Summary
Dette manuskriptet beskriver bruk av genetisk kodet fluorogenic journalister i et program for live-celle imaging for undersøkelse av xenobiotic oval-indusert oksidativt stress. Denne eksperimentelle tilbyr enestående spatiotemporal oppløsning, sensitivitet og spesifisitet og unngå mange av svakhetene ved konvensjonelle metoder brukt for påvisning av toksikologiske oksidativt stress.
Abstract
Mens oksidativt stress er en ofte siterte toksikologiske mekanisme, lider konvensjonelle metoder til å studere den av en rekke svakheter, inkludert ødeleggelse av prøven, innføring av potensielle gjenstander og mangel på spesifisitet for den reaktive arter involvert. Dermed er det gjeldende behov innen toksikologi for ikke-destruktiv, følsom og bestemte metoder som kan brukes til å observere og kvantifisere intracellulær redoks forstyrrelser, oftere referert til som oksidativt stress. Her presenterer vi en metode for bruk av to genetisk kodet fluorogenic sensorer, roGFP2 og HyPer, skal brukes i live-celle tenkelig studier for å observere xenobiotic oval-indusert oksidativt svar. roGFP2 equilibrates med av glutation redoks potensielle (EGSH), mens HyPer direkte oppdager hydrogenperoksid (H2O2). Begge sensorer kan uttrykkes i ulike celletyper via transfection eller signaltransduksjon og kan rettes mot bestemte mobilnettet avdelinger. Viktigst, tilbyr live-celle mikroskopi basert på disse følerne høy romlig og tidsmessige oppløsning som ikke er mulig å bruke konvensjonelle metoder. Endringer i fluorescens intensiteten overvåket på 510 nm serverer som er avlesning for begge genetisk kodet fluorogenic sensorer når sekvensielt opphisset av 404 nm og 488 nm lys. Denne egenskapen gjør begge sensorer ratiometric, eliminere vanlige mikroskopi gjenstander og korrigerer for forskjeller i sensor uttrykk mellom celler. Denne metoden kan brukes på en rekke fluorometric plattformer kan spennende og samle utslipp foreskrevet bølgelengdene, godt egnet for bruk med AC confocal imaging-systemer, konvensjonelle wide-field mikroskopi og plate lesere. Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer har blitt brukt i en rekke celletyper og toksikologiske studier overvåke mobilnettet EGSH og H2O2 generasjon i sanntid. Skissert her er en standardisert metode som mye tilpasses over celletyper og fluorometric plattformer for anvendelse av roGFP2 og HyPer i live-celle toksikologiske vurderinger av oksidativt stress.
Introduction
Begrepet "oksidativt stress" er ofte sitert som en mekanisme i toksikologi, men er sjelden dette begrepet beskrives spesifikt. Oksidativt stress kan referere til flere intracellulær prosesser, inkludert generering av reaktive oksygen arter, skader forårsaket av frie radikaler, oksidasjon av antioksidant molekyler, og selv aktivering av spesifikke signalering kaskader. Et bredt spekter av miljøgifter1,2 og farmasøytisk agenter3,4 er dokumentert for å indusere oksidativt stress av enten direkte aksjon av den xenobiotic oval sammensatt seg5 ,6 eller sekundært ved produksjon av oksiderende arter som del av en cellulær respons7,8,9,10. Derfor er av stor interesse i toksikologi nøyaktig observere og karakterisere oksidativt prosessene fører til uønskede resultater. Konvensjonelle metoder for måling oksidativt stress involverer identifisering av oksidert biomolecules,11,,12,,13,,14,,15 eller antioksidanter16 ,17,18,19,20eller direkte måling av reaktive arter seg21,22,23, 24. Disse metodene krever imidlertid vanligvis mobilnettet avbrudd, som ofte bruker eksemplet fjerner romlig oppløsning og potensielt introduserer gjenstander25. Utvikling av mer følsom og spesifikke metoder for påvisning av oksiderende arter og markører for oksidativt stress er bredt aktuelt å undersøke bivirkninger av xenobiotic oval eksponering.
Live-celle mikroskopi ved hjelp av en ny generasjon av genetisk kodet fluorogenic sensorer har dukket opp som et kraftig verktøy for å overvåke statusen intracellulær redoks for levende celler. Disse sensorene angis vanligvis ved hjelp av en vektor under kontroll av en viral selskapet som føres via transfection eller signaltransduksjon metoder. Høy uttrykk effektivitet er ikke nødvendig siden celler uttrykke fluorescerende sensoren kan lett identifiseres visuelt. For toksikologiske vurderinger, kan celler som uttrykker disse sensorene observeres med fluorescens mikroskopi som de er utsatt for xenobiotic oval forbindelser i sanntid. Denne eksperimentell design tillater gjentatte målinger i samme celle, slik at hver celle etablerte baseline som sin egen kontroll. Den timelige høyoppløselig som gis av live-celle tenkelig er velegnet for påvisning av oksidativt hendelser, særlig de som er beskjedne i størrelse eller lagringsflyktig i naturen. I tillegg til å være både sensitive og bestemte å deres målmolekyler, kan fluorescens av noen av disse sensorene begeistret med to bølgelengder av lys. Dette fenomenet lar fluorescerende utslipp uttrykkes som et forhold, som tillater dømmekraft signal endringer forbundet med autentisk sensor svar fra de som forårsakes av gjenstander som variasjoner i sensor uttrykk, celle tykkelse, lampe intensitet, photobleaching og følsomhet fluorescens detektor26. En annen fordel av fluorogenic sensorer er at de kan være målrettet mot bestemte mobilnettet avdelinger, skape et nivå av romlig oppløsning som er uovertruffen av konvensjonelle metoder25,26,27.
