Summary
이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.
Abstract
산화 스트레스는 일반적으로 인용된 독물학 메커니즘, 공부를 기존의 방법 샘플, 잠재적인 유물의 소개와는 반응에 대 한 특이성의 부족의 파괴를 포함 하 여 결점의 수에서 고통 받는 종 관련된입니다. 따라서, 비-파괴, 민감한, 그리고 특정 방법 관찰 하 고 계량 세포내 산화 환 원 섭, 더 일반적으로 산화 스트레스 라고 하는 데 사용할 수에 대 한 독성의 분야에서 현재 필요가 하다. 여기, 우리는 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서, roGFP2 및 하이퍼 xenobiotic 유발 산화 응답 관찰 라이브 셀 이미징 연구에 사용할 수를 사용 하는 방법을 제시. roGFP2 하이퍼 동안 티 redox 잠재적인 (EGSH)와 함께 equilibrates 과산화 수소 (H2O2)를 직접 감지. 두 센서 transfection 또는 변환을 통해 다양 한 세포 유형으로 표현 될 수 있다 그리고 특정 세포 구획을 대상 수 있습니다. 가장 중요 한 것은, 라이브 셀 현미경이이 센서를 사용 하 여 기존의 방법을 사용 하 여 가능 하지 않은 높은 공간 및 시간 해상도 제공 합니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 404에 의해 순차적으로 흥분 때 판독으로 510 nm 역할에서 모니터링 하는 형광 강도 변화 nm, 488 nm 빛. 이 속성은 두 센서 비율, 일반적인 현미경 아티팩트를 제거 하 고 센서 식 셀 사이의 차이 대 한 수정. 이 방법론 confocal 이미징 시스템, 기존의 와이드 필드 현미경 검사 법, 그리고 접시와 함께 사용을 위해 적당 한 만드는 소정의 파장에 흥분 하 고 수집 방출의 fluorometric 플랫폼의 다양 한 적용 독자입니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 세포 EGSH 및 H2O2 세대 실시간으로 모니터링 하 다양 한 세포 유형 및 독물학 연구에에서 사용 되었습니다. 여기에 설명 된 세포 유형 및 산화 스트레스의 라이브 세포 독성 평가에 roGFP2 및 하이퍼의 응용 프로그램에 대 한 fluorometric 플랫폼에 걸쳐 널리 적응력은 표준화 된 방법이입니다.
Introduction
용어는 "산화 스트레스" 자주 인용 독성, 메커니즘으로 아직 거의 구체적으로 설명 하는이 용어가입니다. 산화 스트레스 반응성 산소 종, 자유 래 디 칼, 항 산화 분자의 산화에의 한 피해의 세대를 포함 하 여 여러 가지 세포내 프로세스를 참조할 수 있습니다 그리고 심지어 특정 시그널링의 활성화 폭포. 다양 한 환경 오염 물질1,2 , 제약 에이전트3,4 5 xenobiotic 화합물 자체의 어느 직접 행동에 의해 산화 스트레스를 유발 하 문서화 되었습니다. 6 또는 이차 세포 응답7,8,,910의 일환으로 산화 종의 생산. 그것은 그러므로 정확 하 게 관찰 하 고 불리 한 결과에 지도 하는 산화 과정을 특성화 독성에 큰 관심의. 산화 스트레스 측정의 종래의 방법 포함 산화 쓰이므로11,12,13,,1415 또는 산화 방지 제16의 식별 ,17,18,,1920또는 스스로21,,2223, 반응 종 직접 측정 24. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 자주 사용 샘플, 공간 해상도 제거 하 고 잠재적으로 소개 하는 유물25는 세포 장애, 필요 합니다. 산화 제 종류의 검출 및 산화 긴장의 표시에 대 한 더 과민 하 고 특정 메서드의 개발 xenobiotic 노출의 부작용의 조사에 광범위 하 게 적용 됩니다.
라이브 셀 현미경 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서의 새로운 세대를 사용 하 여 살아있는 세포의 세포내 산화 환 원 상태를 모니터링 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 이 센서는 일반적으로 바이러스 성 발기인 transfection 또는 변환 방법론을 통해 도입의 통제 벡터를 사용 하 여 표현 됩니다. 이후 세포 형광 센서 표현 확인 될 수 있다 쉽게 시각적으로 높은 식 효율성 필요 하지 않습니다. 독성 학적 평가 대 한 이러한 센서를 표현 하는 세포로 그들은 실시간으로 xenobiotic 화합물에 노출 되는 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 수 있다. 이 실험 설계 반복된 측정 동일한 셀에 각 셀의 설립된 기준 자체 컨트롤 역할을 수 있도록 허용 합니다. 라이브 셀 이미징 업체 높은 시간 해상도 겸손 한 크기 또는 자연에 과도에 특히 그 산화 이벤트의 검출에 적합. 그들의 표적 분자에 과민 하 고 특정 되 고, 뿐만 아니라 이러한 센서 들의 형광 빛의 두 파장을 사용 하 여 흥분 수 있습니다. 이 현상을 수 정통 센서 응답 인공 센서 식, 셀 두께, 램프에 변화 등으로 인 한 그와 관련 된 신호 변경의 분별을 허용 하는 비율으로 표현 될 형광 방출 강도, photobleaching, 고26형광 검출기 감도. Fluorogenic 센서의 사용의 또 다른 장점은 그들은 공간 해상도 기존의 방법25,,2627여 일치의 수준을 만드는 특정 세포 구획을 타겟팅 할 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)에 따라 유전자 인코딩 센서의 큰 가족 개발 되 고 생리 마커, ATP/ADP 비율25, 칼슘 농도, 온도, pH 등의 광범위 한 다양 한 보고서를 특징 ,,2829,,3031. 이 중 티 산화 환 원 잠재력 (EGSH)와 과산화 수소 (H2O2)의 센서는 있습니다. 이러한 센서는 산화 환 원 생물학 및 생리학에 응용 프로그램에 대 한 개발 되었다, 그러나 그들은 또한 xenobiotic 유발 산화 스트레스 공부에 적응 했습니다. 특히, 여기에 설명 된 프로토콜 EGSH 센서 roGFP2 및 H2O2 센서 하이퍼의 사용을 설명 합니다.
