Summary
Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.
Abstract
Enquanto o estresse oxidativo é um mecanismo comumente citado toxicológico, métodos convencionais para estudá-lo sofrem uma série de deficiências, incluindo a destruição da amostra, introdução de artefatos potenciais e uma falta de especificidade para a reativa espécie em questão. Assim, há uma necessidade atual no campo da toxicologia de métodos não-destrutivos, sensíveis e específicos que pode ser usado para observar e quantificar as perturbações redox intracelular, mais comumente referidas como estresse oxidativo. Aqui, apresentamos um método para o uso de dois sensores fluorogenic geneticamente codificado, roGFP2 e HyPer, para ser usado em estudos de imagiologia viver-pilha para observar respostas oxidativas induzida por xenobiótico. roGFP2 se equilibra com potencial de redox da glutationa (EGSH), enquanto HyPer detecta diretamente o peróxido de hidrogênio (H2O2). Ambos os sensores podem ser expressa em vários tipos de célula através de transfeccao ou transdução e podem ser direcionados para compartimentos celulares específicos. O mais importante, viver-pilha microscopia usando estes sensores oferece alta resolução espacial e temporal que não é possível usar os métodos convencionais. Mudanças na intensidade da fluorescência monitorados em 510 nm serve como a leitura para ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado quando sequencialmente animado por 404 nm e 488 nm de luz. Esta propriedade faz com que ambos os sensores ratiometric, eliminando artefatos comuns da microscopia e corrigir as diferenças na expressão de sensor entre as células. Esta metodologia pode ser aplicada através de uma variedade de plataformas fluorométrica capazes de emissões emocionantes e coleta em comprimentos de onda prescritos, tornando-o adequado para uso com sistemas de imagem confocal, microscopia de campo amplo convencional e placa leitores. Ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado utilizaram-se em uma variedade de tipos de células e estudos toxicológicos para monitorar celular EGSH e a H2O2 geração em tempo real. Descritas aqui, é um método padronizado que é amplamente adaptável em plataformas fluorométrica de aplicação do roGFP2 e HyPer nas avaliações toxicológicas de viver-pilha de estresse oxidativo e tipos de células.
Introduction
O termo "estresse oxidativo" é frequentemente citado como um mecanismo em toxicologia, mas raramente é este termo descrito especificamente. Estresse oxidativo pode se referir a vários processos intracelulares, incluindo a geração de espécies reativas de oxigênio, danos causados pelos radicais livres, a oxidação de moléculas antioxidantes, e mesmo a ativação de sinalização específicas cascatas. Uma ampla gama de contaminantes ambientais1,2 e3,de agentes farmacêuticos4 foram documentadas para induzir o estresse oxidativo por qualquer ação direta do composto xenobióticos em si5 ,6 ou secundariamente por produção de espécies oxidantes como parte de uma resposta celular7,8,9,10. Portanto, é de grande interesse na toxicologia com precisão observar e caracterizar os processos oxidativos, levando a resultados adversos. Métodos convencionais de medição de estresse oxidativo envolvem identificação de biomoléculas oxidada11,12,13,14,15 ou antioxidantes16 ,17,18,19,20, ou medição direta de espécies reactivas se21,22,23, 24. No entanto, esses métodos normalmente exigem rompimento celular, que muitas vezes consome a amostra, elimina a resolução espacial e potencialmente introduz artefatos25. O desenvolvimento de métodos mais sensíveis e específicos para a detecção de espécies oxidantes e marcadores de estresse oxidativo é amplamente aplicável para a investigação dos efeitos adversos da exposição xenobióticos.
Microscopia de viver-pilha usando uma nova geração de sensores fluorogenic geneticamente codificado tem emergido como uma poderosa ferramenta para monitorizar o estado redox intracelular de células vivas. Estes sensores são normalmente expressos usando um vetor sob o controle de um promotor viral é introduzido através de metodologias de transfecção ou transdução. Eficiência elevada expressão não é necessária, pois células expressando o sensor fluorescente podem ser facilmente identificadas visualmente. Para as avaliações toxicológicas, celulas que expressam estes sensores podem ser observadas usando microscopia de fluorescência, como eles são expostos a compostos xenobióticos em tempo real. Este projeto experimental permite medições repetidas na mesma cela, permitindo que a linha de base estabelecida de cada célula atuar como seu próprio controle. A alta resolução temporal, conferida pela imagem latente da viver-pilha é well-suited para a detecção de eventos oxidativos, particularmente aqueles que são modestos em magnitude ou transiente na natureza. Além de ser sensível e específico para suas moléculas-alvo, a fluorescência de alguns destes sensores pode ser excitada usando dois comprimentos de onda da luz. Este fenômeno permite a emissão fluorescente ser expressa como uma razão, que permite o discernimento do sinal alterações associadas com respostas de autêntica sensor de aqueles causados por artefatos tais como variações na expressão de sensor, espessura de célula, lâmpada intensidade, fotobranqueamento e sensibilidade do detector de fluorescência26. Outra vantagem do uso de sensores fluorogenic é que eles podem ser direcionados para compartimentos celulares específicos, criando um nível de resolução espacial que é inigualável por métodos convencionais25,26,27.