Familien genetisk kodet sensor basert på grønne fluorescerende protein (GFP) har blitt utviklet og preget rapport om en rekke fysiologiske markører, inkludert pH, temperatur, kalsium konsentrasjon og ATP/ADP forholdet25 ,28,29,30,31. Inkludert blant disse er sensorer glutation redoks potensielle (EGSH) og hydrogenperoksid (H2O2). Mens disse sensorer ble utviklet for programmer i redoks biologi og fysiologi, har de også blitt tilpasset for å studere xenobiotic oval-indusert oksidativt stress. Spesielt beskriver protokollen skissert her bruken av EGSH sensoren roGFP2 og H2O2 sensoren HyPer.
roGFP2 rapporter om redoks potensialet i intracellulær redusert og oksidert glutathione (GSH/GSSG) gjennom en redoks stafett med glutation peroxidase (GPx), glutaredoxin (Grx) og glutation reduktase (GR) (figur 1)25, 32 , 33. glutation er den dominerende mobilnettet antioksidant molekylet og finnes hovedsakelig i formen (GSH) i millimolar konsentrasjoner i stoffer25,34. Mens EGSH ikke er koblet til noen funksjonell resultat, er det anerkjent som en viktig indikator for intracellulær oksidativt status34. En relativt liten økning i konsentrasjonen av GSSG resulterer i en økning i EGSH som oppdages av roGFP2. Like viktig, overvåking av EGSH bruker roGFP2 i xenobiotic oval eksponeringer kan potensielt avsløre mye om virkningsmekanismen på flere punkter i redoks stafetten og tilknyttede pathways, som pentose fosfat overføre (figur 1 )35. Andre sensoren diskutert her, HyPer, er en intracellulær H2O2 sonde avledet fra innsetting av gule fluorescerende protein (YFP) regulatoriske domenet av bakteriell H2O2-sensitive transkripsjon faktor OxyR136. Selv om det har tidligere vært ansett en ødeleggende reaktive oksygen mellomliggende, er H2O2 stadig mer anerkjent som en viktig intracellulær signalnettverk molekyl under fysiologiske forhold37, 38, antyder at ukjent roller for H2O2 finnes i toksikologi også. For eksempel kan overflødig H2O2 indusert av en xenobiotic oval eksponering være en forløper til feilregulering cellular signal eller en endring i bioenergi.
Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer har vært uttrykt i flere etablerte cellelinjer, inkludert menneskelige epidermoid karsinom celle linjen A431 og human bronkial epithelial celle linje BEAS-2B, å observere endringer i EGSH og H2 O2 svar til en rekke toksikologiske eksponeringer. Disse omfatter gass forurensning (ozon35), løselig komponenter av svevestøv (1,2 naphthoquinone39,40 og sink41) og nikkel nanopartikler (upubliserte data). Disse studiene representerer bare en undergruppe av de mulige anvendelser av disse to sensorer. En celle type som kan motta og uttrykke DNA av disse sensorene gjennom konvensjonelle molekylærbiologi teknikker kan teoretisk brukes til å vurdere effekten av xenobiotics mistanke om å endre mobilnettet oksidativt tilstanden. Hittil har har én eller flere av disse sensorer vært uttrykk i ulike prokaryoter og eukaryoter, inkludert flere pattedyr, anlegg, bakteriell og gjær celle typer25,26,36,42. Avlesning for både EGSH og H2O2 er en endring i intensiteten av fluorescens slippes ut på 510 nm på eksitasjon med 488 og 404 nm lys. Denne metoden er vidt anvendelig over fluorometric plattformer, inkludert ulike typer mikroskopi (AC confocal og wide-feltet) og plate lesere. Metoden presenteres her kan følsom og bestemt observasjon av intracellulær EGSH og H2O2 i i vitro toksikologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av celler
Merk: Denne fremgangsmåten beskriver den lentiviral signaltransduksjon en udødeliggjort cellen linje (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) å uttrykke ønsket reporteren (roGFP2 eller HyPer). Andre celletyper linjer og/eller metoder for genoverføring, inkludert transfection, kan benyttes så lenge de resulterer i en grad av reporteren uttrykk til å visualisere et tilstrekkelig antall sensor-uttrykke celler per synsfelt (vanligvis 5-10 celler). Hvis bruker transfection metoder, prosedyren skal utføres i fatet som til slutt vil bli brukt til metoden for analyse (f.eks transfect cellene i den samme retten som vil bli presentert for mikroskopet). Fremgangsmåten beskrevet nedenfor inneholder detaljer for å forberede celle transductions utføres i en 6-vel celle kultur plate. Hvis dette formatet ikke er en passende størrelse for ønsket program, kan andre skip erstattes.
- Vokse celler til ca 40-60% samløpet i normal vekst medier.