roGFP2는 세포내 감소와 산화 glutathione의 (GSH/GSSG) 티 과산화 효소 (메타), glutaredoxin (Grx)과 티 reductase redox 릴레이 통해 산화 환 원 잠재력에 보고 (GR) (그림 1)25, 32 , 33. 티 주된 세포 항 산화 분자 이며 cytosol25,34millimolar 농도에서 그것의 감소 된 모양 (GSH)에 주로 존재 하는. EGSH 하지 어떤 기능 결과에 연결 되어있다, 하는 동안 세포내 산화 상태34의 중요 한 지표로 인식 된다. GSSG의 농도에서 상대적으로 작은 증가 roGFP2에 의해 감지 되는 EGSH 증가 발생 합니다. 똑같이 중요 한, EGSH 의 모니터링 xenobiotic 노출 동안 roGFP2를 사용 하 여 수 잠재적으로 redox 릴레이에 여러 지점에서 행동의 메커니즘에 대해 많이 고 공개 pentose 인산 염 등 관련된 경로 션트 (그림 1 )35. 여기 두 번째 센서, 하이퍼는 세균 H2O2의 규제 도메인에 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 삽입에서 파생 된 세포내 H2O2 조사-중요 한 전사 OxyR136요소. H2O2 생리 조건37, 에서 중요 한 세포내 신호 분자로 점점 인식 되 고는 이전 되었습니다 간주 됩니다 손상 반응 산소 중간, 비록 38, H2O2 에 대 한 인식할 수 없는 역할 뿐만 아니라 독극물에 존재 하는 것을 건의. 예를 들어, 초과 H2O2 xenobiotic 노출에 의해 유도 된 세포질 신호 또는 생체 변화에 dysregulation 전조 수 있습니다.
두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서 여러 설립된 셀 라인, 인간의 해 암 세포 선 A431 등 인간 기관지 상피 세포 선 BEAS-2B, EGSH 및 H2에서 변화를 관찰 하에 표현 O2 다양 한 독성 노출에 대 한 응답에서. 가스 오염 물질 (오존35), 미 립 자 물질 (1, 2 naphthoquinone39,40 와 아연41), 그리고 니켈 나노 입자 (되지 않은 데이터)의 수용 성 구성 요소 포함 됩니다. 이러한 연구는 이러한 두 센서의 가능한 응용 프로그램의 작은 하위 집합만을 나타냅니다. 이론적으로, 수신 하 고 기존의 분자 생물학 기법을 통해 이러한 센서의 DNA를 표현 할 수 있는 모든 세포 유형 xenobiotics 세포 산화 상태를 변경 하는 의심의 효과 평가 하기 위해 활용할 수 있습니다. 날짜 하려면, 하나 이상의 이러한 센서의 다양 한 원핵생물과 진핵생물, 등 여러 포유류, 식물, 박테리아, 효 모 세포 종류25,26,,3642표현 되었습니다. EGSH 및 H2O2 센서에 대 한 판독은 510에서 방출 하는 형광의 강도에 변화 nm 404 488 nm 빛과 여기에. 이 메서드는 fluorometric 플랫폼, 다양 한 종류의 현미경 (confocal 및 넓은 필드)와 판 독자를 포함 하 여 널리 적응. 여기에 제시 된 방법은 체 외에서 독성 시스템에 O2 세포내 전자GSH 및 H2의 민감하고 구체적인 관찰에 대 한 있습니다.
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Protocol
1입니다. 셀의 준비
참고:이 절차는 불멸 하 게 셀 라인 (BEAS-2B; lentiviral 변환을 설명 합니다. ATCC, 머내서스, VA) 원하는 기자 roGFP2 (하이퍼)을 표현 하. 다른 셀 라인/형식 및 유전자 이동, transfection, 등의 방법으로 그들은 기자 식 시각화 보기의 필드 (일반적으로 5-10의 세포) 당 센서 표현 세포의 충분 한 수를 적절 한 수준에서 결과 활용할 수 있습니다. 분석 방법에 대 한 궁극적으로 사용 될 접시에 절차를 수행 해야 경우 transfection 방법 (예: transfect 현미경에 나타납니다 같은 접시에 셀). 아래 설명 하는 단계 6-잘 셀 문화 판에서 셀 transductions 준비에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 이 형식이 원하는 응용 프로그램에 대 한 적절 한 크기, 다른 배를 교체하실 수 있습니다.
- 정상적인 성장 미디어에 약 40-60% 합류 세포 성장.
참고:이 연구는 인간 기관지 상피 세포 선, BEAS-2B keratinocyte 성장 매체 (KGM)에서 재배를 활용. - 변환, 직전 셀에 성장 매체를 수식에 의해 계산으로 바이러스의 적절 한 금액을 포함 하는 혈 청 자유로운 미디어의 500 µ L 바꿉니다.
- BEAS 2B 셀의 변환에 대 한 혈 청 무료 keratinocyte 기저 매체 (KBM) 사용 하 여 바이러스 성 외피 동안 KGM 성장 매체를 대체.
