث) من كل طول موجي الإثارة (404 نانومتر و 488 نانومتر) التغييرات على النحو المناسب (أي زيادة أو نقصان) سينور الأكسدة المستخدمة. والهدف هو تحديد جرعة فيه استجابة استشعار قابلاً للاكتشاف، ولكن هو لا تطغى عليها التلاعب العلني من أجهزة الاستشعار أو تأثيرات أخرى غير محددة في المجمع. إيراد مباشرة أو إلحاق أضرار بأجهزة الاستشعار قد البيان كتغييرات شاذة في الأسفار في أما الطول الموجي الإثارة (488 أو 404 من شمال البحر الأبيض المتوسط). في الحالات حيث قد لوحظ أما استشعار لاستمرار الاستجابة غير لائق لإضافة أنها سامة عبر التعرض، فإنه يوصي بأن ينظر المحقق دراسة تجريبية المعلمات فيما يتعلق بقياس الجرعات الإشعاعية، الخلية السلامة والتعبير الاستشعار التشوهات البصرية/لوني الأجهزة المستخدمة لمراقبة الردود.
كما مع أي قراءات السمية، البيانات المكتسبة عادة أكثر يعتبر نهجاً آليا، وقيود تجريبية باستخدام مجدية عندما يتم بحث الاستجابات الملاحظة أو التحقق من صحتها. وتحقيقا لهذه الغاية، يمكن أن تستخدم العديد من المعلمات التجريبية جنبا إلى جنب مع الخصائص الملازمة لأجهزة الاستشعار لتوليد التقييمات الأكسدة قوية. وتتعلق التحقيقات الخاصة بالاستخدام أجهزة الاستشعار roGFP2 في نهاية المطاف التتابع الأكسدة والاختزال من خلال أي الحواس roGFP2 هالمدفع جريازيف (الشكل 1). ينطوي التتابع الإنزيمات داخل الخلايا، بما في ذلك جلوتاريدوكسين (جركس) والجلوتاثيون ريدكتيز (GR) الجلوتاثيون البيروكسيديز (GPx). يمكن أن تؤثر على القياسات من هالمدفع جريازيف الاختلافات في مستويات جركس الذاتية عبر المقصورات الخلوية وأنواع الخلايا وإجراء مقارنات بين التجارب الصعبة43. لمعالجة هذه المشكلة، تم توليفها بسلسلة من "الانصهار المسابر"، التي تربط الإنزيم ذات صلة مباشرة إلى جهاز استشعار roGFP2. وفي الآونة الأخيرة، ترتبط البشرية جركس-1 roGFP2 قبل جوتشير والزملاء32 بشكل Grx1-roGFP2. بالإضافة إلى وجود أكبر مجموعة ديناميكية من roGFP1 ودرجة الحموضة غير حساسة، يمكن رصد Grx1-roGFP2 هالمدفع جريازيف في أنواع الخلايا أو المقصورات في جركس الذي خلاف ذلك أن تقييد النشاط. الاختلافات في مستويات نادف عبر أنواع الخلايا أو حتى بين الخلايا في الطبق نفسه يمكن أن يسهم أيضا في التغير في الاستجابات roGFP2. نادف يتم إنتاجها من السكر من خلال المسار بنتوز فوسفات، ويمكن أن تستغل من قبل الجلوتاثيون ريدكتيز (GR) لتقليل جسج العودة إلى المدفع جريازيف (الشكل 1). بهم هالمدفع جريازيف التغييرات والردود roGFP2 الناتجة إلى حافز إذا كانت الخلايا في نفس الحقل تبدأ التجربة مع مختلف قدرات الحد، قد لا تكون موحدة. يمكن التغلب على هذه المشكلة خلال فترة المجاعة الجلوكوز قبل التجربة التي تستنزف مخزون نادف الخلوية ويوائم بين الاستجابات roGFP2. كما يتبين انخفاض قدرة على الانتعاش هالمدفع جريازيف 25 ميكرومتر حاء2يا2 الجرعة في الخلايا التي كانت تفتقر للسكر بالمقارنة مع الخلايا وتستكمل مع تركيزات الجلوكوز العادي (الشكلان 3 و 4). هكذا، يمكن التلاعب بمستويات نادف عن طريق التجويع الجلوكوز بمثابة وسيلة للتحقق من اشتراك العديد من المكونات التتابع في ترانسدوسينج الأثر من التعرض إكسينوبيوتيك لأجهزة الاستشعار. قلق آخر عند استخدام roGFP2 في سياق سمية هو احتمال إكسينوبيوتيك للتفاعل مباشرة في المؤكسدة الاستشعار، بدلاً من أن تعمل من خلال ترحيل الأكسدة والاختزال لتغيير هالمدفع جريازيف. يمكن تحديد أكسدة مباشرة من roGFP2 بسبر كل نقطة من مرحل الأكسدة وتقييم أثره على إشارة roGFP2. ويتجلى في الدراسة مثالاً على هذه التقنية باستخدام الأوزون كحافز جيبس-فلورنوي et al 35.