Merk: Denne studien utnyttet human bronkial epithelial celle linjen, BEAS-2B, vokst i keratinocyte vekst medium (KGM). - Like før transduction, Erstatt vekst media på cellene med 500 µL av serum-frie medier som inneholder riktig mengde virus, utregnet med formelen:
- For signaltransduksjon BEAS-2B celler, kan du bruke serum-free keratinocyte basale medium (KBM) for å erstatte KGM vekst media under viral incubations.
Merk: Beregningen ovenfor er for en enkelt Albin på én brønn av celler i et 6-vel format. Eventuelt utføre transductions av flere brønner kan utføres ved å justere formelen med en multiplikasjon av antall brønner å være transduced. Lentiviral transductions, bruke et mangfold av infeksjon (MOI) mellom 5 og 20. Adenoviral transductions, bruke en MOI mellom 100 og 500.
- For signaltransduksjon BEAS-2B celler, kan du bruke serum-free keratinocyte basale medium (KBM) for å erstatte KGM vekst media under viral incubations.
- Inkuber celler med viral blanding på 37 ° C 4 h, omfordele virus partikler i parabolen hver 30 til 60 minutter med en kort rock eller virvlende bevegelse.
- Legg 1 mL av komplett vekst medier til retten og ruge på 37 ° C for en ekstra 4-16 h.
- Fjern alle medier og erstatte med fersk komplett vekst medier.
- Fortsette å vokse og passasje celler, utvides etter behov.
Merk: Celler skal begynne merkbart uttrykke sensoren innen 12-48 timer. Hvis en lentiviral vektor ble brukt for signaltransduksjon, fortsatt stabil uttrykk for ønsket sensoren over passasjer. - Mikroskopi-baserte vurderinger, frø celler i glass bottomed mikroskop retter og vokse til ønsket samløpet (≥70 - 80%) før bildebehandling.
Merk: Seeding tetthet vil avhenge av størrelsen på fatet og veksten av celle-linjen som brukes av vurderingen etter seeding. For eksempel frø 300.000 BEAS-2B celler i en 35 mm rett til ca 70-80% samløpet etter 1 dag med vekst.
2. mikroskopi oppsett
Merk: Protokollen beskrevet nedenfor utføres med AC confocal mikroskop utstyrt med laser linjer på 404 og 488 nm. Andre måter å fluorometric vurderinger av sensorer som er beskrevet i denne protokollen på foreskrevet excitations/utslipp bør også gi levedyktig data. Viktigere, kan utstyr innstillinger variere avhengig av type, alder og tilstanden til instrumentet brukes; dermed kanskje instrument verdier nevnt ikke gjelder for utstyret brukes i andre laboratorier.
- Utføre all tenkelig analyse bruker miljøkontroller for å opprettholde en passende temperatur (f.eks 37 ° C), fuktighet (vanligvis > 95% relativ fuktighet), og/eller gass konsentrasjon (f.eks, 5% CO2) egnet for cellene i den varigheten av forsøket.
- Hvis bruker høye verdier av relativ fuktighet, holde alle overflater som kan komme i kontakt med fuktet atmosfæren (f.eks., mikroskop målet) på eller over temperaturen som genereres fuktighet for å hindre kondensering. Dette kan gjøres med bruk av en objektiv varmtvannsberedere og/eller tape og en passende varmeapparatet kontroll.
- Aktivere alle mikroskop komponentene og konfigurere alle utstyr som kreves for sammenhengende excitation på 488 og 404 nm med utslipp på 510 nm. Kontroller alle komponenter av optisk konfigurasjonen er satt riktig for sanntids oppkjøpet.
- Definere en scene-top miljømessige kammer å opprettholde konstant temperatur på 37 ° C, 5% CO2 atmosfære, og > 95% fuktighet. Før du starter bildeopptak, equilibrate miljø kammeret i minst 10 min etter første innstillingen av alle miljøkontroller.
Merk: Miljøforhold kan bli eliminert eller justeres avhengig av eksperimentets lengde, celle type og eksponering brukes. - Plass rett celler (trinn 1.7) på scenen-toppen innenfor miljømessige kammeret.
- Den ønskede linsen, finne fokalplanet celler ved hjelp av okularet og hvitt lys og sikre normal morfologi.
Merk: En 1.4 NA 60 X fiolett-korrigert, omgitt av olje linsen er vanlig, som tillater identifikasjon intracellulær rom samtidig maksimere den optiske oppløsningen av AC confocal systemet. - Sjekk fluorescens uttrykk for cellene i synsfeltet. Gjøre det mens du visualisere cellene under wide-field fluorescens belysning med en aktuelle filteret sett, for eksempel fluorescein isothiocyanate (FITC). På dette punktet bruker wide-field belysning mens ser gjennom i okularet er enklere fordi det er enklere å flytte rett til å velge et felt av celler å studere. Generelt, velge en synsfelt som inneholder minst 5 til 10 celler som uttrykker sensoren, som indikert av grønne fluorescens.
- Du kan også utføre denne vurderingen confocally bruker laser eksitasjon på en bølgelengde som er mest kompatibel med sensoren blir uttrykt (488 nm vanligvis fungerer best).
Merk: På grunn av deres iboende fluorescerende egenskaper, det blir vanskeligere å visualisere celler uttrykke HyPer enn de uttrykke roGFP2 bruker enten FITC eller 488 nm. Det bør imidlertid fortsatt være mulig å se svak celler.
- Du kan også utføre denne vurderingen confocally bruker laser eksitasjon på en bølgelengde som er mest kompatibel med sensoren blir uttrykt (488 nm vanligvis fungerer best).