참고: 위의 계산 셀 6 잘 형식에의 한 잘 단일 변환입니다. 필요한 경우, 수행의 여러 transductions 우물 불리고 수 하는 우물의 수 곱셈와 수식을 조정 하 여 수행할 수 있습니다. 5와 20 사이 감염 (MOI)의 다양성을 사용 하 여 lentiviral transductions에 대 한 있습니다. Adenoviral transductions 100과 500 사이의 나 사용 하 여.
- BEAS 2B 셀의 변환에 대 한 혈 청 무료 keratinocyte 기저 매체 (KBM) 사용 하 여 바이러스 성 외피 동안 KGM 성장 매체를 대체.
- 37 ° C 4 h, 간단한 락으로 30 ~ 60 분 마다 접시에 바이러스 성 입자를 재배포 또는 모션 소용돌이에서 바이러스 혼합 셀을 품 어.
- 접시에 완전 한 성장 매체의 1 mL을 추가 하 고 추가 4-16 h는 37 ° C에서 품 어.
- 모든 미디어를 제거 하 고 신선한 완전 한 성장 매체를 바꿉니다.
- 계속 성장 하 고 셀 통로, 필요에 따라 확장 합니다.
참고: 셀 appreciably 표현 12-48 시간 내 센서를 시작 한다. Lentiviral 벡터 변환에 대 한 사용 되었습니다, 원하는 센서의 안정적인 식 구절에 걸쳐 계속 해야 합니다. - 현미경-기반 평가 대 한 유리로 씨 셀 현미경 요리 바닥과 이미징 전에 원하는 합류 (≥70-80%)을 성장.
참고: 밀도 시드 접시 크기, 사용 되 고 세포 선의 성장 율 시드 다음과 같은 평가의 시간에 따라 달라 집니다. 예를 들어 씨앗 300000 BEAS 2B 세포 성장의 1 일 후 약 70-80% 합류를 35 mm 접시에.
2. 현미경 설치
참고: 아래에 설명 된 프로토콜 404 및 488 nm 레이저 라인을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 수행 됩니다. 그들의 처방된 업무가/방출에이 프로토콜에서 설명 하는 센서의 fluorometric 평가 만들기의 다른 방법을 해야 합니다 또한 가능한 데이터 얻을 수 있습니다. 중요 한 것은, 장비 설정 유형, 나이, 악기 사용 되 고;의 상태에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 따라서, 어떤 악기 값을 언급 한 다른 실험실에서 사용 하는 장비에 특정 하지 않을 수 있습니다.
- 적절 한 온도 (예를 들어, 37 ° C) 습도 유지 하기 위해 환경 제어를 사용 하 여 모든 이미징 분석 수행 (일반적으로 > 95% 상대 습도), 및 가스 농도 (예를 들면, 5% CO2) 걸쳐 셀에 대 한 적합 한는 실험의 기간입니다.
- 상대 습도의 높은 값을 사용 하는 경우 유지 습도 분위기 접촉 수 있습니다 어떤 표면 든 지 (예., 현미경 목표) 이상 약간 온도에 습도 응축을 방지 하기 위해 생성 됩니다. 이 객관적인 히터 테이프 및 적절 한 히터 제어 난방의 사용으로 수행할 수 있습니다.
- 현미경의 모든 구성 요소를 켜고, 510에서 방출 된 488 고 404 nm에서 순차 구동에 필요한 모든 장비를 설정 nm. 광 구성의 모든 구성 요소 실시간 획득에 대 한 적절 하 게 설정 되어 확인 하십시오.
- 37 ° c, 5% CO2 분위기, 일정 한 온도 유지 하기 위해 무대 상단 환경 챔버 설정 및 > 95% 습도. 이미지 수집을 시작 하기 전에 모든 환경 컨트롤의 초기 설정 후 적어도 10 분 동안 환경 챔버를 equilibrate.
참고: 환경 조건 제거 또는 실험 길이, 셀 형식, 사용 되 고 노출에 따라 조정 될 수 있습니다. - 환경 챔버 내 무대 위에 셀 (단계 1.7)의 접시를 놓습니다.
- 원하는 대물 렌즈와 접 안 렌즈와 하얀 빛을 사용 하 여 셀의 초점면 찾아서 정상적인 형태를 보장.
참고: 1.4 나 60 X 바이올렛-수정, 오일 몰입 렌즈 일반적으로 사용을 허용 하는 confocal 시스템의 광학 해상도 극대화 하면서 세포내 구획의 식별. - 보기의 필드에 있는 셀의 형광 식을 확인 합니다. 적절 한 필터 세트, fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 넓은 필드 형광 조명 아래 셀을 시각화 하는 동안 그것을 할. 이 시점에서, 사용 하 여 넓은 필드 조명 동안 있기 때문에 쉽게 공부 하는 셀의 필드를 선택 하려면 요리를 이동 하는 접 안 렌즈를 통해 보고 하는 것이 더 편리. 일반적으로, 녹색 형광으로 표시, 센서를 표현 하는 적어도 5 ~ 10 셀을 포함 하는 필드의 보기를 선택 합니다.
- 또는, confocally 표현 되는 센서와 가장 호환 되는 파장에서 레이저 여기를 사용 하 여이 평가 수행 (488 nm는 일반적으로 최고의 작품).
주: 그들의 본질적인 형광 속성으로 인해 그것은 더 어려울 것 이다 어느 FITC를 사용 하 여 그 표현 roGFP2 보다 하이퍼를 표현 하는 세포를 구상 하 또는 488 nm. 그러나, 그것은 여전히 희미 한 셀 참조 가능 해야.
