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Cancer Research

विषाक्तता Oxidative तनाव के आकलन के लिए इमेजिंग दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग Fluorogenic सेंसर का उपयोग

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/56945
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Department of Environmental Sciences and Engineering, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Environmental Public Health Division, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education

Summary

इस पांडुलिपि xenobiotic-प्रेरित oxidative तनाव की परीक्षा के लिए लाइव सेल इमेजिंग के एक आवेदन में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic पत्रकारों के उपयोग का वर्णन करता है । इस प्रायोगिक दृष्टिकोण अद्वितीय spatiotemporal संकल्प, संवेदनशीलता, और विशिष्टता प्रदान करता है, जबकि विषाक्तता oxidative तनाव का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया पारंपरिक तरीकों की कमियों के कई परहेज ।

Abstract

जबकि oxidative तनाव एक सामांयतः उद्धृत विषाक्तता तंत्र है, पारंपरिक तरीकों का अध्ययन करने के लिए यह नमूना के विनाश, संभावित कलाकृतियों का परिचय सहित कमियों के एक नंबर से ग्रस्त है, और प्रतिक्रियाशील के लिए विशिष्टता की कमी प्रजातियों में शामिल हैं । इस प्रकार, वहां गैर के लिए विषविज्ञान के क्षेत्र में एक वर्तमान की जरूरत है विनाशकारी, संवेदनशील, और विशिष्ट तरीकों का पालन करने के लिए और intracellular redox perturbations यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है, और अधिक सामांयतः oxidative तनाव के रूप में जाना जाता है । यहां, हम दो आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर, roGFP2 और हाइपर के उपयोग के लिए एक विधि वर्तमान, जीने में इस्तेमाल किया जा करने के लिए सेल इमेजिंग अध्ययन xenobiotic प्रेरित oxidative प्रतिक्रियाओं का पालन करें । glutathione redox क्षमता (EGSH) के साथ roGFP2 equilibrates, जबकि हाइपर सीधे हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) का पता लगाता है । दोनों सेंसरों अभिकर्मक या transduction के माध्यम से विभिंन प्रकार के सेल में व्यक्त किया जा सकता है, और विशिष्ट सेलुलर डिब्बों को लक्षित किया जा सकता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, लाइव सेल माइक्रोस्कोपी इन सेंसर का उपयोग पारंपरिक तरीकों का उपयोग संभव नहीं है कि उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प प्रदान करता है. प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन ५१० एनएम पर नजर रखी दोनों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर के लिए readout के रूप में कार्य करता है जब क्रमिक रूप से उत्तेजित ४०४ एनएम और ४८८ एनएम प्रकाश द्वारा । यह गुण दोनों सेंसर ratiometric, आम सूक्ष्म कलाकृतियों को नष्ट करने और कोशिकाओं के बीच सेंसर अभिव्यक्ति में अंतर के लिए सही बनाता है. यह पद्धति fluorometric प्लेटफार्मों की एक किस्म रोमांचक और निर्धारित तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जन का संग्रह करने में सक्षम है, यह फोकल इमेजिंग सिस्टम, पारंपरिक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, और प्लेट के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त बनाने में लागू किया जा सकता है पाठकों. दोनों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर सेल प्रकार और विषाक्तता अध्ययन की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है सेलुलर ईGSH और वास्तविक समय में एच2ओ2 पीढ़ी की निगरानी । यहां उल्लिखित एक मानकीकृत विधि है कि व्यापक रूप से सेल प्रकार भर में अनुकूलनीय है और roGFP2 और हाइपर के आवेदन के लिए fluorometric प्लेटफार्मों रहते में oxidative तनाव के सेल विषाक्तता आकलन है ।

Introduction

शब्द "oxidative तनाव" अक्सर विषविज्ञान में एक तंत्र के रूप में उद्धृत किया गया है, अभी शायद ही कभी यह शब्द विशेष रूप से वर्णित है । Oxidative तनाव कई intracellular प्रक्रियाओं को संदर्भित कर सकते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी सहित, मुक्त कण की वजह से नुकसान, एंटीऑक्सीडेंट अणुओं के ऑक्सीकरण, और यहां तक कि विशिष्ट संकेत कैस्केडिंग के सक्रियण. पर्यावरणीय संदूषणों की एक व्यापक रेंज1,2 और दवा एजेंटों3,4 के लिए या तो xenobiotic यौगिक ही5 के प्रत्यक्ष कार्रवाई द्वारा oxidative तनाव प्रेरित प्रलेखित किया गया है ,6 या secondarily एक सेलुलर प्रतिक्रिया7,8,9,10के भाग के रूप में ऑक्सीडेंट प्रजातियों के उत्पादन से । यह विषविज्ञान में बहुत रुचि का है इसलिए सही निरीक्षण और oxidative प्रतिकूल परिणामों के लिए अग्रणी प्रक्रियाओं की विशेषता है । oxidative तनाव को मापने के पारंपरिक तरीकों में शामिल ऑक्सीकरण रोधी अणुओं की पहचान11,12,13,14,15 या antioxidants16 ,17,18,19,20, या प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में से प्रत्यक्ष माप स्वयं21,22,23, 24. हालांकि, इन तरीकों आमतौर पर सेलुलर व्यवधान, जो अक्सर नमूना खपत की आवश्यकता होती है, स्थानिक संकल्प समाप्त, और संभावित कलाकृतियों25परिचय । ऑक्सीडेंट प्रजातियों और oxidative तनाव के मार्कर का पता लगाने के लिए और अधिक संवेदनशील और विशिष्ट तरीकों का विकास मोटे तौर पर xenobiotic एक्सपोजर के प्रतिकूल प्रभावों की जांच के लिए लागू होता है ।

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर की एक नई पीढ़ी का उपयोग करने के लिए जीवित कोशिकाओं की intracellular redox स्थिति की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । इन सेंसरों आम तौर पर एक वायरल प्रमोटर कि अभिकर्मक या transduction के तरीके के माध्यम से पेश किया है के नियंत्रण में एक वेक्टर का उपयोग कर व्यक्त कर रहे हैं । उच्च अभिव्यक्ति क्षमता आवश्यक नहीं हैं, के बाद से फ्लोरोसेंट सेंसर एक्सप्रेस कोशिकाओं को आसानी से नेत्रहीन की पहचान की जा सकती है । विषाक्तता आकलन के लिए, इन सेंसरों व्यक्त कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में वे वास्तविक समय में xenobiotic यौगिकों को उजागर कर रहे हैं मनाया जा सकता है. इस प्रायोगिक डिजाइन एक ही सेल में दोहराया माप अनुमति देता है, प्रत्येक कोशिका की स्थापना की आधारभूत आधार पर अपने नियंत्रण के रूप में कार्य । उच्च लौकिक संकल्प जी द्वारा afforded-सेल इमेजिंग अच्छी तरह से oxidative घटनाओं का पता लगाने के लिए अनुकूल है, विशेष रूप से उन है कि परिमाण या प्रकृति में क्षणिक में मामूली हैं । दोनों संवेदनशील और उनके लक्षित अणुओं के लिए विशिष्ट होने के अलावा, इन सेंसरों में से कुछ के प्रतिदीप्ति प्रकाश की दो तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर उत्साहित किया जा सकता है । यह घटना फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की अनुमति देता है एक अनुपात है, जो संकेत ऐसे सेंसर अभिव्यक्ति, सेल मोटाई, लैंप में बदलाव के रूप में कलाकृतियों के कारण उन से प्रामाणिक सेंसर प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े परिवर्तनों के प्रभेद परमिट के रूप में व्यक्त किया जा तीव्रता, photobleaching, और प्रतिदीप्ति डिटेक्टर की संवेदनशीलता26. fluorogenic सेंसर के उपयोग का एक और लाभ यह है कि वे विशिष्ट सेलुलर डिब्बों को लक्षित किया जा सकता है, स्थानिक संकल्प है कि पारंपरिक तरीकों25,26,27द्वारा बेजोड़ है के एक स्तर बनाने ।