- Når det finnes en ønsket synsfelt, Lukk miljømessige kammeret.
Merk: Bruke fokus-opprettholde funksjonen, ofte tilgjengelig på Avansert mikroskop stands, for å forenkle vedlikehold av en stabil fokalplanet gjennom hele studiet. - Definer oppkjøpet parametere for å sikre optimal vurdering av sensoren rundt over ønsket eksponeringen perioden. Nedenfor finner du anbefalinger og tilnærminger for AC confocal imaging sensor svar:
- Justere laser makt for eksitasjon på 488 nm og utslipp på 510 nm. Velg en laser nivå der visualisering av cellene, og holde dette konstant mellom prøver eller Repliker retter.
Merk: For denne studien, 12% og 1,5% laser makt ble brukt for 488 og 404 nm laser linjene, henholdsvis. - Bruk AC confocal kontrollene av oppkjøpet programvaren slik at valgte fokalplanet er optimalisert for maksimal fluorescens utslippsintensitet i midten av cellene (z-akse) ved å skanne på 488 nm mens du justerer z-flyet. Dette gjøres enklere ved å bruke en høy gain innstillingen etter z-flyet som gir mest over-eksponert cellene. Når riktig fokalplanet er funnet, tilbake gevinsten til en innstilling som er mest optimale til fluorescens av reporteren uten oversaturating bildepunktene å bli observert.
Merk: Laser og få innstillingene som passer for å finne og observere celler under eksperimentering er helt avhengig AC confocal systemet utnyttet. Generelt, når cellene har blitt funnet i synsfelt, det anbefales at en minimal mengde laser makt brukes (vanligvis ≤20%), overdreven skanning av celler ved hjelp av kraftige laserlys kan indusere oksidativt endringer oppdages av sensoren. - Bruke gevinsten til å finjustere den planlagte fluorescensen. Med roGFP2, etablere grunnlinjen nær den øvre grensen (≈ 90% relativ intensitet) på apparatet uten over metning, som disse cellene mister 510 nm fluorescens indusert av 488 nm eksitasjon når EGSH øker. Derimot fluorescens intensiteten med 488 nm eksitasjon skal være lav (≈ 10% relativ intensitet) ved baseline for HyPer uttrykke celler, som disse cellene vil få 510 nm fluorescens intensiteten når H2O2 oppdages.
- Gjenta trinn 2.9.2 og 2.9.3 eksitasjon på 404 nm og utslipp på 510 nm. Få innstillingene for 404 nm eksitasjon bølgelengden er motsatt av de som brukes med 488 nm eksitasjon for hver sensor (dvs. lav baseline fluorescens (≈ 10% relativ intensitet) på 404 nm for roGFP2, høy planlagte fluorescens (≈ 90% relativ intensitet) for H2 O2 sensor).
Merk: vanligvis fluorescens (510 utslipp) på 404 nm eksitasjon vil bli vesentlig lavere enn at oppnåelig med 488 nm eksitasjon i celler uttrykke både roGFP2 og HyPer, som 404 nm toppen er en relativt mindre eksitasjon maksimum for begge disse sensorer.
- Justere laser makt for eksitasjon på 488 nm og utslipp på 510 nm. Velg en laser nivå der visualisering av cellene, og holde dette konstant mellom prøver eller Repliker retter.
3. datainnsamling
- Definere oppkjøpet programvaren å opphisse sekvensielt to eksitasjon bølgelengdene (første 488 nm og deretter 404 nm) og samle utslipp både på 510 nm på et forhåndsbestemt tidsintervall i ønsket lengde av eksperimentet (f.eks fange bilder hvert 60 s for 60 min).
- Eventuelt hente bilder manuelt før og etter eksponeringer hvis omtrentlige tidspunktet for endringer i EGSH eller H2O2 er kjent for den xenobiotic oval testes. Dette kan imidlertid føre til tap av midlertidig løsning.
- For sanntids vurdering av eksperimentell parametere, Velg minst 5-10 sensor-uttrykke celler i feltet og etablere seg som regioner av interesse ("ROIs") å overvåke fluorescens endringer under eksperimentet.
Merk: Dette trinnet er valgfritt, og kan utføres etter eksperimentet hvis direkte observasjon i sanntid er uønsket eller programvarebegrensninger hindre kontinuerlig overvåking. Avhengig av celle befolkningen, valg av sensoren uttrykke celler som ROIs representere en rekke uttrykk nivåer i celler.- For disse studiene, Legg til miljømessige toxicant 9,10-phenanthrenequinone (9,10-PQ) eller hydrogenperoksid (H2O2) etter en 5-min opprinnelige periode.
- Forberede reagenser for senere bruk i denne protokollen. Oppløse 9,10-PQ i dimethyl sulfoxide (DMSO) til en konsentrasjon av 15 mM og fortynne i basal cellen media å gi en 250 µM fungerende løsning. I tillegg klargjør en fungerende løsning av Hydrogenperoksid i vann som vil gi en endelig konsentrasjon av 1mM ved injeksjon.
- Når de eksperimentelle parameterne er definert, begynne kurset engangskjøp. Opprette en planlagt periode av minst 5 min (eller 5 datapunkt) før du starter xenobiotic oval eksponeringer.