Uma grande família de sensores geneticamente codificado com base na proteína verde fluorescente (GFP) foram desenvolvidos e caracterizados para relatório sobre uma ampla variedade de marcadores fisiológicos, incluindo pH, temperatura, concentrações de cálcio e a relação ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Estão incluídos entre esses sensores do potencial redox glutationa (EGSH) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Enquanto estes sensores foram desenvolvidos para aplicações em biologia redox e fisiologia, eles também foram adaptados para estudar o estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Especificamente, o protocolo descrito aqui descreve o uso da roGFP2 de sensor EGSH e o sensor de2 H2O HyPer.
roGFP2 informa o potencial redox intracelular reduzida e oxidada glutationa (GSH/GSSG) através de um relé de redox envolvendo glutationa peroxidase (GPx), Glutarredoxina (Grx) e glutationa redutase (GR) (Figura 1)25, 32 , 33. glutationa é a molécula antioxidante celular predominante e está presente principalmente em sua forma reduzida (GSH) em concentrações milimolar no citosol25,34. Enquanto EGSH não tem sido associada a qualquer resultado funcional, é reconhecido como um importante indicador de status oxidativo intracelular34. Um relativamente pequeno aumento na concentração de GSSG resulta em um aumento EGSH é detectável por roGFP2. Igualmente importante, monitoramento de EGSH usar roGFP2 durante exposições xenobióticas pode potencialmente revelar muito sobre o mecanismo de ação em vários pontos do relé de redox e caminhos associados, tais como o fosfato de pentose derivação (Figura 1 )35. O segundo sensor discutido aqui, HyPer, é uma intracelular sonda H2O2 derivada a inserção de proteína fluorescente amarela (YFP) no domínio regulamentar de bacteriana H2O2-transcrição sensível fator OxyR136. Embora anteriormente foi considerado um prejudicial oxigênio reativo intermediário, H2O2 está cada vez mais sendo reconhecido como uma importante molécula de sinalização intracelular sob condições fisiológicas37, 38, sugerindo que funções não reconhecidas para H2O2 existir em toxicologia também. Por exemplo, excesso H2O2 induzido por uma exposição de xenobióticas pode ser um precursor de desregulagem na sinalização celular, ou uma mudança na Bioenergética.
Ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado foram expressas em várias linhagens celulares estabelecidas, incluindo a linhagem de células de carcinoma epidermoide humana A431 e a linha de células epiteliais brônquicas humanas BEAS-2B, para observar alterações no EGSH e H2 O2 em resposta a uma variedade de riscos toxicológicos. Estes incluem gases poluentes (ozônio35), componentes solúveis de matéria particulada (1,2 naftoquinona39,40 e zinco41) e nanopartículas de níquel (dados não publicados). Estes estudos representam apenas um pequeno subconjunto das possíveis aplicações destes dois sensores. Teoricamente, qualquer tipo de célula que é capaz de receber e expressar o DNA destes sensores através de técnicas convencionais de biologia molecular pode ser utilizado para avaliar os efeitos dos xenobióticos, suspeitados-se de alterar o estado oxidativo celular. Até à data, um ou mais destes sensores foi expressa em vários procariotas e eucariotas, incluindo vários mamíferos, planta, bactérias e levedura célula tipos25,26,36,42. A leitura de ambos EGSH e H2O2 sensores é uma mudança na intensidade da fluorescência emitida em 510 nm com excitação com luz de 404 e 488 nm. Este método é amplamente adaptável em plataformas fluorométrica, incluindo vários tipos de microscopia (confocal e campo amplo) e leitores de placa. O método apresentado aqui permite a observação sensível e específica de intracelular EGSH e H2O2 em vitro sistemas toxicológicos.
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Protocol
1. preparação das células
Nota: Este procedimento descreve a transdução Lentivirus de uma linhagem de células imortalizado (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) para expressar o repórter desejado (roGFP2 ou HyPer). Outras linhas/tipos de células e/ou métodos de transferência de genes, incluindo transfeccao, podem ser utilizados desde que resultam em um nível de expressão do repórter adequada para visualizar um número suficiente de sensor-expressando células por campo de visão (tipicamente 5-10 células). Se usando métodos do transfection, o procedimento deve ser realizado no prato que em última análise, será usado para o método de análise (por exemplo, transfect as células no mesmo prato que será apresentado ao microscópio). Os passos descritos abaixo fornecem detalhes para a preparação de transductions de célula a ser realizado em uma placa de cultura de células de 6-poços. Se este formato não é um tamanho adequado para a aplicação desejada, outras embarcações podem ser substituídas.
- Desenvolvem-se células de aproximadamente 40-60% confluência em meios de crescimento normal.
Nota: Este estudo utilizou a linha de células epiteliais brônquicas humanas, BEAS-2B, cultivada em meio de crescimento de queratinócitos (KGM). - Pouco antes de transdução, substitua a mídia de crescimento nas células com 500 µ l de soro livre mídia contendo a quantidade adequada de vírus, conforme calculado pela fórmula:
- Para transdução de células BEAS-2B, use soro livre queratinócito basal médio (KBM) para substituir a mídia de crescimento KGM durante incubação do viral.