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) पर आधारित सेंसरों का एक बड़ा परिवार विकसित किया गया है और पीएच, तापमान, कैल्शियम सांद्रता सहित शारीरिक मार्करों की एक विस्तृत विविधता पर रिपोर्ट करने के लिए विशेषता है, और एटीपी/ADP अनुपात25 ,28,29,30,31. इन के बीच शामिल glutathione redox क्षमता (ईGSH) और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के सेंसर कर रहे हैं । इन सेंसरों redox जीव विज्ञान और फिजियोलॉजी में अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया था, वे भी xenobiotic प्रेरित oxidative तनाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है. विशेष रूप से, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल ईGSH सेंसर roGFP2 और एच2ओ2 सेंसर हाइपर के उपयोग का वर्णन करता है ।

GSH GSSG (redox), glutathione (peroxidase), और GPx glutaredoxin (जीआर) (चित्रा 1)25, शामिल रिले के माध्यम से intracellular कम और ऑक्सीकरण glutathione (Grx/glutathione) की redox क्षमता पर roGFP2 रिपोर्ट ३२ , ३३. Glutathione प्रमुख सेलुलर एंटीऑक्सीडेंट अणु है और मुख्य रूप से cytosol25,३४में millimolar सांद्रता में अपनी कम फार्म (GSH) में मौजूद है । जबकि ईGSH किसी भी कार्यात्मक परिणाम से जोड़ा नहीं गया है, यह intracellular oxidative स्थिति३४के एक महत्वपूर्ण संकेतक के रूप में पहचाना जाता है । ईGSH कि roGFP2 द्वारा detectable है में वृद्धि में GSSG परिणामों की एकाग्रता में एक अपेक्षाकृत छोटे वृद्धि हुई है । समान रूप से महत्वपूर्ण, ईGSH की निगरानी xenobiotic जोखिम के दौरान roGFP2 का उपयोग कर संभवतः बहुत redox रिले में कई बिंदुओं पर कार्रवाई के तंत्र के बारे में पता चलता है और जुड़े रास्ते, pentose फॉस्फेट अलग धकेलना के रूप में कर सकते है (चित्रा 1 )३५. दूसरा सेंसर यहां चर्चा की, हाइपर, एक intracellular एच2हे2 बैक्टीरियल एच2ओ के विनियामक डोमेन में पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के सम्मिलन से व्युत्पंन जांच-संवेदनशील प्रतिलेखन है भाज्या OxyR1३६. हालांकि यह पहले एक हानिकारक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती माना गया है, एच2ओ2 तेजी से एक महत्वपूर्ण intracellular के रूप में पहचाना जा रहा है शारीरिक स्थितियों३७के तहत अणु संकेतन, ३८, सुझाव है कि एच2ओ2 के लिए अपरिचित भूमिकाओं के रूप में अच्छी तरह से विषविज्ञान में मौजूद हैं । उदाहरण के लिए, अतिरिक्त एच2ओ2 एक xenobiotic जोखिम द्वारा प्रेरित सेलुलर संकेतन या में एक बदलाव dysregulation के लिए एक अग्रदूत साबित हो सकता है ।

दोनों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर कई स्थापित सेल लाइनों में व्यक्त किया गया है, मानव epidermoid कार्सिनोमा सेल लाइन A431 और मानव के साथ-साथ उपकला कोशिका लाइन ब्यास-2 बी, ई में परिवर्तन का पालन करने के लिएGSH और एच२ ओ2 विषाक्तता जोखिम की एक किस्म के जवाब में । इनमें गैसीय प्रदूषक (ओजोन३५), पदार्थ कण के घुलनशील अवयव (1, 2 naphthoquinone३९,४० और जिंक४१), और निकेल नैनोकणों (अप्रकाशित डाटा) शामिल हैं । इन अध्ययनों से इन दो सेंसरों के संभावित अनुप्रयोगों का केवल एक छोटा सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं । सैद्धांतिक रूप से, किसी भी कोशिका प्रकार है कि प्राप्त करने में सक्षम है और पारंपरिक आणविक जीवविज्ञान तकनीक के माध्यम से इन सेंसर के डीएनए व्यक्त करने के लिए सेलुलर oxidative राज्य को बदलने के लिए संदिग्ध xenobiotics के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । तिथि करने के लिए, इन सेंसरों में से एक या अधिक कई स्तनधारी, संयंत्र, जीवाणु, और खमीर सेल प्रकार25,26,३६,४२सहित विभिंन prokaryotes और eukaryotes, में व्यक्त किया गया है । दोनों ईGSH और एच2ओ2 सेंसरों के लिए readout ४८८ और ४०४ एनएम प्रकाश के साथ उत्तेजना पर ५१० एनएम में उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की तीव्रता में एक परिवर्तन है । इस विधि व्यापक रूप से fluorometric प्लेटफार्मों भर में अनुकूलनीय है, माइक्रोस्कोपी के विभिंन प्रकार (फोकल और व्यापक क्षेत्र) और थाली पाठकों सहित । यहां प्रस्तुत विधि intracellular EGSH और H2O2 में इन विट्रो विषाक्तता प्रणालियों के संवेदनशील और विशिष्ट अवलोकन के लिए अनुमति देता है ।

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Protocol

1. कोशिकाओं की तैयारी

नोट: यह कार्यविधि एक अमर सेल लाइन (ब्यास-b. के lentiviral transduction का वर्णन करता है; ATCC, Manassas, VA) वांछित रिपोर्टर (roGFP2 या हाइपर) व्यक्त करने के लिए. अंय सेल लाइनों/प्रकार और/या जीन स्थानांतरण के तरीकों, अभिकर्मक सहित, के रूप में वे रिपोर्टर अभिव्यक्ति के एक स्तर पर दृश्य के प्रति क्षेत्र संवेदक-व्यक्त कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या में कल्पना करने के लिए पर्याप्त परिणाम के रूप में उपयोग किया जा सकता है (आमतौर पर 5-10 कोशिकाओं) । यदि अभिकर्मक तरीकों का उपयोग कर, प्रक्रिया डिश है कि अंततः विश्लेषण की विधि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा में किया जाना चाहिए (जैसे, transfect एक ही डिश है कि माइक्रोस्कोप के लिए प्रस्तुत किया जाएगा में कोशिकाओं) । नीचे वर्णित चरणों कक्ष transductions 6-well कक्ष कल्चर की थाली में किया जा करने के लिए तैयार करने के लिए विवरण प्रदान करें । इस प्रारूप वांछित आवेदन के लिए एक उपयुक्त आकार नहीं है, तो अन्य जहाजों प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