- Utsette cellene til toxicant etterforsket bruke konvensjonelle metoder for i vitro dosering. Forberede løselig forbindelser i vann eller andre passende løsemiddel og injisere direkte i media.
- Hvis organiske løsemidler (f.eks dimethyl sulfoxide eller etanol), holde den endelige løsemiddel konsentrasjonen på eller under 0,1%. Kontroller at løsemiddelet ikke produserer en effekt på EGSH eller H2O2 produksjon med et kjøretøy kontroll i en separat rett av celler.
- Forbindelser med lavere løselighet, legge en blanding trinn med brønnene til protokollen etter injeksjon. Pumpe gass eksponeringer direkte inn i miljømessige kammeret bruker riktig carrier gass blandingen.
- Overvåke endringer i fluorescens under eksponeringen perioden. Utføre senere injeksjoner etter behov. Ta stor forsiktighet for ikke å skifte rett under injeksjoner, slik at de samme cellene blir fulgt gjennom hele tiden mens avbildet i samme fokalplanet.
- På slutten av eksperimentet, utsette cellene til riktige kontroller. For begge genetisk kodet fluorogenic sensorer, legge bestemt konsentrasjoner av forbindelser kjent oksidering og redusere disse sensorer i en spiss demonstrasjon av deres ratiometric respons. H2O2 og dithiothreitol (DTT) tjene som aktuelle kontroller oksidering og redusere både sensorer. Vanligvis kan en siste konsentrasjon av 100-1000 µM H2O2, etterfulgt av 1-5 mM dithiothreitol (DTT), brukeren fullt oksidere og redusere disse sensorer.
- For disse studiene, bruk 1 mM H2O2 etterfulgt av 5 mM DTT for å bestemme maksimal sensor svaret.
- Vent minst 5 minutter slik at sensoren til å svare, og deretter injisere et reduksjonsmiddel, som DTT, å redusere senor og returnere det til et nivå av fluorescens på eller nær grunnlinjen etablerte.
Merk: Bruk av kontroller i dette trinnet er avgjørende for normalisering, og skal utføres på slutten av hvert eksperiment for å finne ut det dynamiske spekteret av sensor i hver celle. For roGFP2, kan aldrithiol også legges på slutten av eksperimentet. Aldrithiol går utenom roGFP2 redoks relé å oksidere sensoren direkte. Dette er nyttig å vurdere sensor funksjon etter xenobiotic oval eksponering.
4. dataanalyse
- Hvis ikke allerede etablert, trekke ROIs rundt cellene som skal analyseres. Bruke riktig programvare for å måle fluorescens intensiteten av hver avkastning på hver bølgelengde gjennom tiden. Kontroller at cellene ikke flytte eller platen ikke skifte under kjøringen.
Merk: Etablering av ROIs gjøres enkelt ved å tegne et lukket område som følger fluorescerende uttrykksmønster av hver celle. Ytterligere hjelp med denne prosessen, kan en overført lys (eller brightfield) bilde av cellene i etablerte synsfelt overlappes på fluorescerende bildet i arbeidet med å definere cellekantlinjene. Men krever bruk av en overført lys bilde brukeren å fange en ekstra kanal (sett av bilder) i løpet av eksperimentet. Alternativt innlemme visse produsenter algoritmer i deres bildebehandlingsprogramvare som bruker bestemte parametere som intensitet terskler for å etablere ROIs i en mer kvantitativ, mindre subjektive, metode. - Eksportere dataene til ønsket analyseprogramvare (f.eks elektronisk regneark).
- Beregne ratiometric sensor svaret for hver avkastning på hvert punkt ved hjelp av formler:
- For hvert punkt, gjennomsnittlig beregnet ratiometric verdiene for alle ROIs.
- Beregne verdien for planlagt, som brukes til å normalisere dataene, ved å beregne de tidligere beregnede ratiometric verdiene (trinn 4.4) samlet før tillegg av den xenobiotic oval (f.eks de første fem-tiden-poengene).
- Normalisere ratiometric verdiene fra trinn 4.4 ved å dele hver verdi av planlagte verdien beregnet i 4.5. Normalisert ratio vil sentrum rundt en verdi på 1 til planlagte, mens økninger i EGSH eller H2O2 følgende injeksjoner vil føre forholdet å øke. Vurderinger av xenobiotic oval som skape oksidativt pleier å gi verdiene i et område av 3 - 6 ganger den opprinnelige verdien.
- Til hjelp i å sammenligne svar innen og over eksperimenter, uttrykke normalisert dataene som en prosentdel av maksimal sensor svar ved å definere svaret kontroll oksiderende (f.eks 1 mM H2O2) som 100%.
Merk: Hvis uttrykke data som en prosentdel av maksimal sensor svar, er det viktig å sikre at den samme konsentrasjonen av oksiderende kontroll brukes konsekvent over eksperimenter. Alle data fra en live-celle tenkelig analyse er mottakelig for konvensjonelle pair-wise og group-wise statistisk analyse velges av etterforskeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruk av roGFP2 og HyPer oppdage endringer i EGSH og intracellulær H2O2 er godt beskrevet tidligere25,36,42,43 , og er vist her. AC confocal bilder av celler som uttrykker roGFP2 på grunnlinjen og følgende tillegg av H2O2 og DTT vises i figur 2. Data fra bilder samlet gjennom eksperimentet ble deretter eksporteres og analysert som beskrevet i del 4 av protokollen. Som vist, produserer tillegg av eksogene H2O2 som en positiv reproduserbar svar når dataene er normalisert til deres respektive baseline og et definert dynamisk område er etablert gjennom tillegg av kjente eksogene oksidanter/reductants (dvs. H2O2 og DTT) (tall 3, 4 og 5).