- 또는, confocally 표현 되는 센서와 가장 호환 되는 파장에서 레이저 여기를 사용 하 여이 평가 수행 (488 nm는 일반적으로 최고의 작품).
- 원하는 보기 필드 발견 되 면 환경 챔버를 닫습니다.
참고: 연구를 통해 안정적인 초점 비행기의 유지 보수를 용이 하 게 하 고급 현미경 스탠드에서 자주 사용할 수 초점 유지 기능을 사용. - 원하는 노출 기간에 걸쳐 관심의 센서의 최적의 평가 보장 하기 위해 수집 매개 변수를 설정 합니다. 다음은 권장 사항 및 센서 응답의 confocal 영상에 대 한 접근:
- 488 nm에서 여기 및 방출 510에 대 한 레이저 전원 조정 nm. 셀, 시각화 수 있도록 레이저 전력 레벨을 선택 하 고 이것을 샘플 또는 복제 요리 사이 일정 하 게 유지.
참고:이 연구를 위해 12%와 1.5% 레이저 전원 사용 되었다 488 고 404 nm 레이저 라인에 각각. - 수집 소프트웨어의 confocal 컨트롤을 사용 하 여 선택 된 초점 비행기는 488에서 검색 하 여 셀 (z 축)의 중심에서 최대한 형광 방출 강도 대 한 최적화 된 z-비행기를 조정 하는 동안 nm. 이것은 쉽게 가장 과다 노출 된 세포에서 z-비행기에 대 한 검색 하는 동안 높은 이득 설정을 사용 하 여 이루어집니다. 적절 한 초점 비행기 발견 되었습니다 일단 관찰 되 고 픽셀 밀어붙이는 없이 사용 되 고 기자의 형광에 대 한 가장 최적의 설정에 이득을 반환 합니다.
참고: 레이저와 이득 설정을 발견 하 고 실험 하는 동안 세포 관찰에 적합는 완전히 사용 되 고 confocal 시스템에 의존 합니다. 일반적으로, 일단 셀 보기의 필드에서 발견 되었습니다, 그것 것이 좋습니다 최소한 레이저 힘의 사용 (일반적으로 ≤20%), 고성능 레이저 빛을 사용 하 여 셀의 과도 한 스캐닝 센서에 의해 산화 변화 감지 유도 수 있습니다. - 이득을 사용 하 여 초기 형광을 세밀 하 게 조정. RoGFP2와 이러한 셀 EGSH 가 증가 하면 488 nm 여기에 의해 유도 된 510 nm 형광 잃게됩니다-채도 없이 악기의 상한 (≈ 90% 상대 강도) 근처 기준선을 설정 합니다. 488 nm 여기 형광 강도 이어야 한다 반면, H2O2 감지 되 면 이러한 세포 510 nm의 형광 강도 얻을 것 이다 세포를 표현 하는 하이퍼에 대 한 기준선에서 낮은 (≈ 10% 상대 강도).
- 2.9.2-404 nm에서 여기와 510에서 방출 2.9.3 단계 반복 nm. 이득 404 nm 여기 파장에 대 한 설정은 각 센서에 대 한 488 nm 여기 사용 된 반대 (즉, 낮은 기준 형광 (≈ 10% 상대 강도) 404에서 roGFP2,2 H에 대 한 높은 기준 형광 (≈ 90% 상대 강도)에 대 한 nm O2 센서).
참고: 일반적으로 404 nm 여기에 형광 (510 방출) 상당히 낮은 것 보다 셀에 488 nm 여기 얻을 수 roGFP2와 하이퍼, 404 nm 피크로는 상대적으로 경미한 흥분이 모두에 게 최대 센서입니다.
- 488 nm에서 여기 및 방출 510에 대 한 레이저 전원 조정 nm. 셀, 시각화 수 있도록 레이저 전력 레벨을 선택 하 고 이것을 샘플 또는 복제 요리 사이 일정 하 게 유지.
3. 데이터 수집
- 수집 소프트웨어를 순차적으로 두 여기 파장을 흥분 시키기 위해 설정 (첫 번째 488 nm 그리고 404 nm) 510에 대 한 배출량을 수집 하 고 실험의 원하는 길이 걸쳐 미리 정해진된 시간 간격에 nm (예: 캡처 이미지 마다 60 60 분에 대 한 s)입니다.
- 또는, 이미지 수동으로 노출 전후 경우 수집할 변경 EGSH 또는 H2O2 에 대략적인 타이밍 테스트 되 고 xenobiotic 알려져 있습니다. 그러나,이 시간 해상도의 손실이 발생할 수 있습니다.
- 실험적인 매개 변수의 실시간 평가 대 한 필드에 적어도 5-10 센서 표현 셀을 선택 하 고 관심 ("ROIs") 실험 기간 동안 그들의 형광 변화를 모니터링 하는 영역으로 그들을 설정 합니다.
참고:이 단계는 선택 사항, 그리고 실시간으로 직접 관찰 하는 것은 바람직하지 않다 또는 소프트웨어 제한 방지 연속 모니터링 하는 경우 실험 후 수행할 수 있습니다. 세포 인구에 따라 ROIs로 셀을 표현 하는 센서의 선택 셀에 걸쳐 식 레벨의 범위를 나타낼 수 있습니다.- 이러한 연구에 대 일 분 기준 기간 후 환경 toxicant 9, 10-phenanthrenequinone (9, 10-PQ) 또는 과산화 수소 (H2O2)를 추가 합니다.