  1. कोशिकाओं को विकसित करने के लिए लगभग ४०-६०% सामान्य वृद्धि मीडिया में संगम.
    नोट: इस अध्ययन मानव दमा उपकला सेल लाइन का उपयोग, ब्यास-बी, keratinocyte विकास माध्यम (केजीएम) में उगाया.
  2. बस transduction से पहले, सीरम के ५०० µ एल के साथ कोशिकाओं पर वृद्धि मीडिया की जगह-मुक्त वायरस की उचित मात्रा में युक्त मीडिया, के रूप में सूत्र द्वारा गणना:
    Equation 1
    1. ब्यास के transduction-बी कोशिकाओं के लिए, सीरम मुक्त keratinocyte बेसल मध्यम (KBM) का उपयोग करने के लिए वायरल गर्मी के दौरान केजीएम विकास मीडिया की जगह ।
      नोट: उपरोक्त गणना एक 6-well प्रारूप में कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से एक transduction के लिए है । यदि जरूरत हो तो कई कुओं के transductions का प्रदर्शन कर कुओं की संख्या से गुणा-भाग कर transduced के साथ सूत्र का समायोजन करके प्रदर्शन किया जा सकता है. lentiviral transductions के लिए, 5 से 20 के बीच संक्रमण (मुि) की बहुलता का उपयोग करें । adenoviral transductions के लिए, १०० और ५०० के बीच एक मुि का उपयोग करें ।
  3. 4 एच के लिए ३७ ° c पर वायरल मिश्रण के साथ कोशिकाओं को गर्मी, पकवान में वायरल कणों एक संक्षिप्त कमाल या घूमता गति के साथ हर 30 से ६० मिनट redistributing ।
  4. पकवान और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 4-16 एच के लिए मशीन के लिए पूरा विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. सभी मीडिया निकालें और नए सिरे से पूरा विकास मीडिया के साथ बदलें ।
  6. आगे बढ़ें और कक्ष बीतने के लिए, आवश्यकतानुसार विस्तार करें ।
    नोट: कोशिकाओं 12-48 एच के भीतर सेंसर व्यक्त appreciably शुरू कर देना चाहिए. यदि एक lentiviral वेक्टर transduction के लिए इस्तेमाल किया गया था, वांछित संवेदक के स्थिर अभिव्यक्ति मार्ग में जारी रखना चाहिए ।
  7. माइक्रोस्कोपी आधारित आकलन के लिए, ग्लास तली हुई माइक्रोस्कोप डिश में बीज कोशिकाओं और इच्छित संगम करने के लिए विकसित (≥ ७०-८०%) इमेजिंग करने से पहले ।
    नोट: सीडिंग घनत्व डिश के आकार पर निर्भर करेगा, सेल-लाइन की वृद्धि दर का उपयोग किया जा रहा है, और मूल्यांकन के बाद सीडिंग के समय । उदाहरण के लिए, बीज ३००,००० ब्यास-2 बी कोशिकाओं में एक ३५ मिमी पकवान लगभग ७०-८०% संगम वृद्धि के 1 दिन के बाद उपज ।

2. माइक्रोस्कोप सेट अप

नोट: प्रोटोकॉल नीचे वर्णित एक फोकल ४०४ और ४८८ एनएम में लेजर लाइनों से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है । अपने निर्धारित उत्तेजना/उत्सर्जन पर इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित सेंसर के fluorometric आकलन बनाने के अंय साधन भी व्यवहार्य डेटा उपज चाहिए । महत्वपूर्ण बात, उपकरण सेटिंग्स बहुत प्रकार, उंर के आधार पर भिंन हो सकते हैं, और साधन की स्थिति का इस्तेमाल किया जा रहा; इस प्रकार, किसी भी उपकरण का उल्लेख मूल्यों अंय प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया उपकरणों के लिए विशिष्ट नहीं हो सकता है ।

  1. एक उपयुक्त तापमान (जैसे, ३७ डिग्री सेल्सियस), आर्द्रता (आमतौर पर > 95% सापेक्षिक आर्द्रता), और/या गैस एकाग्रता (उदा., 5% CO2) में कोशिकाओं के लिए उपयुक्त बनाए रखने के लिए पर्यावरणीय नियंत्रणों का उपयोग करके सभी इमेजिंग विश्लेषण निष्पादित करें प्रयोग की अवधि ।
  2. यदि सापेक्षिक आर्द्रता के उच्च मूल्यों का उपयोग कर, किसी भी सतहों कि humidified वातावरण के साथ संपर्क में आ सकता है रखने के लिए (उदा, माइक्रोस्कोप उद्देश्य) पर या थोड़ा तापमान जिस पर नमी को रोकने के क्रम में उत्पन्न होता है । यह एक उद्देश्य हीटर और/या हीटिंग टेप और एक उपयुक्त हीटर नियंत्रण के उपयोग के साथ पूरा किया जा सकता है ।
  3. सभी सूक्ष्मदर्शी घटकों को चालू करें और ४८८ पर अनुक्रमिक उत्तेजना के लिए आवश्यक सभी उपकरण सेट करें और ५१० एनएम के उत्सर्जन के साथ ४०४ एनएम । सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल विंयास के सभी घटकों को वास्तविक समय अधिग्रहण के लिए उचित रूप से सेट कर रहे हैं ।
  4. ३७ ° c, 5% CO2 वातावरण, और > 95% आर्द्रता पर निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए एक चरण-शीर्ष पर्यावरण चैंबर सेट करें । छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले, सभी पर्यावरण नियंत्रण के प्रारंभिक सेट अप के बाद कम से कम 10 मिनट के लिए पर्यावरण चैंबर equilibrate ।
    नोट: पर्यावरणीय स्थितियों का प्रयोग लंबाई, सेल प्रकार, और एक्सपोज़र के आधार पर समाप्त या समायोजित किया जा सकता है ।
  5. पर्यावरण चैंबर के भीतर मंच-शीर्ष पर कोशिकाओं के पकवान (कदम १.७) रखें ।
  6. वांछित उद्देश्य लेंस के साथ, ऐपिस और सफेद प्रकाश का उपयोग कर कोशिकाओं के फोकल विमान को खोजने के लिए, और सामान्य आकृति विज्ञान सुनिश्चित करें ।
    नोट: एक १.४ NA 60X वायलेट-सही, तेल में डूबे उद्देश्य लेंस आमतौर पर प्रयोग किया जाता है, जो intracellular डिब्बों की पहचान परमिट जबकि फोकल प्रणाली के ऑप्टिकल संकल्प अधिकतम ।
  7. दृश् य के फ़ील् ड में कक्षों की प्रतिदीप्ति व्यंजक की जांच करें । ऐसा करते समय एक उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति रोशनी के तहत कोशिकाओं visualizing, ऐसे fluorescein isothiocyanate (FITC) के रूप में । इस बिंदु पर, व्यापक क्षेत्र रोशनी का उपयोग करते हुए ऐपिस के माध्यम से देख रहे है और अधिक सुविधाजनक है क्योंकि यह पकवान स्थानांतरित करने के लिए कोशिकाओं के एक क्षेत्र का चयन करने के लिए आसान है अध्ययन । सामांय में, दृश्य के किसी फ़ील्ड का चयन करें जिसमें सेंसर को व्यक्त किए जाने वाले कम 5 से 10 कक्ष हों, जैसा कि हरी प्रतिदीप्ति द्वारा दर्शाया गया है ।
    1. वैकल्पिक रूप से, इस आकलन के लिए एक तरंग दैर्ध्य है कि सबसे अधिक सेंसर के साथ संगत है पर लेजर उत्तेजना का उपयोग कर व्यक्त किया जा रहा है (४८८ एनएम आम तौर पर सबसे अच्छा काम करता है) ।
      नोट: उनके आंतरिक फ्लोरोसेंट संपत्तियों के कारण, यह अधिक से अधिक या तो FITC या ४८८ एनएम का उपयोग कर roGFP2 व्यक्त की तुलना में हाइपर व्यक्त कोशिकाओं कल्पना करने के लिए मुश्किल हो जाएगा । हालांकि, यह अभी भी बेहोश कोशिकाओं को देखने के लिए संभव होना चाहिए ।
  8. एक बार देखने का एक वांछित क्षेत्र पाया जाता है, पर्यावरण चैंबर बंद ।
    नोट: ध्यान बनाए रखने की सुविधा का उपयोग करें, उंनत माइक्रोस्कोप पर अक्सर उपलब्ध खड़ा है, के लिए एक स्थिर फोकल विमान के अध्ययन में रखरखाव की सुविधा ।
  9. वांछित जोखिम अवधि के दौरान ब्याज के संवेदक का इष्टतम मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए अधिग्रहण पैरामीटर सेट अप करें । नीचे सिफारिशों और सेंसर प्रतिक्रियाओं के फोकल इमेजिंग के लिए दृष्टिकोण हैं:
    1. ४८८ एनएम पर उत्तेजना के लिए लेजर शक्ति और उत्सर्जन ५१० एनएम में समायोजित करें । एक लेजर शक्ति स्तर है कि कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है चुनें, और नमूनों के बीच यह लगातार रखने के लिए या व्यंजन दोहराने ।
      नोट: इस अध्ययन के लिए, 12% और १.५% लेजर शक्ति क्रमशः ४८८ और ४०४ एनएम लेजर लाइनों के लिए इस्तेमाल किया गया ।
    2. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के फोकल नियंत्रण का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि चयनित फोकल विमान है कोशिकाओं के केंद्र में अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता के लिए अनुकूलित किया गया है (z-अक्ष) ४८८ एनएम पर स्कैन करके z-विमान का समायोजन करते हुए । यह आसान एक उच्च लाभ सेटिंग का उपयोग करते हुए z-विमान है कि सबसे अधिक उजागर कोशिकाओं में परिणाम के लिए खोज के द्वारा किया जाता है । एक बार उपयुक्त फोकल विमान पाया गया है, एक सेटिंग है कि रिपोर्टर के प्रतिदीप्ति के लिए सबसे इष्टतम पिक्सल के बिना इस्तेमाल किया जा रहा मनाया जा रहा है लाभ वापसी ।
      नोट: लेजर और लाभ सेटिंग्स है कि खोज और प्रयोग के दौरान कोशिकाओं को देख के लिए उपयुक्त है पूरी तरह से फोकल प्रणाली का उपयोग किया जा रहा पर निर्भर है । सामांय में, एक बार कोशिकाओं को देखने के क्षेत्र में पाया गया है, यह अनुशंसित है कि लेजर शक्ति का एक ंयूनतम राशि (आमतौर पर ≤ 20%), उच्च संचालित लेजर लाइट का उपयोग कर कोशिकाओं के अत्यधिक स्कैनिंग के रूप में इस्तेमाल किया जा oxidative सेंसर द्वारा detectable परिवर्तन को प्रेरित कर सकते हैं ।
    3. आधारभूत प्रतिदीप्ति को फ़ाइन-ट्यून करने के लिए लाभ का उपयोग करें. roGFP2 के साथ, ऊपरी सीमा के पास आधार रेखा की स्थापना (≈ ९०% सापेक्ष तीव्रता) पर बिना संतृप्ति, के रूप में इन कोशिकाओं को ५१० एनएम ४८८ एनएम उत्तेजना द्वारा प्रेरित प्रतिदीप्ति खो देंगे जब ईGSH बढ़ जाती है । इसके विपरीत, ४८८ एनएम उत्तेजना के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता कम होना चाहिए (≈ 10% सापेक्ष तीव्रता) अति एक्सप्रेस कोशिकाओं के लिए आधारभूत पर, के रूप में इन कोशिकाओं ५१० एनएम प्रतिदीप्ति तीव्रता जब एच2ओ2 का पता चला है मिलेगा ।
    4. दोहराएँ कदम 2.9.2 और 2.9.3 पर उत्तेजना के साथ ४०४ एनएम और उत्सर्जन पर ५१० एनएम. ४०४ एनएम के लिए लाभ सेटिंग्स उत्तेजना तरंग दैर्ध्य प्रत्येक संवेदक के लिए ४८८ एनएम उत्तेजना के साथ इस्तेमाल करने वालों के विपरीत हैं (यानी, कम आधारभूत प्रतिदीप्ति (≈ 10% सापेक्ष तीव्रता) ४०४ एनएम पर roGFP2 के लिए, उच्च आधारभूत प्रतिदीप्ति (≈ ९०% सापेक्ष तीव्रता) के लिए एच2 हे2 सेंसर).
      नोट: सामांय में, प्रतिदीप्ति (५१० उत्सर्जन) ४०४ एनएम उत्तेजना में काफी कम हो जाएगा कि ४८८ एनएम उत्तेजना दोनों roGFP2 और हाइपर व्यक्त कोशिकाओं में के साथ प्राप्य, के रूप में ४०४ एनएम पीक है इन दोनों के लिए एक अपेक्षाकृत मामूली उत्तेजना अधिकतम सेंसर.