Nota: O cálculo acima é para uma única transdução de um poço de células em um formato 6-poços. Se necessário, realizar transductions de vários poços podem ser executados, ajustando a fórmula com uma multiplicação pelo número de poços para ser transformados. Para transductions de Lentivirus, use uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 5 e 20. Para transductions adenovírus, use um MOI entre 100 e 500.
- Para transdução de células BEAS-2B, use soro livre queratinócito basal médio (KBM) para substituir a mídia de crescimento KGM durante incubação do viral.
- Incube as células com a mistura viral a 37 ° C por 4 h, redistribuindo as partículas virais no prato cada 30-60 min com um breve balanço ou agitando o movimento.
- Adicionar 1 mL de meio completo crescimento ao prato e incubar a 37 ° C para um adicional 4-16 h.
- Remova toda a mídia e substituir com mídia de crescimento completo fresco.
- Continue a crescer e as células de passagem, expanda conforme necessário.
Nota: Células devem começar expressando sensivelmente o sensor dentro de 12-48 h. Se um vetor de Lentivirus foi usado para a transdução, expressao do sensor desejado deve continuar através de passagens. - Para avaliações baseadas em microscopia, células de semente em vidro com fundo de pratos de microscópio e crescem a confluência desejada (≥70 - 80%) antes da imagem latente.
Nota: Densidade de semeadura vai depender do tamanho do prato, taxa de crescimento da célula-linha sendo usado e o tempo da avaliação após a semeadura. Por exemplo, sementes 300.000 BEAS-2B células num prato 35mm para produzir aproximadamente 70-80% confluência após 1 dia de crescimento.
2. microscopia set-up
Nota: O protocolo descrito abaixo é realizado usando um microscópio confocal equipado com linhas de laser em 404 e 488 nm. Outros meios de fazer avaliações fluorométrica dos sensores descritos neste protocolo em sua excitações/emissão prescrito devem também produzir dados viáveis. Importante, configurações de equipamentos podem variar muito, dependendo do tipo, idade e condição do instrumento a ser usado; assim, quaisquer valores de instrumento mencionados não podem ser específicos para o equipamento utilizado em outros laboratórios.
- Realizar todas as análises de imagens usando controles ambientais para manter uma temperatura adequada (por exemplo, 37 ° C), umidade (normalmente > 95% de humidade relativa), e/ou gás concentração (por exemplo, 5% CO2) apropriada para as células em todo o duração do experimento.
- Se usar altos valores de umidade relativa, manter todas as superfícies que possam entrar em contacto com a atmosfera umidificada (ex., o objetivo do microscópio) em ou ligeiramente acima da temperatura em que a umidade é gerada para evitar condensação. Isso pode ser feito com o uso de um aquecedor objetivo e/ou aquecimento de fita e um controle adequado do aquecedor.
- Ativar todos os componentes do microscópio e configurar todos equipamentos necessários para a excitação sequencial em 404 e 488 nm com emissão em 510 nm. Certifique-se de todos os componentes da configuração óptica estão definidos adequadamente para aquisição em tempo real.
- Configurar uma câmara ambiental de palco-top para manter a temperatura constante a 37 ° C, 5% CO2 atmosfera, e > 95% de umidade. Antes de iniciar a aquisição de imagens, equilibrar a câmara ambiental pelo menos 10 min após a configuração inicial de todos os controles ambientais.
Nota: Condições ambientais podem ser eliminadas ou ajustadas dependendo do experimento comprimento, tipo de célula e exposição sendo usado. - Coloque o prato de células (passo 1.7) no palco-topo dentro da câmara ambiental.
- Com a lente objetiva desejada, encontrar o plano focal de células usando a ocular e a luz branca e certifique-se de morfologia normal.
Nota: Um 1.4 at 60 X violeta-corrigido, imersos em óleo da lente objetiva é comumente usada, que permite a identificação dos compartimentos intracelulares, enquanto maximiza a resolução óptica do sistema confocal. - Verifique se a expressão de fluorescência das células no campo de visão. Fazê-lo enquanto visualizando as células sob iluminação de fluorescência de campo amplo com um conjunto de filtro apropriado, como isotiocianato de fluoresceína (FITC). Neste ponto, usando iluminação de campo amplo, enquanto olhando através da ocular é mais conveniente porque é mais fácil mover o prato para selecionar um campo de células para estudar. Em geral, escolha um campo de visão que contém pelo menos 5 a 10 células que expressam o sensor, como indicado por fluorescência verde.
- Alternativamente, realizar esta avaliação usando confocally da excitação do laser no comprimento de onda que é mais compatível com o sensor a ser expressado (488 nm normalmente funciona melhor).
Nota: Devido às suas propriedades intrínsecas, fluorescentes, será mais difícil de Visualizar células expressando HyPer do que aquelas roGFP2 expressando usando qualquer FITC ou em 488 nm. No entanto, ainda seria possível ver células desmaiar.
- Alternativamente, realizar esta avaliação usando confocally da excitação do laser no comprimento de onda que é mais compatível com o sensor a ser expressado (488 nm normalmente funciona melhor).
- Uma vez que encontra-se um campo de visão desejado, feche a câmara ambiental.