- 이 프로토콜에서 나중에 사용에 대 한 모든 시 약을 준비 합니다. 9, 10-15 m m의 농도에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 PQ를 녹이 고 250 µ M 작업 솔루션을 기저 세포 미디어에 희석. 또한, 주입 시 1 m m의 최종 농도 얻을 것 이다 물에 과산화 수소의 작업 솔루션을 준비 합니다.
- 실험적인 매개 변수를 정의한 후 시간 과정 취득을 시작 합니다. Xenobiotic 노출 시작 전에 적어도 5 분 (또는 5 데이터 요소)의 초기 계획 기간을 설정 합니다.
- 노출 하는 toxicant 세포 생체 외에서 주입에 대 한 기존의 접근을 사용 하 여 조사 되 고. 물 또는 다른 적절 한 용 매에 녹는 화합물을 준비 하 고 미디어에 직접 주사.
- 유기 용 매 (예: 디 메 틸 sulfoxide 또는 에탄올) 필요한 경우, 마지막 용 매 농도 0.1% 이하로 유지. 솔벤트 셀의 별도 접시에 차량 제어 전자GSH 또는 H2O2 생산에 영향을 생성 하지 않습니다 확인 합니다.
- 더 낮은 가용성을 가진 화합물, 혼합 단계 주입 후 micropipette 프로토콜을 사용 하 여 추가 합니다. 적절 한 캐리어 가스 혼합물을 사용 하 여 환경 챔버에 직접 가스 노출 펌프.
- 노출 기간 동안 형광에 변화를 모니터링 합니다. 필요에 따라 다음 주사를 수행 합니다. 상당한 주의 하지 주사, 중 접시를 이동 하기 위하여 동일한 셀 같은 초점면에서 촬영 하는 동안 전체 시간 내내 뒤를.
- 실험의 끝에, 적절 한 컨트롤에 셀을 표시 합니다. 두 유전자 인코딩된 fluorogenic 센서에 대 한 화합물 산화와 감소의 그들의 비율 응답 지적된 데모에 이러한 센서의 특정 농도 추가 합니다. H2O2 와 dithiothreitol (DTT) 산화 하 고 두 센서를 줄이기 위해 적절 한 컨트롤로 제공 합니다. 일반적으로, 100-1000 µ M H2O2, 1-5 m m dithiothreitol (DTT), 뒤의 최종 농도 사용자를 완전히 산화 하 고 이러한 센서를 줄일 수 있습니다.
- 이러한 연구에 대 한 최대 센서 응답을 결정 하기 위해 5mm DTT 뒤 1 m m H2O2 를 사용 합니다.
- 응답, 센서 수 있도록 적어도 5 분을 기다려야 하 고 원제, DTT는 세 뇨 르를 형광 또는 설립된 기준선 근처의 수준에 반환 등을 주사.
참고:이 단계에서 컨트롤의 사용 정규화에 대 한 중요 한 이며 각 셀에 센서의 동적 범위를 결정 하는 모든 실험의 끝에 실행 되어야 한다. RoGFP2를 위한 aldrithiol 또한 실험의 끝에 추가할 수 있습니다. Aldrithiol 센서를 직접 산화 roGFP2 redox 릴레이 무시 합니다. 다음 xenobiotic 노출 센서 기능을 평가 하기 위해 유용 합니다.
4. 데이터 분석
- 설정 되지 않은 경우 분석할 셀 주위 ROIs를 그립니다. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 각 ROI 시간 과정을 통해 각 파장에서의 형광 강도 측정. 셀 이동 하지 않았다 또는 접시 실행 하는 동안 이동 하지 않은 확인 하십시오.
참고: ROIs 설립 동봉된 영역 각 셀의 형광 식 패턴을 그려서 가장 쉽게 이루어집니다. 더이 과정을 돕기 위해, 설립된 시야 내에서 셀의 빛 (또는 명시) 이미지를 전송된 셀 경계를 정의 하는 노력에 형광 이미지 위에 중첩 수 있습니다. 그러나, 전송된 빛 이미지를 사용 하 여 사용자를 실험의 과정을 통해 추가 채널 (이미지의 집합)를 잡으려고 합니다. 또는, 특정 제조 업체 ROIs 더 양적, 덜 주관적 방법 설치 하기 위하여 강도 임계값 같은 특정 매개 변수를 사용 하는 이미징 소프트웨어에 알고리즘을 통합 합니다. - 원하는 분석 소프트웨어 (예: 전자 스프레드시트)를 내보냅니다.
- 수식을 사용 하 여 각 시간 지점에서 각 ROI에 대 한 비율 센서 응답을 계산:
- 각 시간 지점에 대 한 모든 ROIs의 계산 된 비율 값을 평균입니다.
- Xenobiotic (예를 들어, 첫 번째 5 번 포인트)의 추가 하기 전에 수집 이전에 계산 된 비율 값 (단계 4.4)을 평균 하 여 데이터를 정규화 하는 데 사용 됩니다 초기 계획 값을 계산 합니다.
- 4.5에서 계산 기준 값으로 각 값을 분할 하 여 단계 4.4 비율 값을 정상화. 정규화 된 비율 값이 기준선에 1 중심, EGSH 또는 H2O2 증가 하면서 다음 주사 증가 비율을 발생 합니다. 산화 변화 유도 xenobiotic의 평가 3-6 회 기준 값의 범위에 있는 값을 생성 해 경향이 있다.
- 응답 시간과 실험에서 비교에 투입, 100%로 제어 산화 제 (예: 1 m m H2O2)에 대 한 응답을 정의 하 여 정규화 된 데이터 최대 센서 응답의 표현.