3. डाटा अधिग्रहण

  1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सेट अप करने के लिए क्रमिक रूप से उत्तेजित दो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (पहले ४८८ एनएम और फिर ४०४ एनएम) और दोनों के लिए उत्सर्जन में एक पूर्व निर्धारित समय अंतराल पर प्रयोग के वांछित लंबाई भर में इकट्ठा (उदाहरण के लिए कब्जा छवियों हर ६० ६० मिनट के लिए एस) ।
    1. वैकल्पिक रूप से, यदि ईGSH या H2O2 में परिवर्तन के अनुमानित समय का परीक्षण किया जा रहा xenobiotic के लिए जाना जाता है, तो इससे पहले कि और जोखिम के बाद मैंयुअल रूप से छवियां प्राप्त करें । हालांकि, यह लौकिक रिज़ॉल्यूशन की हानि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  2. प्रयोगात्मक मापदंडों के वास्तविक समय के आकलन के लिए, कम से 5-10 क्षेत्र में सेंसर एक्सप्रेस कोशिकाओं का चयन करें और उन्हें ब्याज के क्षेत्रों के रूप में स्थापित करें ("ROIs") प्रयोग के दौरान उनके प्रतिदीप्ति परिवर्तन पर नजर रखने के लिए.
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है, और प्रयोग के बाद किया जा सकता है यदि वास्तविक समय में प्रत्यक्ष अवलोकन अवांछनीय है या सॉफ़्टवेयर सीमाएं सतत निगरानी को रोकती हैं । सेल जनसंख्या के आधार पर, ROIs के रूप में सेंसर एक्सप्रेस कोशिकाओं का चयन कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के स्तर की एक सीमा का प्रतिनिधित्व हो सकता है.
    1. इन अध्ययनों के लिए, पर्यावरण विषाक्तता 9, 10-phenanthrenequinone (9, 10-PQ) या हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) एक 5 मिनट के आधारभूत अवधि के बाद जोड़ें ।
    2. इस प्रोटोकॉल में बाद में उपयोग के लिए सभी एजेंट तैयार करें ।  भंग 9, 10-dimethyl sulfoxide में PQ (DMSO) 15 मिमी की एकाग्रता के लिए, और बेसल सेल मीडिया में एक २५० µ मीटर काम समाधान उपज के लिए पतला ।  इसके अतिरिक्त, पानी में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के एक काम समाधान है कि इंजेक्शन पर 1mM की एक अंतिम एकाग्रता निकलेगा तैयार करते हैं ।
  3. एक बार प्रायोगिक मापदंडों को परिभाषित किया गया है, समय पाठ्यक्रम अधिग्रहण शुरू करते हैं । xenobiotic एक्सपोजर शुरू करने से पहले कम से 5 मिनट (या 5 डेटा अंक) की एक आधारभूत अवधि की स्थापना ।
  4. कोशिकाओं का पर्दाफाश करने के लिए विषाक्तता के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा रही है इन विट्रो खुराक । या तो पानी या अन्य उपयुक्त विलायक में घुलनशील यौगिकों तैयार है और मीडिया में सीधे सुई ।
    1. यदि कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे dimethyl sulfoxide या इथेनॉल) की आवश्यकता है, पर या ०.१% से नीचे अंतिम विलायक एकाग्रता रखो । सत्यापित करें कि विलायक ईGSH या कोशिकाओं की एक अलग डिश में एक वाहन नियंत्रण के साथ एच2ओ2 उत्पादन पर एक प्रभाव का उत्पादन नहीं करता है ।
    2. कम घुलनशीलता के साथ यौगिकों के लिए, इंजेक्शन किया जाता है के बाद प्रोटोकॉल के लिए एक micropipette का उपयोग कर एक मिश्रण कदम जोड़ें. पंप गैसीय जोखिम सीधे पर्यावरण चैंबर में उपयुक्त वाहक गैस मिश्रण का उपयोग कर ।
  5. जोखिम अवधि के दौरान प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की निगरानी । बाद इंजेक्शन की जरूरत के रूप में प्रदर्शन । बहुत ध्यान रखना इंजेक्शन के दौरान पकवान शिफ्ट नहीं है, इसलिए है कि एक ही कोशिकाओं को पूरे समय पाठ्यक्रम भर का पालन कर रहे हैं, जबकि एक ही फोकल विमान में imaged ।
  6. प्रयोग के अंत में, उपयुक्त नियंत्रणों के लिए कक्षों को अरक्षित करें । दोनों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर के लिए, ऑक्सीकरण करने के लिए जाना जाता यौगिकों के विशिष्ट सांद्रता जोड़ने और उनके ratiometric जवाबदेही के एक नुकीले प्रदर्शन में इन सेंसर को कम. एच2ओ2 और dithiothreitol (डीटीटी) ऑक्सीकरण और दोनों सेंसर को कम करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं । आमतौर पर, १००-१,००० µ एम एच2ओ2के अंतिम एकाग्रता, 1-5 mM dithiothreitol (डीटीटी) के बाद, उपयोगकर्ता पूरी तरह से ऑक्सीकरण और इन सेंसरों को कम करने के लिए अनुमति देता है ।
    1. इन अध्ययनों के लिए, अधिकतम सेंसर प्रतिसाद का निर्धारण करने के लिए 5 mm डीटीटी द्वारा फ़ॉलो 1 mm H2O2 का उपयोग करें ।
    2. सेंसर प्रतिसाद करने के लिए अनुमति दें, और उसके बाद एक कम करने एजेंट, जैसे डीटीटी, मैडम को कम करने के लिए और इसे प्रतिदीप्ति के स्तर पर या इसके स्थापित आधार रेखा के पास वापस करने के लिए कम 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
      नोट: इस चरण में नियंत्रणों का उपयोग सामांयीकरण के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रत्येक कक्ष में सेंसर की डायनेमिक श्रेणी निर्धारित करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के अंत में किया जाना चाहिए । roGFP2 के लिए, aldrithiol भी प्रयोग के अंत में जोड़ा जा सकता है । Aldrithiol बाईपास roGFP2 redox रिले सेंसर ऑक्सीकरण करने के लिए सीधे । यह xenobiotic एक्सपोजर के बाद सेंसर समारोह का आकलन करने के लिए उपयोगी है.