Svar på toksikologiske stimuli er vanligvis flere variabler enn de av kontroller. Dette er å forvente, som xenobiotic oval forbindelser kan ha pleiotropic effekter på celler, fra redoks sykling til Adduktion intracellulær proteiner. Eksempler på roGFP2 og HyPer svar forårsaket av eksponering for toxicant 9,10-PQ, en oksiderende luftforurensning dannet av atmosfæriske reaksjoner på phenanthrene44, presenteres i tall 6 og 7. Diagrammene i disse tallene viser utviklingen av hvert trinn i dataanalyse i avsnitt 4 protokollen. Som vist, reduserer normalisering av hver celle til sin egen grunnlinjen og positiv kontroll (figur 6B) intercellulære variasjon i omfanget av sensoren svaret fra rådataene (figur 6en). I tilfeller der avviket i cellulær respons er rundt kan normalisering av dataene utføres hittil, med enkeltceller representert i egne linjer i diagrammet. Variasjoner i omfanget eller kinetics av svarene blant celler i den samme retten kan avsløre viktig mekanistisk innsikt som gjenspeiler forskjeller i cellen syklus, for eksempel. Gjennomsnitt svaret cellene i retten kan også presenteres sammen med standardavviket (figur 6C). Ellers hvis av separate forsøk blir presentert, kan dataene presenteres som intensitetsverdiene normalisert relative fluorescens eller en prosentandel av maksimal svaret av kontroll oksiderende (tall 3, 4, 5 og 6 D), viser gjennomsnittet av alle replikater ledsaget av standard feil av gjsnitt. Luft miljøgifter 9,10-PQ er kjent for å være en potent redoks cycler, som vi hypothesize er ansvarlig for de sykliske toppene av Hydrogenperoksid produksjon oppdaget av HyPer (figur 7) og øker trinnvis EGSH oppdaget av roGFP2 ( Figur 6 D).
Figur 1 . RoGFP2 glutation redoks relé. Glutation peroxidases (GPx) oksidere redusert glutathione (GSH) til GSSG som svar til hydrogen peroxide (H2O2), dermed øke av glutation redoks potensielle (EGSH). Fluorogenic sensor roGFP2 equilibrates med intracellulære EGSH når oksidert av glutaredoxin (Grx). I reductive veien gir Grx reduksjon av roGFP2 gjennom deglutathionylation GSSG nivåer reduseres og normale nivåer av GSH er gjenopprettet av glutation reduktase (GR) på bekostning av NADPH. NADPH er levert av glukose gjennom pentose fosfat sti (PPP). Tilpasset Gibbs-Flournoy et al35. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . AC confocal mikroskopi bilder av menneskelige bronkial epithelial cellen linje BEAS-2B uttrykke cytosolic roGFP2. Cellene ble opplyst på 488 nm (AD), etterfulgt av 404 nm (Eh). Bildene viser fluorescens slippes ut på 510 nm for følgende: baseline (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)og 5 mM DTT (D, H). 60 X Plan Apo VC mål. Skala stolper representerer 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Dosen avhengige endringer i roGFP2 av H2O2 i BEAS-2B celler. Cellene ble equilibrated i 30 min i fenol-rød gratis keratinocyte basale media (KBM) før eksponeringer. Alle tillegg av H2O2 skjedde etter en opprinnelig plan 5 min. roGFP2 fluorescens slippes ut på 510 nm ble samlet inn med et 525/30 nm band pass filter etter laser eksitasjon på 404 og 488 nm. Mobilnettet svar var normalisert til deres respektive grunnlinjen og maksimal sensor svar etter tillegg av 1 mM H2O2. Verdier presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeil, n = 3, der n består av gjennomsnittlig 5-10 uavhengige celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Response av glukose sultet BEAS-2B celler uttrykke roGFP2 for ulike doser av H2O2. Cellene ble equilibrated i 2 timer i en minimal salt medium som ikke inneholder glukose før eksponeringer. Alle tillegg av H2O2 skjedde etter en opprinnelig plan 5 min. roGFP2 fluorescens slippes ut på 510 nm ble samlet inn med et 525/30 nm band pass filter etter laser eksitasjon på 404 og 488 nm. Mobilnettet svar var normalisert til deres respektive grunnlinjen og maksimal sensor svar etter tillegg av 1 mM H2O2. Verdier presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeilen, n = 3, der n består av gjennomsnittlig 5-10 forskjellige celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Response av BEAS-2B celler uttrykke HyPer til ulike doser av H 2 O 2 . Cellene ble equilibrated i 30 min i fenol-rød gratis KBM før eksponeringer. Alle tillegg av H2O2 skjedde etter en opprinnelig plan 5 min. fluorescens slippes ut på 510 nm ble samlet inn med et 525/30 nm band pass filter etter laser eksitasjon på 404 og 488 nm. Mobilnettet svar var normalisert til deres respektive grunnlinjen og maksimal sensor svar etter tillegg av 1 mM H2O2. Verdier presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeilen, n = 3, der n består av gjennomsnittlig 5-10 forskjellige celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. 