참고: 최대 센서 응답의 데이터를 표현 하는 경우 그것은 중요 제어 산화의 동일한 농도 실험에 걸쳐 일관 되 게 사용 되도록. 라이브 셀 이미징 분석에서 파생 된 모든 데이터는 기존의 쌍 단위 및 group-wise 통계 분석 조사 관의 판단에 따라 선택 될 의무가.
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Representative Results
EGSH 및 세포내 H2O2 에서 변화를 감지에 roGFP2 및 하이퍼 사용 잘 했습니다25,36,,4243 위에서 설명한 고 여기 설명 된다. 기준선 및 다음의 추가 H2O2 와 DTT에 roGFP2을 표현 하는 셀의 공초점 이미지는 그림 2에 표시 됩니다. 데이터는 실험을 통해 수집 된 이미지를 수출 그리고 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로 분석 했다. 같이, 긍정적인 컨트롤로 exogenous H2O2 의 추가 생산 하 고 재현할 수 응답 데이터는 그들의 각각 기준으로 정규화 하 고 알려진 세의 추가 통해 정의 된 동적 범위 설정 oxidants/reductants (즉, H2O2 와 DTT) (그림 3, 4, 및 5).
독물학 자극에 응답은 컨트롤에 의해 유도 된 보다 일반적으로 더 많은 변수. 이것은 예상 될 xenobiotic 화합물 redox 세포내 단백질의 예증 사이클에서 배열 하는 셀에 다 면 발현 성 효과 있을 수 있습니다. RoGFP2 및 toxicant 9, 10-PQ, 안정화44, 대기 반응에 의해 형성 된 산화 공기 오염 물질에 노출에 의해 유도 된 하이퍼 응답의 예는 그림 6과 7에표시 됩니다. 이 그림에서 그래프 프로토콜의 섹션 4에에서 명시 된 데이터 분석에 관련 된 각 단계의 진행을 묘사. 같이, 그것의 자신의 기준 및 긍정적인 제어 (그림 6B), 각 셀의 원시 데이터 (그림 6A) 센서 응답의 크기에서 세포 가변성을 감소 시킨다. 휴대 전화 응답에 대 한 분산은 관심의 경우, 개별 셀 그래프에 그들의 자신의 선에 의해 대표 된이 시점까지 데이터의 정규화를 수행할 수 있습니다. 크기 또는 같은 접시에 셀 간에 반응의 속도 론에서 예를 들어 세포 주기에서 차이 반영 하는 중요 한 기계적 통찰력을 밝힐 수 있다. 또는, 표준 편차 (그림 6C) 함께 접시에 셀의 평균된 응답을 제시하실 수 있습니다. 그렇지 않으면, 별도 실험의 복제는 제시 되 고, 데이터 수 있습니다 표시 정규화 된 상대 형광 강도 값 또는 제어 산화 제 (3, 4, 5, 및 6 D 수치)에 의해 유도 된 최대 응답의 비율 뜻의 표준 오류와 함께 모든 복제의 평균 게재. RoGFP2 (에 의해 대기 오염 물질 9, 10-PQ는 강력한 산화 환 원 자전거 타는 것으로 알려져, 우리가 가설 하이퍼 (그림 7)에 의해 감지 하는 과산화 수소 생산의 주기적 피크에 대 한 책임 그리고 stepwise EGSH 증가 감지 그림 6 D)입니다.
그림 1 . RoGFP2 티 redox 릴레이입니다. 티 peroxidases (메타) 산화 수소 과산화 수소 (H2O2)에 대 한 응답 GSSG 감소 티 (GSH), 는 티 산화 환 원 잠재력 (EGSH) 증가. Fluorogenic 센서 roGFP2 세포내 전자GSH glutaredoxin (Grx)에 의해 산화 될 때와 equilibrates. 감소 통로에서 Grx GSSG 수준 감소 하 고 GSH의 정상적인 수준의 NADPH 비용 glutathione reductase (GR)에 의해 다시는 deglutathionylation 통해 roGFP2의 감소를 catalyzes. NADPH는 pentose 인산 염 통로 (PPP)을 통해 포도 당에 의해 제공 됩니다. 깁스 Flournoy 외35에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 인간 기관지 상피 세포의 confocal 현미경 이미지 라인 BEAS-2B 표현 cytosolic roGFP2. 셀 488에서 조명 했다 nm (A-D), 404 다음 nm (E-H). 이미지 표시 510에서 방출 하는 형광 다음과 같은 조건에 대 한 nm: 기준선 (A, E), 100 µ M H2O2(B, F), 1 m m H2O2 (C, G), 그리고 5mm DTT (D, H). 60 X 계획 Apo VC 목적입니다. 스케일 바 대표 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . RoGFP2 BEAS 2B 세포에서 H2O2 에 의해 유도에 따라 변화 복용량. 셀 페 놀 레드 무료 keratinocyte 기저 미디어 (KBM) 노출 이전에 30 분 동안 equilibrated 했다. 5 분 roGFP2 형광 510에서 방출의 초기 기간 후에 발생 한 H2O2 의 모든 추가 nm 525/30 nm 대역 통과 사용 하 여 수집 된 404 및 488 nm 레이저 여기 다음 필터. 세포질 응답 했다 그들의 각각의 초기 계획을 최대 센서 응답 1 m m H2O2의 추가 따라 정규화 됩니다. 값은 평균 ± 표준 오차, n으로 제시 = 3, 5-10의 독립적인 세포의 평균의 n으로 구성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 포도의 응답 굶 어 BEAS 2B 셀 H2O2의 다양 한 복용량을 roGFP2 표현. 