4. डेटा विश्लेषण

  1. यदि पहले से ही स्थापित नहीं है, तो कोशिकाओं के आसपास ROIs आकर्षित करने के लिए विश्लेषण किया जाएगा । समय पाठ्यक्रम में प्रत्येक तरंग दैर्ध्य पर प्रत्येक रॉय के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि कक्षों को खिसकाया नहीं था या रन के दौरान प्लेट शिफ्ट नहीं किया था ।
    नोट: ROIs की स्थापना के सबसे आसानी से एक संलग्न क्षेत्र है कि प्रत्येक कोशिका के फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति पैटर्न इस प्रकार ड्राइंग द्वारा पूरा किया है । आगे इस प्रक्रिया के साथ सहायता करने के लिए, एक संचारित प्रकाश (या brightfield) की स्थापना की क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं की छवि को सेल की सीमाओं को परिभाषित करने के प्रयासों में फ्लोरोसेंट छवि पर मढ़ा जा सकता है । हालांकि, एक संचारित प्रकाश छवि का उपयोग उपयोगकर्ता एक अतिरिक्त चैनल पर कब्जा करने के लिए की आवश्यकता है (छवियों का सेट) पूरे प्रयोग के दौरान । वैकल्पिक रूप से, कुछ निर्माताओं एल्गोरिदम अपने इमेजिंग सॉफ्टवेयर में शामिल है कि एक और अधिक मात्रात्मक, कम व्यक्तिपरक, विधि में ROIs स्थापित करने के लिए तीव्रता थ्रेसहोल्ड जैसे विशिष्ट मापदंडों का उपयोग करें ।
  2. डेटा को इच्छित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (उदा., इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट) में निर्यात करें.
  3. सूत्रों का उपयोग करते हुए प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक ROI के लिए ratiometric सेंसर प्रतिक्रिया की गणना करें:
    Equation 2
    Equation 3
  4. प्रत्येक समय बिंदु के लिए, सभी ROIs की परिकलित ratiometric मानों का औसत ।
  5. आधारभूत मान का परिकलन करें, जिसका उपयोग डेटा को सामान्य करने के लिए किया जाएगा, जो पहले परिकलित ratiometric मानों (चरण ४.४) का औसत करके xenobiotic के अतिरिक्त (उदा., पहले पाँच बार अंक) एकत्र करता है.
  6. सामान्य ratiometric मान से चरण ४.४ प्रत्येक मान ४.५ में परिकलित आधार रेखा मान द्वारा विभाजित कर । सामान्यीकृत अनुपात आधारभूत पर 1 के मूल्य के आसपास केंद्र होगा, जबकि ई में वृद्धिGSH या एच2ओ2 निम्नलिखित इंजेक्शन अनुपात को बढ़ाने के लिए कारण होगा. oxidative परिवर्तन के लिए प्रेरित xenobiotic के आकलन 3-6 बार आधार रेखा मान की श्रेणी में मान yield करने के लिए करते हैं ।
  7. के भीतर और प्रयोगों के पार प्रतिक्रियाओं की तुलना में सहायता करने के लिए, नियंत्रण ऑक्सीडेंट (उदा., 1 mM H2O2) के रूप में १००% के लिए प्रतिक्रिया को परिभाषित करके अधिक से अधिक सेंसर प्रतिक्रिया के प्रतिशत के रूप में सामान्यीकृत डेटा व्यक्त करते हैं ।
    नोट: अगर अधिक से अधिक सेंसर प्रतिक्रिया के प्रतिशत के रूप में डेटा व्यक्त, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि नियंत्रण ऑक्सीडेंट की एक ही एकाग्रता उपयोग में लगातार प्रयोग किया जाता है । सभी लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण से व्युत्पंन डेटा पारंपरिक जोड़ी के लिए उत्तरदाई है-बुद्धिमान और समूह वार सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अंवेषक के विवेक पर चुना जाएगा ।

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Representative Results

ईGSH और intracellular एच2ओ2 में परिवर्तन का पता लगाने में roGFP2 और हाइपर का उपयोग अच्छी तरह से पहले25,३६,४२,४३ बताया गया है और यहां का प्रदर्शन किया है । आधार रेखा पर roGFP2 व्यक्त करने वाले कक्षों की फोकल छवियां और H2O2 और डीटीटी के अतिरिक्त निंन चित्र 2में दिखाए गए हैं । प्रयोग भर में एकत्र छवियों से डेटा फिर निर्यात और विश्लेषण के रूप में प्रोटोकॉल की धारा 4 में वर्णित किया गया । दिखाया गया है, exogenous के अलावा एच2ओ2 एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रतिलिपि प्रतिक्रियाओं का उत्पादन जब डेटा उनके संबंधित आधारभूत और एक परिभाषित गतिशील रेंज के लिए सामान्यीकृत है ज्ञात exogenous के अलावा के माध्यम से स्थापित है oxidants/reductants (अर्थात, H2O2 और डीटीटी) (आंकड़े 3, 4 और 5) ।