Nota: Use o recurso de manutenção de foco, muitas vezes disponível em suportes avançado microscópio, para facilitar a manutenção de um plano focal estável ao longo do estudo. - Configure parâmetros de aquisição para garantir ótima avaliação do sensor de interesse entre o período de exposição desejada. Abaixo estão as recomendações e abordagens para a imagem latente confocal de respostas do sensor:
- Ajustar a potência do laser para excitação em 488 nm e emissão em 510 nm. Escolha um nível de potência do laser que permite a visualização das células e manter esta constante entre amostras ou pratos de replicar.
Nota: Para este estudo, 12% e 1,5% do laser poder foram usados para as linhas de laser 404 e 488 nm, respectivamente. - Use os controles confocal do software aquisição para garantir que o plano focal selecionado foi otimizado para a intensidade de emissão de fluorescência máxima no centro das células (eixo z) por digitalização em 488 nm enquanto ajusta o plano z. Isto é facilitado pela usando uma configuração de alto ganho, enquanto procurava o z-plano que resulta nas células mais sobre-exposto. Uma vez que o plano focal adequado foi encontrado, retorne o ganho para uma configuração que é o mais ideal para a fluorescência do repórter sendo usado sem oversaturating os pixels que está sendo observados.
Nota: As configurações de laser e ganho que são apropriadas para encontrar e observar células durante a experimentação é completamente dependente do sistema confocal sendo utilizado. Em geral, uma vez que as células foram encontradas no campo de visão, recomenda-se que uma quantidade mínima de potência do laser a ser utilizado (normalmente % de ≤20), como a exploração excessiva das células usando luz laser de alta potência, provocar alterações oxidativas detectáveis pelo sensor. - Use o ganho para afinar a fluorescência de base. Com roGFP2, estabelece a base perto do limite superior (≈ 90% relativa de intensidade) do instrumento sem excesso de saturação, como estas células perderá fluorescência de nm 510 induzida por excitação de nm 488 quando EGSH aumenta. Em contraste, a intensidade de fluorescência com 488 excitação nm deve ser baixa (≈ 10% relativa de intensidade) na linha de base para HyPer expressando as células, como estas células ganhará intensidade de fluorescência 510 nm quando H2O2 é detectado.
- Repita as etapas 2.9.2 e 2.9.3 com excitação em 404 nm e emissão em 510 nm. Configurações de ganho para o comprimento de onda de excitação de nm 404 são opostos aqueles usados com 488 excitação nm para cada sensor (i.e., fluorescência de base baixa (≈ 10% relativa de intensidade) em 404 nm para roGFP2, fluorescência de base alta (≈ 90% relativa de intensidade) para o H2 Sensor de2 O).
Nota: em geral, a fluorescência (510 de emissão) em 404 excitação nm será consideravelmente inferior que obtenível com 488 excitação nm nas células expressar tanto roGFP2 e HyPer, como o pico nm 404 é uma relativamente menor excitação máxima para esses dois sensores.
- Ajustar a potência do laser para excitação em 488 nm e emissão em 510 nm. Escolha um nível de potência do laser que permite a visualização das células e manter esta constante entre amostras ou pratos de replicar.
3. aquisição de dados
- Configurar o software de aquisição para excitar sequencialmente os dois comprimentos de onda de excitação (primeiro 488 nm e, em seguida, 404 nm) e recolher as emissões para ambos em 510 nm em um intervalo de tempo predeterminado em todo o comprimento desejado do experimento (por exemplo, captura imagens cada 60 s para 60 min).
- Em alternativa, adquira imagens manualmente antes e após as exposições se a altura aproximada das mudanças EGSH ou H2O2 é conhecida para o xenobiótico sendo testado. No entanto, isso pode levar a perda de resolução temporal.
- Para a avaliação em tempo real de parâmetros experimentais, escolher pelo menos 5-10 sensor-expressando pilhas no campo e estabelecê-los como regiões de interesse ("ROIs") para monitorar as alterações de fluorescência durante o experimento.
Nota: Este passo é opcional e pode ser realizado após o experimento se observação direta em tempo real é indesejável ou evitar a limitações de software monitoramento contínuo. Dependendo da população de células, a seleção do sensor expressando células como ROIs pode representar uma gama de níveis de expressão através de células.- Para estes estudos, adicione o ambiental tóxica 9,10-phenanthrenequinone (9,10-PQ) ou peróxido de hidrogênio (H2O2) após um período de 5 min de base.
- Prepare todos os reagentes para uso posterior no presente protocolo. Dissolver 9,10-PQ em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de 15 mM e em basocelular meios para produzir uma solução de trabalho de 250 µM. Além disso, prepare uma solução de peróxido de hidrogênio na água que irá produzir uma concentração final de 1mM a injeção.
- Uma vez que foram definidos os parâmetros experimentais, começa a aquisição de curso do tempo. Estabelece um período inicial pelo menos 5 min (ou 5 pontos de dados) antes de iniciar as exposições de xenobióticas.
- Expor as células para a toxicidade sendo investigado usando abordagens convencionais para em vitro de dosagem. Preparar compostos solúveis em água ou outro solvente apropriado e injetar diretamente para a mídia.