9,10-PQ-indusert svar BEAS-2B celler uttrykke roGFP2. Cellene ble equilibrated i 30 min i fenol-rød gratis KBM før eksponering. Tillegg av 25 µM 9,10-PQ med blande skjedde på 5 min, etterfulgt av tillegg av 1 mM H2O2 på 20 min og 5 mM DTT på 24 min. panelet A viser rå roGFP2 forholdet mellom enkeltceller i fatet, hver celle representert av en egen linje. Panelet B viser normalisering av verdier fra hver celle til sin opprinnelige sensor fluorescens og gjennomsnittet og standardavviket for disse dataene er oppå de personlige normalisert prosenter i C-panelet. Prosenten for maksimal sensor svar gjennomsnitt over alle cellene er avbildet i D-panelet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . 9,10-PQ-indusert svar BEAS-2B celler uttrykke HyPer. Cellene ble equilibrated i 30 min i fenol-rød gratis KBM før eksponering. Tillegg av 25 µM 9,10-PQ med blande skjedde på 5 min, etterfulgt av tillegg av 1 mM H2O2 på 20 min og 5 mM DTT på 25 min. fluorescens slippes ut på 510 nm ble samlet inn med et 525/30 nm band pass filter etter laser eksitasjon på 404 og 488 nm. Mobilnettet svar var normalisert til deres respektive grunnlinjen og maksimal sensor svar etter tillegg av 1 mM H2O2. Verdier presenteres som gjennomsnittet av 5-10 forskjellige celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av roGFP2 og HyPer oppdage endringer i intracellulær EGSH og H2O2henholdsvis har blitt godt beskrevet i forrige fysiologiske og toksikologiske studier 25,35,36 ,,39,,40,,41,,42,,43. Protokollen skissert her rapporterer en effektiv måte å implementere disse genetisk kodet redoks sensorer i spisse toksikologiske studier designet for å vurdere xenobiotic oval-indusert forstyrrelser intracellulær redoks homeostasis. Viktigst, linker riktig bruk av disse sensorene endringer observert en bestemt redoks par eller ROS (EGSH eller H2O2), til slutt avklare mangel på spesifisitet med mange konvensjonelle oksidativt stress tilnærminger. I sikre kvaliteten på dataene som genereres fra disse sensorer, noen aspekter må tas i betraktning når designe eksperimenter og analysere/tolke data. De inkluderer: 1) bruk av riktig kontroller, 2) verifikasjon av aktuelle sensor svar og 3) manipulering av eksperimentelle parametere for å belyse mekanismer. Av disse serverer tillegg av eksogene H2O2 og DTT som kontroller på slutten av observasjon perioden flere formål. Først, det gir en mulighet til å vurdere omfanget av giftige eksponering i forhold til maksimal og minimal signalene oppnåelig svaret fra sensoren. Dette er mest nyttig i å normalisere svar for sammenligninger mellom eksperimenter. I tillegg kan slutt eksperimentet med sterk eksogene oksiderende og reductive stimuli evaluere effekten av foregående eksponering på sensor/relé integritet. Videre kan aldrithiol legges på slutten av å omkjøringsvei stafetten og teste funksjonaliteten til sensoren for skader at eksponering kan ha påført å fluorophore seg selv.
Akkurat som med andre teknikker, når du bruker denne metoden for den bestemte undersøkelsen av toksikologiske resultater, er det viktig å gjøre kvalitative vurderinger om nøyaktigheten av observasjonene gjort. Når utnytte roGFP2 eller HyPer med noen nye xenobiotic oval er det viktig å først teste en rekke doser, samtidig som fluorescens intensiteten (510 nm utslipp) fra hver eksitasjon bølgelengde (404 nm og 488 nm) endres riktig (i.e. økning eller redusere) for redoks senor brukes. Målet er å identifisere en dose som sensoren svar er synlig, men er ikke overveldet av utilslørt manipulering av sensoren eller andre ikke-spesifikke effekter av sammensatt. Direkte Adduktion eller skade til sensoren kan manifestere seg som atypisk endringer i fluorescens på enten eksitasjon bølgelengde (488 eller 404 nm). I situasjoner der enten sensoren har blitt observert å konsekvent svare feilaktig til tillegg av en toxicant over eksponeringer, anbefales det at etterforskeren vurdere undersøke eksperimentelle parametere i forhold til dosimetry, celle levedyktighet, sensor uttrykk eller optisk/kromatisk avvik det instrumentelle brukes til å observere reaksjonene.