세포 노출 전에 포도 당을 포함 하지 않는 최소한의 소금 매체에서 2 시간 동안 equilibrated 했다. 5 분 roGFP2 형광 510에서 방출의 초기 기간 후에 발생 한 H2O2 의 모든 추가 nm 525/30 nm 대역 통과 사용 하 여 수집 된 404 및 488 nm 레이저 여기 다음 필터. 세포질 응답 했다 그들의 각각의 초기 계획을 최대 센서 응답 1 m m H2O2의 추가 따라 정규화 됩니다. 값은 평균 ± 표준 오차, n으로 제시 = 3, n 5-10 가지 세포의 평균의 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5. H의 다양 한 복용량에 하이퍼 표현 BEAS 2B 셀의 응답 2 O 2 . 셀 페 놀 레드 무료 KBM 노출 이전에 30 분 동안 equilibrated 했다. 5 분 510에서 방출 하는 형광의 초기 기간 후에 발생 한 H2O2 의 모든 추가 nm 525/30 nm 대역 통과 사용 하 여 수집 된 404 및 488 nm 레이저 여기 다음 필터. 세포질 응답 했다 그들의 각각의 초기 계획을 최대 센서 응답 1 m m H2O2의 추가 따라 정규화 됩니다. 값은 평균 ± 표준 오차, n으로 제시 = 3, n 5-10 가지 세포의 평균의 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6. 9, 10을 이용한 수 PQ 응답 BEAS 2B 셀 roGFP2을 표현합니다. 셀 페 놀 레드 무료 KBM 노출 이전에 30 분 동안 equilibrated 했다. 25 µ M 혼합과 9, 10-PQ의 추가 발생에서 5 분, 1 m m H2의 추가 의해 다음 20 분 및 5mm DTT 24 분 패널 A 에서 O2 묘사 접시, 별도 선으로 표시 하는 각 셀에에서 개별 셀의 원시 roGFP2 비율. 평균 및 표준 편차가이 데이터의 패널 C에서 개별 정규화 된 비율에 포개져 고 패널 B 의 기준선 센서 형광, 각 개별 셀의 값의 정규화를 보여줍니다. 모든 셀에 걸쳐 평균 최대 센서 응답의 비율 패널 D에 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 . 9, 10을 이용한 수 PQ 응답 BEAS 2B 셀 하이퍼 표현. 셀 페 놀 레드 무료 KBM 노출 이전에 30 분 동안 equilibrated 했다. 25 µ M의 추가 혼합과 9, 10-PQ에서 5 분, 발생 1 m m H2의 추가 의해 다음 20 분 및 25 분 510에서 방출 하는 형광에서 5 mM DTT에 O2 nm 525/30 nm 대역 통과 사용 하 여 수집 된 404 및 488 nm 레이저 여기 다음 필터. 세포질 응답 했다 그들의 각각의 초기 계획을 최대 센서 응답 1 m m H2O2의 추가 따라 정규화 됩니다. 값은 5-10 가지 셀의 평균으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
세포내 전자GSH 및 H2O2에 각각, 변화를 감지에 roGFP2 및 하이퍼 사용 이전 생리 및 독성 연구 25,35,36에에서 잘 설명 되었습니다. ,39,40,41,,4243. 여기에 설명 된 프로토콜 세포내 산화 환 원 항상성의 섭 xenobiotic 유도 평가 하기 위해 설계 된 지적된 독물학 연구에서 이러한 유전자 인코딩 redox 센서를 구현 하는 효과적인 방법을 보고 합니다. 가장 중요 한 것은, 이러한 센서의 적절 한 사용 링크 궁극적으로 많은 기존의 산화 스트레스 접근 특이성의 부족을 명확히 선생님 (EGSH 또는 H2O2), 또는 특정 산화 환 원 쌍을 변경 합니다. 실험을 설계할 때 고려 사항으로이 센서, 몇 가지 측면에서에서 생성 된 데이터의 품질을 촬영 해야 합니다 확보와 데이터 분석/해석. 그들은 포함: 1) 적절 한 컨트롤, 적절 한 센서 응답의 2) 확인 및 실험적인 매개 변수 메커니즘을 명료 하 게 3) 조작의 사용. 이들의 관측 기간 끝에 컨트롤로 exogenous H2O2 와 DTT의 추가 여러 목적을 제공합니다. 첫째, 센서에서 달성 최대 및 최소한의 신호에 상대적인 독성 노출에 대 한 응답의 크기를 평가 하는 기회를 준다. 비교 실험에 대 한 응답을 정상화에 가장 유용 합니다. 또한, 강한 exogenous 산화 및 감소 자극의 추가 함께 실험을 종료 센서/릴레이 무결성에 이전 노출의 효과 평가할 수 있다. 또한, aldrithiol 릴레이 무시 하 고 직접 노출 fluorophore 자체를 잊어 버리고 있을 수 있습니다 손상에 대 한 센서의 기능을 테스트 하려면 실행의 끝에 추가할 수 있습니다.
다른 기법, 독성 결과의 특정 시험에 대 한이 방법론을 적용할 때와 마찬가지로 만든 관측의 정확도 관한 질적 평가에 중요 하다. 어떤 새로운 xenobiotic와 roGFP2 또는 하이퍼를 활용 하면 그것은 먼저 각 여기 파장에서 형광 강도 (510 nm 방출) 보장 하는 동안 복용량의 범위를 테스트 하는 것이 중요 (404 nm, 488 nm) 적절 하 게 변경 (즉 증가 또는 감소) 사용 중인 redox 센서에 대 한. 목표는 센서 응답 감지, 하지만 센서의 명백한 조작 또는 화합물의 다른 일반적인 효과 의해 압도 되지 복용량을 식별 하는 것입니다. 직접 예증 또는 센서에 손상을 비정형 변경으로 어느 여기 파장 (또는 404 488 nm)에서 형광에는 매니 페스트 수 있습니다. 어느 센서는 지속적으로 노출에 걸쳐 한 toxicant의 추가에 부적절 하 게 응답을 관찰 되었습니다 경우에 것이 좋습니다는 탐정 원에 관하여 실험적인 매개 변수 검사 고려 셀 생존/센서 식, 또는 응답을 관찰 하는 데 사용 되는 계측의 광학/반음계 이상.