विषाक्तता उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाएं आमतौर पर नियंत्रण द्वारा प्रेरित उन से अधिक चर रहे हैं । यह आशा की जानी है, के रूप में xenobiotic यौगिकों कोशिकाओं पर pleiotropic प्रभाव हो सकता है, redox सायक्लिंग से intracellular प्रोटीन के adduction को लेकर । roGFP2 और अति विषैले 9, 10-PQ, एक ऑक्सीकरण वायु phenanthrene४४के वायुमंडलीय प्रतिक्रियाओं द्वारा गठित प्रदूषक के लिए जोखिम से प्रेरित प्रतिक्रिया के उदाहरण, आंकड़े में प्रस्तुत कर रहे है 6 और 7। इन आंकड़ों में रेखांकन प्रोटोकॉल के खंड 4 में उल्लिखित डेटा विश्लेषण में शामिल प्रत्येक चरण की प्रगति को दर्शाते हैं । के रूप में दिखाया गया है, अपनी आधारभूत और सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 6बी) के लिए प्रत्येक कोशिका के सामान्यीकरण, कच्चे डेटा (चित्रा 6ए) से सेंसर प्रतिक्रिया की भयावहता में सेलुलर परिवर्तनशीलता कम कर देता है. मामलों में जहां सेलुलर प्रतिक्रिया में विचरण ब्याज की है, डेटा का सामान्यीकरण इस बिंदु तक किया जा सकता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं ग्राफ पर अपनी लाइनों के द्वारा प्रतिनिधित्व के साथ. परिमाण या एक ही डिश में कोशिकाओं के बीच प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स में भिंनता महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि है कि कोशिका चक्र में मतभेद, उदाहरण के लिए प्रतिबिंबित प्रकट कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, डिश में कोशिकाओं के औसत प्रतिक्रिया मानक विचलन (चित्रा 6सी) के साथ साथ प्रस्तुत किया जा सकता है । अंयथा, यदि अलग प्रयोगों की प्रतिकृति प्रस्तुत किया जा रहा है, डेटा सामान्यीकृत सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों या नियंत्रण ऑक्सीडेंट द्वारा प्रेरित अधिकतम प्रतिक्रिया का एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है (आंकड़े 3, 4, 5, और 6D), सभी का औसत दिखा रहा है माध्य के मानक त्रुटि के साथ प्रतिकृति । परिवेशी वायु contaminant 9, 10-PQ एक शक्तिशाली redox साइकिल चालक, जो हम परिकल्पना हाइड्रोजन पेरोक्साइड हाइपर द्वारा पता चला उत्पादन के चक्रीय चोटियों के लिए जिंमेदार है (चित्रा 7) और stepwise ईGSH roGFP2 द्वारा पता लगाया बढ़ता जाना जाता है ( चित्र 6 D) ।

Figure 1
चित्र 1 . roGFP2 glutathione redox रिले । Glutathione peroxidases (GPx) ऑक्सीकरण कम Glutathione (GSH) हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के जवाब में GSSG करने के लिए, इस प्रकार Glutathione redox क्षमता (ईGSH) बढ़ रही है । GSH (glutaredoxin) द्वारा ऑक्सीकरण होने पर intracellular EGrx के साथ fluorogenic सेंसर roGFP2 equilibrates । आगमनात्मक मार्ग में, Grx catalyzes deglutathionylation के माध्यम से roGFP2 की कमी के रूप में GSSG के स्तर में कमी और GSH के सामांय स्तर glutathione रिडक्टेस (जीआर) द्वारा NADPH की कीमत पर पुनर्स्थापित कर रहे हैं । NADPH pentose फॉस्फेट मार्ग (पीपीपी) के माध्यम से ग्लूकोज द्वारा आपूर्ति की है । गिब्स-Flournoy एट अल३५से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . मानव दमा उपकला कोशिका लाइन के फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों ब्यास-बी. ए. व्यक्त cytosolic roGFP2. कोशिकाओं को ४८८ एनएम (ए-डी), ४०४ एनएम (ई एच)के बाद में प्रबुद्ध थे । छवियाँ निम्न स्थितियों के लिए ५१० एनएम पर उत्सर्जित प्रतिदीप्ति दिखाएँ: बेसलाइन (ए, ई), १०० µ एम एच2ओ2(बी, एफ), 1 मिमी एच2ओ2 (सी, जी), और 5 मिमी डीटीटी (डी, एच). 60X योजना एपीओ कुलपति का उद्देश्य । स्केल पट्टियां 25 µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . ब्यास-बी कोशिकाओं में एच2ओ2 द्वारा प्रेरित roGFP2 में खुराक निर्भर परिवर्तन । कोशिकाओं phenol में 30 मिनट के लिए equilibrated थे-लाल मुक्त keratinocyte बेसल मीडिया (KBM) निवेश करने से पहले । एच2ओ2 के सभी जोड़ 5 min. roGFP2 प्रतिदीप्ति ५१० एनएम पर उत्सर्जित की एक आधारभूत अवधि के बाद हुई एक 525/30 एनएम बैंड पास फ़िल्टर का उपयोग कर एकत्र किया गया ४०४ और ४८८ एनएम में निंनलिखित लेजर उत्तेजना । सेलुलर प्रतिक्रियाओं उनके संबंधित आधार रेखा और अधिकतम सेंसर 1 मिमी एच2हे2के अलावा निंनलिखित प्रतिक्रिया करने के लिए सामान्यीकृत थे । मान ± मानक त्रुटि, n = 3, जहां n 5-10 स्वतंत्र कक्षों की एक औसत के होते हैं के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . ग्लूकोज की प्रतिक्रिया भूखे ब्यास-2 बी कोशिकाओं एच2ओ२की विभिन्न खुराकों के लिए roGFP2 व्यक्त. कोशिकाओं को एक ंयूनतम नमक मध्यम है कि जोखिम से पहले ग्लूकोज शामिल नहीं है में 2 घंटे के लिए equilibrated थे । एच2ओ2 के सभी जोड़ 5 min. roGFP2 प्रतिदीप्ति ५१० एनएम पर उत्सर्जित की एक आधारभूत अवधि के बाद हुई एक 525/30 एनएम बैंड पास फ़िल्टर का उपयोग कर एकत्र किया गया ४०४ और ४८८ एनएम में निंनलिखित लेजर उत्तेजना । सेलुलर प्रतिक्रियाओं उनके संबंधित आधार रेखा और अधिकतम सेंसर 1 मिमी एच2हे2के अलावा निंनलिखित प्रतिक्रिया करने के लिए सामान्यीकृत थे । मान मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, n = 3, जहां n 5-10 विशिष्ट कोशिकाओं के एक औसत के होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5। ब्यास की प्रतिक्रिया-बी के विभिंन खुराकों के लिए हाइपर व्यक्त कोशिकाओं एच 2 हे 2 . कोशिकाओं phenol में 30 मिनट के लिए equilibrated थे-लाल मुक्त KBM जोखिम से पहले । एच2ओ2 के सभी जोड़ 5 min. प्रतिदीप्ति ५१० एनएम पर उत्सर्जित की एक आधारभूत अवधि के बाद हुई एक 525/30 एनएम बैंड पास फ़िल्टर का उपयोग कर एकत्र किया गया था ४०४ और ४८८ एनएम में निंनलिखित लेजर उत्तेजना । सेलुलर प्रतिक्रियाओं उनके संबंधित आधार रेखा और अधिकतम सेंसर 1 मिमी एच2हे2के अलावा निंनलिखित प्रतिक्रिया करने के लिए सामान्यीकृत थे । मान मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, n = 3, जहां n 5-10 विशिष्ट कोशिकाओं के एक औसत के होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6। 9, PQ-2-बी ब्यास roGFP2 एक्सप्रेस कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएं प्रेरित। कोशिकाओं phenol में 30 मिनट के लिए equilibrated थे-लाल मुक्त KBM जोखिम से पहले । 25 µ एम 9 के अलावा, 10-मिश्रण के साथ PQ 5 मिनट में हुई, 20 मिनट और 5 मिमी डीटीटी पर 24 मिनट में 1 मिमी एच2ओ2 के अलावा द्वारा पीछा किया । पैनल एक डिश में व्यक्तिगत कोशिकाओं के कच्चे roGFP2 अनुपात, प्रत्येक कोशिका एक अलग लाइन के द्वारा प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है । पैनल B प्रत्येक व्यक्ति कक्ष के मानों को उसकी आधारभूत सेंसर प्रतिदीप्ति से सामांय दिखाता है, और इस डेटा का औसत और मानक विचलन कक्ष Cमें व्यक्तिगत सामान्यीकृत अनुपातों पर आरोपित होता है । सभी कक्षों में औसत रूप से अधिक सेंसर प्रतिक्रिया का प्रतिशत पैनल Dमें दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 .9, 10-PQ--बी. ए. हाइपर व्यक्त कोशिकाओं की प्रतिक्रिया प्रेरित । कोशिकाओं phenol में 30 मिनट के लिए equilibrated थे-लाल मुक्त KBM जोखिम से पहले । के अलावा 25 µ m 9, 10-मिश्रण के साथ PQ 5 मिनट में हुई, 20 मिनट में 1 मिमी एच2हे2 के अलावा और 5 मिमी डीटीटी पर 25 min. प्रतिदीप्ति पर उत्सर्जित ५१० एनएम एक 525/30 एनएम बैंड पास फ़िल्टर का उपयोग कर एकत्र किया गया था पर ४०४ और ४८८ एनएम लेजर उत्तेजना के बाद । सेलुलर प्रतिक्रियाओं उनके संबंधित आधार रेखा और अधिकतम सेंसर 1 मिमी एच2हे2के अलावा निंनलिखित प्रतिक्रिया करने के लिए सामान्यीकृत थे । मान 5-10 विशिष्ट कक्षों के माध्य के रूप में प्रस्तुत किए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