- Se solventes orgânicos (por exemplo, dimetil sulfóxido ou etanol) forem necessários, mantenha a concentração final de solvente em ou abaixo de 0,1%. Verifique se que o solvente não produz um efeito sobre EGSH ou H2O2 produção com um controle de veículo em um prato separado das células.
- Para compostos com baixa solubilidade, adicione uma etapa de mistura usando uma micropipeta no protocolo após a injeção é feita. Bomba de exposições gasosas diretamente na câmara ambiental, usando a mistura de gás portador apropriado.
- Monitorar alterações em fluorescência durante o período de exposição. Efectuar injecções subsequentes conforme necessário. Tome muito cuidado para não deslocar o prato durante injeções, para que as mesmas células são seguidas ao longo do tempo todo enquanto fotografada no mesmo plano focal.
- No final do experimento, expor as células aos controles apropriados. Para ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado, adicione concentrações específicas de compostos conhecidos para oxidar e reduzir estes sensores em uma aguçado demonstração de sua capacidade de resposta do ratiometric. H2O2 e ditiotreitol (DTT) servem como controles apropriados para oxidar e reduzir ambos os sensores. Normalmente, uma concentração final de 100-1.000 µM H2O2, seguido de 1-5mm ditiotreitol (DTT), permite que o usuário totalmente oxidar e reduzir estes sensores.
- Para estes estudos, use 1 mM H2O2 seguido de 5mm TDT para determinar a resposta máxima do sensor.
- Espere pelo menos 5 min para permitir que o sensor responder e em seguida, injetar um agente redutor, como TDT, para reduzir o senor e retorná-lo a um nível de fluorescência em ou perto de sua linha de base estabelecida.
Nota: O uso de controles nesta etapa é crucial para a normalização e deve ser realizado no final de cada experimento para determinar a faixa dinâmica do sensor em cada célula. Para roGFP2, aldrithiol também pode ser adicionado ao final do experimento. Aldrithiol ignora o relé de redox roGFP2 para oxidar o sensor diretamente. Isto é útil para avaliar a função de sensor após a exposição de xenobióticas.
4. análise de dados
- Se não já estabelecido, desenhe ROIs ao redor das células para ser analisado. Use o software apropriado para medir a intensidade de fluorescência de cada ROI para cada comprimento de onda ao longo do tempo. Certifique-se que as células não se mexeu, ou a placa não mudar durante a execução.
Nota: O estabelecimento de ROIs é mais facilmente realizado desenhando-se uma região fechada que segue o padrão de expressão fluorescente de cada célula. Para ajudar ainda mais com este processo, uma imagem de luz (ou brightfield) transmitida das células dentro do campo de visão estabelecida pode ser sobreposta na imagem fluorescente nos esforços para definir os limites da célula. No entanto, o uso de uma imagem de luz transmitida requer que o usuário capturar um canal adicional (conjunto de imagens) ao longo do experimento. Alternativamente, alguns fabricantes incorporam algoritmos em seu software de imagens que usam parâmetros específicos tais como limiares de intensidade para estabelecer um método mais quantitativo, menos subjetivo, ROIs. - Exporte os dados para o software de análise desejada (por exemplo, planilha eletrônica).
- Calcule a resposta do sensor de ratiometric para cada ROI em cada ponto de tempo, usando as fórmulas:
- Para cada ponto de tempo, média os valores calculados ratiometric de ROIs todos.
- Calcule o valor da linha de base, que será usado para normalizar os dados, calculando os valores ratiometric calculado anteriormente (etapa 4.4) recolhidos antes da adição do xenobiótico (por exemplo, os primeiros cinco vezes pontos).
- Normalize os valores ratiometric da etapa 4.4 dividindo-se cada valor pelo valor de base calculado em 4,5. Rácios de normalizado centralizam-se em torno de um valor de 1 na linha de base, enquanto aumentos EGSH ou H2O2 injeções seguintes fará com que a relação aumentar. Avaliações de xenobiótico que induzem alterações oxidativas tendem a produzir valores em um intervalo de 3 - 6 vezes o valor da linha de base.
- Para auxiliar na comparação de respostas dentro e através de experimentos, expressa os dados normalizados como uma porcentagem de resposta máxima do sensor, definindo a resposta para o oxidante de controle (por exemplo, 1 mM H2O2) como 100%.
Nota: Se expressar dados como uma porcentagem de resposta máxima do sensor, é fundamental para garantir que a mesma concentração de oxidante o controle é usada consistentemente através de experimentos. Todos os dados derivados de análise de imagens de células ao vivo é passível de análise estatística por pares e armazenando convencional para ser escolhida a critério do investigador.
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Representative Results
O uso de roGFP2 e HyPer em detectar alterações EGSH e intracelular H2O2 tem sido bem descrito anteriormente25,36,42,43 e é demonstrado aqui. Imagens confocal de células expressando roGFP2 na linha de base e seguir adição de H2O2 e TDT são mostradas na Figura 2. Dados de imagens coletadas durante o experimento foram então exportados e analisados conforme descrito na seção 4 do protocolo. Como mostrado, a adição de exógeno H2O2 como um controle positivo produz respostas reprodutíveis, quando os dados são normalizados para seu respectivos de base e um intervalo dinâmico definido é estabelecido através da adição de conhecida exógena oxidantes/redutores (i.e., H2O2 e TDT) (figuras 3, 4 e 5).