لإجراء التجارب مع استشعار2 2س ح، الشواغل المذكورة أعلاه لا كذات الصلة، كالمجال OxyR1 من فرط الحواس ح2س2 مباشرة وليس عن طريق تتابع الأكسدة والاختزال. لكن، خلافا roGFP2، ح2س2 استشعار حساسة للتغيرات في درجة الحموضة، الذي يمكن أن يسبب تغييرات في الأسفار لا تعزى إلى ح2س2 أثناء تجربة. ولهذا السبب، استخدام الوسائط مخزنة بشكل صحيح، دائرة البيئة للحفاظ على درجة الحرارة المرغوبة، واستخدام عناصر التحكم المركبة حيوية لأي تجربة استخدام أجهزة الاستشعار2 2س ح. بالإضافة إلى ذلك، وضعت أجهزة الاستشعار فلوروجينيك إلى على وجه التحديد مراقبة درجة الحموضة، مثل pHRed، التي تنبعث من الأسفار في القناة الحمراء ويمكن أن يكون المشترك المعرب عنها في الخلايا أيضا الإعراب عن فرط45. يتم مراقبة الرقم الهيدروجيني المثالي للاستشعار2 2س ح سيفير، الذي هو نسخة من أجهزة الاستشعار2 2س ح أن طفرة نقطة واحدة مما يجعله غير قادر على الإحساس ح2س2، ويحافظ على التجاوب مع الأس الهيدروجيني 46-وقد لوحظ أيضا أن الخلايا معربا عن ح2س2 استشعار تتطلب فترة أطول من خط أساس حجته، لا سيما بعد نقله من حاضنة للموقع للتحليل، حيث أنها تجربة تغييرات طفيفة في وسائل الإعلام درجة الحرارة ودرجة الحموضة. من المستحسن للحصول على البيانات على الأقل 5 نقاط بعد خط الأساس قد استقرت قبل بداية أي التعرض.
أجهزة الاستشعار وناقش في هذا الأسلوب، roGFP2 وفرط، وهما من العديد من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك التي تحتوي على مجموعة متنوعة من التطبيقات المستجدة في مجال علم السموم. وهذا يتضمن أجهزة استشعار مصممة للكشف عن هالمدفع جريازيف وح2س2، بل بيروكسينيتريتي47،48،أكسيد النيتريك49، وحتى الأوزون50. يمكن أن تستخدم في دراسات التصوير خلية يعيش بالتحديد هذه المجسات ورصد حساسية الأنواع الأكسدة للفائدة. مع التقدم في تقنيات مثل اتقانا الطيفية، من الممكن أيضا شارك الإعراب عن اثنين من أجهزة الاستشعار ذات الخصائص الطيفية مماثلة (داخل 5 نيوتن متر من بعضها البعض) في نفس الخلية، وفصل نسبة الأسفار المنبعثة من كل أجهزة الاستشعار51 . هذا الأسلوب من أهمية خاصة بالنسبة roGFP2 وفرط، كما أنها تنطوي على الجسيمات والانبعاثات عند أطوال موجية نفسه. كما ذكر بإيجاز هنا، يمكن استهداف بعض أجهزة الاستشعار للمقصورات داخل الخلايا المحددة، مثل الميتوكوندريا، لمراقبة أحداث الأكسدة للفائدة. بينما هذه المجسات والتقنيات الناشئة خارج نطاق هذا الأسلوب، ويحال القارئ إلى عدة منشورات الأخيرة حول هذا الموضوع من أجهزة الاستشعار الأكسدة داخل الخلايا، مثل الاستعراض ب الأجور والزملاء52. استخدام أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا مع تصوير خلية يعيش أداة قوية لرصد ردود الأكسدة أثناء تقييم السمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
البحث الموضحة في هذه المقالة قد تم استعراض "الوطنية للصحة" و "مختبر أبحاث التأثيرات البيئية"، و "وكالة حماية البيئة في الولايات المتحدة"، والموافقة على المنشور. محتويات هذه المادة ينبغي إلا يؤول إلى تمثل سياسة الوكالة، كما ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية يشكل إقرارا أو توصية للاستخدام.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر Katelyn لافريتش للمساعدة في تصميم التجارب وعمليات تحرير المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P.
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user's perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