intracellular E में परिवर्तन का पता लगाने में roGFP2 और हाइपर का उपयोग करेंGSH और एच2ओ2, क्रमशः, पिछले शारीरिक और विषाक्तता अध्ययन में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है 25,३५,३६ ,३९,४०,४१,४२,४३. प्रोटोकॉल यहां उल्लिखित एक प्रभावी तरीका है इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग redox सेंसर को लागू करने का इशारा विषाक्तता अध्ययन में intracellular redox homeostasis के xenobiotic प्रेरित perturbations का आकलन करने के लिए डिज़ाइन की रिपोर्ट । सबसे महत्वपूर्ण बात, इन सेंसर के समुचित उपयोग के लिए किसी भी एक विशिष्ट redox जोड़ी या ROS (ईGSH या एच2ओ2), अंततः कई पारंपरिक oxidative तनाव दृष्टिकोण के साथ विशिष्टता की कमी को स्पष्ट करने के लिए मनाया परिवर्तन लिंक । इन सेंसरों से उत्पंन आंकड़ों की गुणवत्ता आश्वस्त करने में, कुछ पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब प्रयोग डिजाइन और विश्लेषण/ वे शामिल हैं: 1) उचित नियंत्रण, 2) उचित सेंसर प्रतिक्रियाओं के सत्यापन का उपयोग करें, और 3) स्पष्ट तंत्र के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों में हेरफेर । इनमें से, exogenous के अलावा एच2ओ2 और डीटीटी अवलोकन अवधि के अंत में नियंत्रण के रूप में कई प्रयोजनों के कार्य करता है । सबसे पहले, यह एक को विषाक्त जोखिम के लिए प्रतिक्रिया की भयावहता का आकलन करने का अवसर affords अधिक से अधिक और ंयूनतम सेंसर से प्राप्त संकेतों के सापेक्ष । यह प्रयोगों के बीच तुलना के लिए प्रतिक्रियाओं को सामान्य करने में सबसे उपयोगी है. इसके अलावा, मजबूत exogenous ऑक्सीडेंट और प्रतिआगमनात्मक उत्तेजनाओं के साथ प्रयोग को समाप्त कर संवेदक/रिले अखंडता पर पूर्ववर्ती जोखिम के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकते हैं । इसके अलावा, aldrithiol को चलाने के अंत में जोड़ा जा सकता है रिले बाईपास और सेंसर की कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए सीधे संभावित क्षति है कि जोखिम fluorophore खुद को दण्डित किया है हो सकता है ।

बस के रूप में अंय तकनीकों के साथ, जब विषाक्तता परिणामों के विशिष्ट परीक्षा के लिए इस पद्धति को लागू करने, यह गुणात्मक मूल्यांकन किया टिप्पणियों की सटीकता के बारे में बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । जब किसी भी नए xenobiotic के साथ roGFP2 या हाइपर का उपयोग यह पहली खुराक की एक श्रृंखला का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि यह सुनिश्चित करना है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता (५१० एनएम उत्सर्जन) से प्रत्येक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (४०४ एनएम और ४८८ एनएम) परिवर्तन उचित (यानी वृद्धि या कमी) के लिए redox मैडम इस्तेमाल किया जा रहा है । लक्ष्य के लिए एक खुराक है जिस पर एक सेंसर प्रतिक्रिया पता लगाने योग्य है की पहचान है, लेकिन सेंसर या यौगिक के अन्य गैर विशिष्ट प्रभाव के प्रकट हेरफेर से अभिभूत नहीं है. प्रत्यक्ष adduction या सेंसर को नुकसान या तो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (४८८ या ४०४ एनएम) पर प्रतिदीप्ति में असामान्य परिवर्तन के रूप में प्रकट हो सकता है । स्थितियों में, जहां या तो सेंसर लगातार जोखिम भर में एक जहरीले के अलावा करने के लिए अनुपयुक्त प्रतिक्रिया करने के लिए मनाया गया है, यह अनुशंसित है कि जांचकर्ता dosimetry, सेल के संबंध में प्रयोगात्मक मापदंडों की जांच पर विचार व्यवहार्यता, सेंसर अभिव्यक्ति, और/के लिए प्रतिक्रियाओं का पालन किया जा रहा इंस्ट्रूमेंटेशन के ऑप्टिकल/