Respostas aos estímulos toxicológicos são tipicamente mais variável do que aqueles induzidos pelos controles. Isso é de se esperar, como compostos xenobióticos podem ter efeitos pleiotrópicos em células, variando de redox ciclismo a adução de proteínas intracelulares. Exemplos de roGFP2 e hiper respostas induzidas pela exposição a tóxica 9,10-PQ, um poluente atmosférico oxidante, formado por reações atmosféricas de fenantreno44, são apresentados nas figuras 6 e 7. Os gráficos nestas figuras mostram a progressão de cada etapa envolvida na análise dos dados descrita na secção 4 do protocolo. Como mostrado, normalização de cada célula para sua própria linha de base e o controle positivo (Figura 6B), reduz a variabilidade intercelular na magnitude da resposta sensor de dados brutos (Figura 6A). Em casos onde a variação na resposta celular é de interesse, normalização dos dados pode ser executada até este ponto, com células individuais, representadas por suas próprias linhas no gráfico. Variação na magnitude ou cinética das respostas entre as células no mesmo prato pode revelar importantes visões mecanicistas que refletem diferenças no ciclo celular, por exemplo. Alternativamente, a resposta média das células no prato pode ser apresentada juntamente com o desvio-padrão (Figura 6C). Caso contrário, se replica de experimentos separados está sendo apresentadas, os dados podem ser apresentados como os valores de intensidade de fluorescência relativo normalizado ou uma porcentagem da resposta máxima induzida pelo oxidante de controle (figuras 3, 4, 5 e 6 D), mostrando a média de todas as repetições acompanhado o erro padrão da média. O ar ambiente contaminante 9,10-PQ é conhecido por ser um reciclador de redox potente, que nós hypothesize é responsável para os picos cíclicos de produção de peróxido de hidrogênio detectados pelo HyPer (Figura 7) e aumenta a gradual EGSH detectado pelo roGFP2 ( Figura 6 D).
Figura 1 . O relé de redox da glutationa roGFP2. Peroxidases glutationa (GPx) oxidam a glutationa reduzida (GSH) para GSSG em resposta a peróxido de hidrogênio (H2O2), , aumentando o potencial de redox da glutationa (GSHdo E). O roGFP2 de sensor fluorogenic se equilibra com intracelular EGSH quando oxidado por Glutarredoxina (Grx). Na via redutora, Grx catalisa a redução de roGFP2 através de deglutathionylation como diminuem os níveis GSSG e níveis normais de GSH são restabelecidos pela glutationa redutase (GR) em detrimento de NADPH. NADPH é fornecida pela glicose através da pentose fosfato (PPP). Adaptado de Gibbs-Flournoy et al.35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Imagens de microscopia confocal da célula epitelial brônquica humana linha BEAS-2B expressando citosólica roGFP2. As células foram iluminadas em 488 nm (A-D), seguido por 404 nm (E-H). Imagens mostram fluorescência emitida em 510 nm para as seguintes condições: linha de base (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)e 5 mM DTT (D, H). Objectivo de 60 X plano Apo VC. Barras de escala representam 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Dose dependentes alterações na roGFP2 induzida por H2O2 em células de BEAS-2B. As células foram incubadas por 30 min em vermelho de fenol livre queratinócito basal mídia (KBM) antes da exposição. Todas as adições de H2O2 ocorreram após um período inicial de 5 min. roGFP2 fluorescência emitida em 510 nm foi coletado usando uma passa-banda 525/30 nm filtro após a excitação do laser em 404 e 488 nm. Respostas celulares foram normalizadas para seus respectiva linha de base e a resposta máxima sensor após a adição de 1 mM H2O2. Valores são apresentados como média ± erro-padrão, n = 3, onde n consiste de uma média de 5-10 células independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Resposta de glicose fome BEAS-2B células expressando roGFP2 a várias doses de H2O2. As células foram equilibradas durante 2 horas em um meio de sal mínimo que não contém glicose antes da exposição. Todas as adições de H2O2 ocorreram após um período inicial de 5 min. roGFP2 fluorescência emitida em 510 nm foi coletado usando uma passa-banda 525/30 nm filtro após a excitação do laser em 404 e 488 nm. Respostas celulares foram normalizadas para seus respectiva linha de base e a resposta máxima sensor após a adição de 1 mM H2O2. Valores são apresentados como média ± erro padrão, n = 3, onde n consiste de uma média de 5-10 células distintas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Resposta de BEAS-2B células expressando HyPer para várias doses de H 2 O 2 . As células foram incubadas por 30 min em vermelho de fenol livre KBM antes da exposição. Todas as adições de H2O2 ocorreram após um período inicial de 5 min. da fluorescência emitida em 510 nm foi coletado usando uma passa-banda 525/30 nm filtro após a excitação do laser em 404 e 488 nm. Respostas celulares foram normalizadas para seus respectiva linha de base e a resposta máxima sensor após a adição de 1 mM H2O2. Valores são apresentados como média ± erro padrão, n = 3, onde n consiste de uma média de 5-10 células distintas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. 