Som med alle toksikologiske avlesning, data ervervet er vanligvis mer meningsfull når observert svarene er undersøkt eller godkjent bruker en mekanistisk tilnærming og eksperimentelle begrensninger er vurdert. Dette kan flere eksperimentelle parametere kombinert med iboende egenskaper for sensoren benyttes for å generere robust redoks vurderinger. Undersøkelser som er spesifikke for bruk av roGFP2 sensoren bekymring til slutt redoks relé gjennom hvilke roGFP2 sanser EGSH (figur 1). Stafetten innebærer intracellulær enzymer, inkludert glutaredoxin (Grx), glutation reduktase (GR) og glutation peroxidase (GPx). Endogene grad av Grx over både mobilnettet rom og celletyper kan påvirke målinger av EGSH og foreta sammenligninger mellom eksperimenter vanskelig43. For å løse dette problemet, en rekke "fusion sonder" har blitt syntetisert, som kobler relevante enzymet direkte til roGFP2 sensoren. Mest nylig ble menneskelige Grx-1 knyttet til roGFP2 av Gutscher og kolleger32 skjemaet Grx1-roGFP2. I tillegg til å ha et større dynamisk område enn roGFP1 og være pH ufølsom, kan Grx1-roGFP2 overvåke EGSH i celletyper eller rom i hvilke Grx aktivitet ville ellers være begrense. Forskjeller i NADPH nivåer over celletyper eller selv blant celler i den samme retten kan også bidra til variasjon i roGFP2 svar. NADPH er produsert av glukose gjennom pentose-fosfat sti, og kan benyttes av glutation reduktase (GR) for å redusere GSSG tilbake til GSH (figur 1). Hvis celler i det samme feltet begynner eksperimentet med forskjellige redusert kapasitet, kanskje deres EGSH endringer og resulterende roGFP2 svar på en stimulans ikke uniform. Dette problemet kan overvinnes gjennom en periode med glukose sult før eksperimentet, som reduserer mobilnettet NADPH aksjer og harmoniserer roGFP2 svar. Redusert kapasitet EGSH utvinning kan også sees i 25 µM H2O2 dose i celler som var utsultet av glukose i forhold til celler med normal glukose konsentrasjoner (tall 3 og 4). Thusly, kan manipulering av NADPH gjennom glukose sult tjene som et middel til å kontrollere involvering av flere relé komponenter i transducing effekten av en xenobiotic oval eksponering til sensoren. En annen bekymring når du bruker roGFP2 i en toksikologisk sammenheng er potensialet for xenobiotic oval samhandle direkte i oksiderende sensoren, i stedet for konstituert gjennom redoks stafetten endre EGSH. Direkte oksidasjon av roGFP2 kan bestemmes ved å utspørre hvert punkt av redoks relé og vurdere sin effekt på roGFP2 signalet. Et eksempel på denne teknikken med ozon som en stimulans er demonstrert i studiet av Gibbs-Flournoy et al 35.
For eksperimenter med H2O2 sensor er over bekymringer ikke så relevant som OxyR1 domenet HyPer sanser H2O2 direkte i stedet for gjennom en redoks stafett. Men i motsetning til roGFP2 er H2O2 -sensor følsomme for endringer i pH, som kan forårsake endringer i fluorescens ikke kan tilskrives H2O2 under et eksperiment. Derfor bruk av riktig bufret media, en miljømessig kammer å opprettholde ønsket temperatur, og bruken av kjøretøy kontroller er avgjørende for noen forsøk utnytte H2O2 sensoren. I tillegg er fluorogenic sensorer utviklet til å spesielt overvåke pH, som pHRed, som avgir fluorescens i den røde kanalen og kan være co uttrykt i celler som uttrykker også HyPer45. Ideell pH kontrollen for H2O2 sensoren er SypHer, som er en versjon av H2O2 sensoren har en enkelt punkt mutasjon gjengi det ikke fornuftig H2O2, men beholder respons på pH 46. det har også blitt observert at celler som uttrykker H2O2 sensoren krever lengre grunnlinjen til equilibrate, spesielt etter blir transportert fra en inkubator til stedet for analyse, som de opplever små endringer i media temperatur og pH. Det anbefales å anskaffe minst 5 datapunkter etter grunnlinjen har stabilisert seg før du starter noen eksponering.
Sensorene i denne metoden, roGFP2 og HyPer, er to av mange fluorogenic-sensorer som har en rekke nye programmer i feltet toksikologi. Dette inkluderer sensorer for å oppdage ikke bare EGSH og H2O2, men peroxynitrite47, nitrogenoksid48,49, og selv ozon50. Disse sensorene kan benyttes i live-celle tenkelig studier for å spesifikt og overvåke følsomt oksidativt arten av interesse. Med fremskritt innen teknikker som spectral unmixing, det er også mulig å uttrykke co to sensorer med lignende spektrale egenskapene (innenfor 5 nm av hverandre) i samme celle og skiller andelen fluorescens slippes ut av hver sensor51 . Denne teknikken er av spesiell interesse for roGFP2 og HyPer, fordi de innebærer excitations og utslipp på samme bølgelengdene. Som kort nevnt her, kan visse sensorer rettes mot bestemte intracellulær avdelinger, for eksempel mitokondrier, å observere oksidativt hendelser av interesse. Mens disse nye sensorer og teknikker er utenfor omfanget av denne metoden, kalles leseren flere nye publikasjoner om emnet av intracellulær redoks sensorer, som anmeldelsen av lønn og kolleger52. Bruk av genetisk kodet fluorogenic sensorer med live-celle imaging er et kraftig verktøy for overvåking av oksidativt svar under toksikologiske vurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forskningen beskrevet i denne artikkelen har blitt vurdert av National Health and Environmental effekter Research Laboratory, US Environmental Protection Agency, og godkjent for publisering. Innholdet i denne artikkelen bør ikke tolkes som representerer byrået politikk, og heller utgjør omtale av varemerker eller kommersielle produkter godkjennelse eller anbefaling for bruk.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Katelyn Lavrich for hjelp med eksperimentell design og manuskriptet redigeringer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P.
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user's perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P.
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