किसी भी विषाक्तता readout के साथ के रूप में, प्राप्त डेटा आमतौर पर अधिक सार्थक है जब मनाया प्रतिक्रियाओं की जांच या एक यंत्रवत दृष्टिकोण का उपयोग कर पुष्टि कर रहे हैं, और प्रयोगात्मक सीमाएं माना जाता है । इस अंत करने के लिए, सेंसर के निहित गुणों के साथ संयुक्त कई प्रयोगात्मक मापदंडों मजबूत redox आकलन उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । जांच roGFP2 संवेदक के उपयोग के लिए विशिष्ट अंततः redox रिले के माध्यम से जो roGFP2 होश ईGSH (चित्रा 1) की चिंता । रिले glutaredoxin (Grx), glutathione रिडक्टेस (जीआर), और glutathione peroxidase (GPx) सहित intracellular एंजाइमों, शामिल है । दोनों सेलुलर डिब्बों और सेल प्रकार भर में Grx के अंतर्जात स्तर में अंतर ईGSH की माप को प्रभावित और प्रयोगों के बीच तुलना करना मुश्किल४३कर सकते हैं । इस समस्या को हल करने के लिए, "फ्यूजन जांच" की एक श्रृंखला संश्लेषित किया गया है, जो प्रासंगिक एंजाइम सीधे roGFP2 संवेदक को लिंक. हाल ही में, मानव Grx-1 Gutscher और सहकर्मियों के द्वारा roGFP2 से जोड़ा गया था३२ के लिए फार्म Grx1-roGFP2 । roGFP1 से एक बड़ा गतिशील सीमा होने और पीएच असंवेदनशील होने के अलावा, Grx1-roGFP2 सेल प्रकार या डिब्बों में ईGSH की निगरानी कर सकते है जिसमें Grx गतिविधि अंयथा सीमित होगा । कक्ष प्रकार में या यहां तक कि एक ही डिश में कोशिकाओं के बीच में NADPH स्तरों में अंतर भी roGFP2 प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकते हैं । NADPH pentose-फॉस्फेट मार्ग के माध्यम से ग्लूकोज से उत्पादित है, और GSSG (चित्रा 1) को वापस GSH को कम करने के लिए glutathione रिडक्टेस (जीआर) द्वारा उपयोग किया जा सकता है । यदि एक ही क्षेत्र में कोशिकाओं को विभिंन कम करने की क्षमता के साथ प्रयोग शुरू, उनके ईGSH परिवर्तन और परिणामस्वरूप एक उत्तेजना के लिए roGFP2 प्रतिक्रियाओं वर्दी नहीं हो सकता है । इस समस्या का प्रयोग करने से पहले ग्लूकोज भुखमरी की अवधि के माध्यम से दूर किया जा सकता है, जो सेलुलर NADPH शेयरों और संगत roGFP2 प्रतिक्रियाओं घट जाती है । ईGSH वसूली के लिए एक कम क्षमता भी 25 µ एम एच2में2 खुराक में देखा जा सकता है कोशिकाओं है कि ग्लूकोज के भूखे थे के रूप में सामान्य ग्लूकोज सांद्रता के साथ पूरक कोशिकाओं की तुलना में (आंकड़े 3 और 4). इस प्रकार, ग्लूकोज भुखमरी के माध्यम से NADPH स्तर के हेरफेर एक सेंसर करने के लिए एक xenobiotic जोखिम के प्रभाव transducing में कई रिले घटकों की भागीदारी की जाँच करने के लिए एक साधन के रूप में सेवा कर सकते हैं. एक अंय चिंता का विषय है जब एक विषाक्तता संदर्भ में roGFP2 का उपयोग कर xenobiotic के लिए क्षमता के लिए सेंसर ऑक्सीकरण में सीधे बातचीत, बजाय redox रिले के माध्यम से अभिनय के लिए ईGSHबदल रहा है । roGFP2 के प्रत्यक्ष ऑक्सीकरण redox रिले के प्रत्येक बिंदु की जांच और roGFP2 संकेत पर इसके प्रभाव का आकलन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । एक उत्तेजना के रूप में ओजोन का उपयोग कर इस तकनीक का एक उदाहरण के अध्ययन में गिब्स ने प्रदर्शन किया है-Flournoy एट अल ३५।

एच2ओ2 सेंसर के साथ प्रयोग के लिए, इसके बाद के संस्करण चिंताओं के रूप में प्रासंगिक नहीं हैं, हाइपर इंद्रियों एच2ओ2 के OxyR1 डोमेन के रूप में सीधे बजाय एक redox रिले के माध्यम से । हालांकि, roGFP2 के विपरीत, एच2ओ2 सेंसर पीएच में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, जो एक प्रयोग के दौरान एच2ओ2 के कारण नहीं प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पैदा कर सकता है । इस कारण से, ठीक से बफर मीडिया का उपयोग, एक पर्यावरण चैंबर वांछित तापमान बनाए रखने के लिए, और वाहन नियंत्रण के उपयोग के किसी भी एच2हे2 सेंसर का उपयोग प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अतिरिक्त, fluorogenic सेंसर विशेष रूप से पीएच, जैसे pHRed, जो लाल चैनल में प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है और भी हाइपर४५व्यक्त कोशिकाओं में सह-व्यक्त किया जा सकता है की निगरानी करने के लिए विकसित किया गया है । एच2ओ2 सेंसर के लिए आदर्श पीएच नियंत्रण SypHer है, जो एच2ओ2 सेंसर का एक संस्करण है कि एक भी अंक उत्परिवर्तन यह भावना एच2हे2करने में असमर्थ प्रतिपादन किया है, अभी तक पीएच के लिए जवाबदेही को बरकरार रखता है ४६. यह भी देखा गया है कि कोशिकाओं एच2ओ2 सेंसर व्यक्त equilibrate के लिए एक लंबी आधारभूत अवधि की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से विश्लेषण की साइट के लिए एक मशीन से ले जाया जा रहा है, जिसके दौरान वे अनुभव मीडिया के तापमान और पीएच में मामूली परिवर्तन । यह आधार रेखा किसी भी जोखिम शुरू करने से पहले स्थिर हो गया है के बाद कम से 5 डेटा अंक प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है ।

इस विधि में चर्चा की सेंसर, roGFP2 और हाइपर, कई fluorogenic सेंसर कि विषविज्ञान के क्षेत्र में उभरते अनुप्रयोगों की एक किस्म है के दो हैं. इसमें न केवल ईGSH और एच2ओ2का पता लगाने के लिए डिजाइन किए गए सेंसर शामिल हैं, लेकिन peroxynitrite४७, नाइट्रिक ऑक्साइड४८,४९, और यहां तक कि ओजोन५०. इन सेंसरों लाइव सेल इमेजिंग अध्ययनों में विशेष रूप से और संवेदनशील ब्याज की oxidative प्रजातियों की निगरानी करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस तरह वर्णक्रमीय मिश्रण के रूप में तकनीक में अग्रिम के साथ, यह भी एक ही सेल में (एक दूसरे के 5 एनएम के भीतर) समान वर्णक्रमीय विशेषताओं के साथ सह-एक्सप्रेस दो सेंसर करने के लिए संभव है, और प्रत्येक संवेदक द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के अनुपात को अलग करें५१ . इस तकनीक roGFP2 और हाइपर के लिए विशेष रुचि का है, के रूप में वे एक ही तरंग दैर्ध्य में उत्तेजित और उत्सर्जन शामिल है । के रूप में संक्षेप में यहां उल्लेख किया है, कुछ सेंसरों विशिष्ट intracellular डिब्बों, जैसे mitochondria के लिए लक्षित किया जा सकता है, ब्याज की oxidative घटनाओं का निरीक्षण । हालांकि इन उभरते सेंसरों और तकनीकों इस विधि के दायरे से बाहर हैं, पाठक intracellular redox सेंसर के विषय पर कई हाल के प्रकाशनों के लिए भेजा जाता है, जैसे मजदूरी और सहयोगियों द्वारा समीक्षा५२. लाइव सेल इमेजिंग के साथ आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर का उपयोग विषाक्तता आकलन के दौरान oxidative प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक मजबूत उपकरण है ।

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Disclosures

इस लेख में वर्णित अनुसंधान राष्ट्रीय स्वास्थ्य और पर्यावरणीय प्रभाव अनुसंधान प्रयोगशाला, अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी द्वारा की समीक्षा की गई है, और प्रकाशन के लिए मंजूरी दे दी । इस अनुच्छेद की सामग्री को एजेंसी की नीति का प्रतिनिधित्व नहीं लगाया जाना चाहिए, न ही व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख है समर्थन या उपयोग के लिए सिफारिश का गठन ।

Acknowledgments

लेखक प्रयोगात्मक डिजाइन और पांडुलिपि संपादन के साथ सहायता के लिए Katelyn Lavrich शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
roGFP2 Plasmid University of Oregon N/A Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid Evrogen FP941
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009
Dithiothreitol Sigma Aldrich 10708984001
9,10-Phenanthrenequinone Sigma Aldrich 156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes Ted Pella 14029-20
BEAS-2B cell line American Type Culture Collection CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium Lonza 192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Excel  Microsoft Office Suite N/A
NIS-Elements AR Imaging Software Nikon N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System Nikon N/A

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३२ Oxidative तनाव विषविज्ञान प्रतिदीप्ति लाइव सेल इमेजिंग Glutathione हाइड्रोजन पेरोक्साइड
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Corteselli, E. M., Samet, J. M.,… More

Corteselli, E. M., Samet, J. M., Gibbs-Flournoy, E. A. Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors. J. Vis. Exp. (132), e56945, doi:10.3791/56945 (2018).

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