9,10-PQ-induzido respostas de BEAS-2B células expressando roGFP2. As células foram incubadas por 30 min em vermelho de fenol livre KBM antes da exposição. Adição de 25 µM 9,10-PQ com mistura ocorreu em 5 min, seguido pela adição de 1 mM H2O2 em 20 min e 5 mM DTT em 24 min. painel A retrata a relação de roGFP2 crua das células individuais no prato, cada célula representada por uma linha separada. Painel B mostra a normalização dos valores de cada célula para sua fluorescência de sensor de linha de base, e a média e o desvio padrão desses dados é sobreposta sobre as relações individuais normalizadas em painel C. A percentagem de resposta do sensor máxima média de todas as células é representada no painel D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . 9,10 PQ-induzida por respostas de BEAS-2B células expressando HyPer. As células foram incubadas por 30 min em vermelho de fenol livre KBM antes da exposição. Adição de 25 µM 9,10-PQ com mistura ocorreu em 5 min, seguido pela adição de 1 mM H2O2 em 20 min e 5 mM DTT em 25 min. fluorescência emitida em 510 nm foi coletado usando uma passa-banda 525/30 nm filtro após a excitação do laser em 404 e 488 nm. Respostas celulares foram normalizadas para seus respectiva linha de base e a resposta máxima sensor após a adição de 1 mM H2O2. Valores são apresentados como a média de 5-10 células distintas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O uso de roGFP2 e HyPer na detecção de alterações em intracelular EGSH e H2O2, respectivamente, foi bem descrito em anteriores estudos fisiológicos e toxicológicos 25,35,36 ,39,40,41,42,43. O protocolo descrito aqui relata uma maneira eficaz de implementar esses sensores redox geneticamente codificado em estudos toxicológicos pontiagudos, destinados a avaliar as perturbações induzidas pelo xenobiótico de homeostase redox intracelular. Mais importante ainda, o uso adequado destes sensores vincula qualquer alterações observadas para um par redox específico ou ROS (EGSH ou H2O2), em última análise, esclarecendo a falta de especificidade com muitas abordagens convencionais de estresse oxidativo. Em garantir a qualidade dos dados gerados a partir destes sensores, alguns aspectos deve ser tomada em consideração ao projetar experiências e analisar/interpretar dados. Eles incluem: 1) o uso de controles adequados, 2) verificação de respostas adequadas do sensor e 3) manipulação de parâmetros experimentais para elucidar mecanismos. Destes, a adição de exógeno H2O2 e TDT, como controles, no final do período de observação serve a vários propósitos. Em primeiro lugar, que proporciona uma oportunidade para avaliar a magnitude da resposta do sensor para a exposição a substâncias tóxicas em relação as sinais de máximas e mínimas atingíveis. Isso é mais útil na normalização respostas para comparações entre as experiências. Além disso, terminar o experimento com a adição de forte oxidante exógeno e estímulos redutoras pode avaliar o efeito da exposição anterior na integridade do sensor/relé. Além disso, o aldrithiol pode ser adicionado no final da execução de ignorar o relé e testar a funcionalidade do sensor diretamente para possíveis danos que a exposição pode ter infligido ao fluoróforo em si.
Assim como com outras técnicas, ao aplicar esta metodologia para a análise específica dos resultados toxicológicos, é importante fazer avaliações qualitativas sobre a precisão das observações feitas. Quando utilizando roGFP2 ou HyPer com qualquer novo xenobiótico é importante primeiro testar uma gama de doses, garantindo simultaneamente que a intensidade de fluorescência (emissão de 510 nm) de cada comprimento de onda de excitação (404 nm e 488 nm) muda de forma apropriada (ou seja, um aumento ou diminuir) para o Señor redox sendo usado. O objetivo é identificar uma dose em que uma resposta do sensor é detectável, mas não é oprimida pela manipulação ostensiva do sensor ou outros efeitos não-específicos do composto. Adução direta ou danos ao sensor podem se manifestar como alterações atípicas na fluorescência no comprimento de onda de excitação (404 ou 488 nm). Em situações onde qualquer sensor tem sido observado para consistentemente respondem inadequadamente à adição de um toxicant através de exposições, recomenda-se que o investigador considerar examinar parâmetros experimentais em relação à dosimetria, celular viabilidade, expressão do sensor, e/ou anormalidades óptico/cromática da instrumentação a ser usado para observar as respostas.
Como com qualquer leitura toxicológica, os dados adquiridos são geralmente mais significativos quando as respostas observadas são examinadas ou validadas usando uma abordagem mecanicista e as limitações experimentais são considerados. Para este fim, vários parâmetros experimentais, combinados com as propriedades inerentes do sensor podem ser utilizados para gerar avaliações robusto redox. Investigações específicas para o uso do sensor roGFP2 preocupação em última análise, o relé de redox, através do quais os sentidos roGFP2 EGSH (Figura 1). O relé envolve enzimas intracelulares, incluindo Glutarredoxina (Grx), glutationa redutase (GR) e glutationa peroxidase (GPx). Diferenças nos níveis endógenos de Grx em compartimentos celulares e tipos de células podem influenciar as medições de EGSH e fazer comparações entre as experiências difíceis43. Para resolver este problema, uma série de "sondas de fusão" foram sintetizados, que ligam a enzima relevante diretamente para o sensor roGFP2. Mais recentemente, Grx-1 humano estava ligado ao roGFP2 por Gutscher e colegas32 para formar Grx1-roGFP2. Além de ter uma faixa dinâmica maior do que roGFP1 e sendo pH insensível, Grx1-roGFP2 pode monitorar EGSH em tipos de células ou compartimentos em que Grx atividade caso contrário seria limitado. Diferenças nos níveis de NADPH em tipos de células, ou mesmo entre as células no mesmo prato também podem contribuir para a variabilidade nas respostas roGFP2. NADPH é produzido a partir de glicose através da via pentose-fosfato e pode ser utilizado por glutationa redutase (GR) para reduzir a GSSG volta para GSH (Figura 1). Se as células no mesmo campo começam o experimento com diferentes capacidades de redução, suas alterações EGSH e a resultante roGFP2 respostas a um estímulo podem não ser uniformes. Este problema pode ser encimado por um período de fome de glicose antes do experimento, que esgota estoques de NADPH celulares e harmoniza roGFP2 respostas. Uma diminuição da capacidade de recuperação EGSH também pode ser vista no 25 µM H2O2 dose nas células que estavam esfomeados de glicose em comparação com células suplementado com concentrações normais de glicose (figuras 3 e 4). Desta forma, manipulação de níveis de NADPH por inanição de glicose pode servir como um meio para verificar o envolvimento dos vários componentes do relé em transducing o efeito de uma exposição de xenobióticos ao sensor. Outra preocupação quando usando roGFP2 em um contexto toxicológico é o potencial para o xenobiótico interajam diretamente em oxidar o sensor, ao invés de agir através do relé de redox para alterar EGSH. Oxidação direta de roGFP2 pode ser determinada por cada ponto do relé redox de sondagem e avaliar o seu efeito sobre o sinal de roGFP2. Um exemplo dessa técnica usando ozônio como um estímulo é demonstrado no estudo por Gibbs-Flournoy et al . 35.
Para experimentos com o sensor de2 H2O, as preocupações acima são não como relevantes, como o domínio de OxyR1 de HyPer sentidos H2O2 diretamente em vez de através de um relé de redox. No entanto, ao contrário de roGFP2, sensor de2 H2O é sensível a mudanças no pH, que pode causar alterações na fluorescência não imputável ao H2O2 durante um experimento. Por este motivo, o uso de mídia corretamente no buffer, uma câmara ambiental para manter a temperatura desejada e o uso de controles do veículo são vitais para qualquer experimento utilizando o sensor de2 H2O. Além disso, fluorogenic sensores foram desenvolvidos para pH especificamente monitor, tais como PQV, que emite fluorescência no canal vermelho e pode ser co expressa em células também expressando hiper45. O controle de pH ideal para o sensor de2 H2O é Holocaust, que é uma versão do sensor2 H2O que tem uma única mutação pontual, tornando-o incapaz de sentido H2O2, ainda preserva a capacidade de resposta ao pH 46. também tem sido observado que as células expressando sensor de H2O2 exigem um período mais longo de base para equilibrar, particularmente depois de ser transportada de uma incubadora para o site de análise, durante o qual eles experimentam pequenas mudanças na mídia temperatura e pH. Recomenda-se adquirir pontos de pelo menos 5 dados depois que a linha de base está estável antes de iniciar qualquer tipo de exposição.
Os sensores discutidos neste método, o roGFP2 e o HyPer, são dois dos muitos sensores fluorogenic que têm uma variedade de aplicações emergentes no campo da toxicologia. Isso inclui sensores projetados para detectar não apenas EGSH e H2O2, mas peroxinitrito,47,48,de óxido nítrico49e de ozônio até50. Estes sensores podem ser utilizados em estudos de imagiologia de viver-pilha para especificamente e sensìvel monitorar as espécies oxidativas de interesse. Com os avanços em técnicas tais como a desagregação espectral, é também possível expressar co dois sensores com características espectrais semelhantes (dentro de 5 nm do outro) na mesma cela e separar a proporção da fluorescência emitida por cada sensor51 . Esta técnica é de particular interesse para roGFP2 e HyPer, como envolvem excitações e emissão em comprimentos de onda mesmos. Como brevemente mencionado aqui, certos sensores podem ser direcionados para compartimentos intracelulares específicos, tais como as mitocôndrias, para observar eventos oxidativos de interesse. Enquanto estes sensores e técnicas emergentes estão além do escopo deste método, o leitor é referido várias publicações recentes sobre o tema dos sensores redox intracelular, tais como a revisão por salários e colegas52. A utilização de sensores fluorogenic geneticamente codificado com imagem latente da viver-pilha é uma ferramenta robusta para a monitorização das respostas oxidativas durante as avaliações toxicológicas.
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Disclosures
A pesquisa descrita neste artigo foi revista pelo nacional de saúde e laboratório de pesquisa de efeitos ambientais, agência de proteção ambiental dos Estados Unidos e aprovada para publicação. O conteúdo deste artigo não deve ser interpretado para representar a política da Agência, nem faz menção de nomes comerciais ou produtos comerciais constituem endosso ou recomendação para o uso.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Katelyn Lavrich para obter assistência com delineamento experimental e edições de manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
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