와 마찬가지로 모든 독물학 판독 데이터 인수 일반적으로 더 많은 의미 있는 관찰된 응답 검사 하거나 유효성을 검사할 때 기계적 접근 및 실험적인 한계를 사용 하 여 간주 됩니다. 이 위해, 강력한 산화 환 원 평가 생성 하 센서의 고유한 속성을 함께 몇 가지 실험적인 매개 변수를 활용할 수 있습니다. RoGFP2 센서의 사용에 특정 조사는 궁극적으로 redox 릴레이 roGFP2 감각 EGSH (그림 1)을 통해 우려. 릴레이는 glutaredoxin (Grx), 티 reductase (GR) 및 티 과산화 효소 (GPx)를 포함 하 여 세포내 효소를 포함 한다. 세포질 구획 및 셀 형식 Grx의 내 생 수준 차이 EGSH 의 측정에 영향을 미칠 하 고 실험 어려운43사이의 비교를 만들 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 "퓨전 프로브"의 시리즈는 되었습니다 합성는 roGFP2 센서에 직접 관련 된 효소를 연결. 가장 최근에, 인간의 Grx-1 양식 Grx1-roGFP2 Gutscher와 동료32 roGFP2를 연결 했다. RoGFP1 보다 더 큰 동적 범위를 데와 산도 구분 되 고, Grx1-roGFP2 전자GSH 셀 형식 또는 구획 어떤 Grx에서 활동 그렇지 않으면 제한 될 것을 모니터링할 수 있습니다. NADPH 수준의 셀 또는 셀 같은 요리 중 에서도 차이 또한 roGFP2 응답에 있는 변화에 기여할 수 있다. NADPH는 pentose 인산 염 통로 통해 포도에서 생산 되 고 GSH (그림 1)을 다시 티 reductase GSSG 줄이기 위해 (GR)에 의해 이용 될 수 있다. 경우 동일한 필드 셀 다른 감소 용량으로 실험 시작, 그들의 EGSH 변화와 자극에 대 한 결과 roGFP2 응답 수 있습니다 유니폼. 이 문제는 세포 NADPH 주식을 고갈 시키고 roGFP2 응답 조화 실험 전에 포도 당 굶주림의 기간을 통해 극복 될 수 있습니다. EGSH 복구에 대 한 감소 용량 또한 정상적인 포도 당 농도 (그림 3 및 4) 보충 하는 셀에 비해 포도 당의 굶 어 했다 셀에 25 µ M H2O2 복용량에서 볼 수 있습니다. Thusly, 포도 당 기아 통해 NADPH 레벨의 조작을 여러 릴레이 구성 요소 센서 xenobiotic 노출의 효과 시험에 참여를 확인 하는 수단으로 사용할 수 있습니다. 독물학 컨텍스트에서 roGFP2을 사용 하는 경우 또 다른 관심사 EGSH변경 xenobiotic redox 릴레이 통해 행동 하는 것 보다 센서, 산화에 직접 상호 작용을 위한 가능성은. RoGFP2의 직접적인 산화는 산화 환 원 릴레이의 각 포인트를 검색 하 고 roGFP2 신호에 미치는 영향을 평가 하 여 결정할 수 있습니다. 자극으로 오존을 사용 하 여이 기술의 예로 깁스 Flournoy 외 35에 의해 연구에서 보여 줍니다.
H2O2 센서, 실험에 대 한 위의 우려는 redox 릴레이 통해서가 아니라 관련, 하이퍼 OxyR1 도메인 H2O2 를 직접 감지. 그러나, roGFP2, H2O2 센서는 달리 형광 인하지 H2O2 는 실험 동안에 변화를 일으킬 수 있는 pH의 변화에 민감한. 이러한 이유로, 제대로 버퍼 미디어를 사용 하 여 차량 컨트롤 사용 하 여 원하는 온도 유지 하기 위해 환경 챔버를 H2O2 센서를 활용 하 여 어떤 실험에 생명 이다. 또한, fluorogenic 센서 pHRed, 빨강 채널에 형광을 방출 하 고 하이퍼45표현 하는 셀에 공동 표현 될 수 있는 등 구체적으로 모니터 pH에 개발 되었습니다. H2O2 센서에 대 한 이상적인 pH 컨트롤은 SypHer, H2O2 센서 감지 H2O2를 수 없습니다 렌더링 단일 지점 돌연변이, 아직 전화를 응답을 유지의 버전 46. 그것은 또한 관찰 되었다 H2O2 센서를 표현 하는 세포 equilibrate, 특히 분석, 기간 동안 그들은 경험의 사이트를 인큐베이터에서 수송 되 고 후에 더 긴 기준선 기간 필요 미디어 온도 pH의 약간의 변화입니다. 기준선은 어떤 노출 시작 하기 전에 안정화 후 적어도 5 데이터 포인트를 획득 하는 것이 좋습니다.
이 방법은, roGFP2 및 하이퍼, 센서는 독물학의 분야에 있는 새로운 응용 프로그램의 다양 한 많은 fluorogenic 센서의 두. 이 뿐만 아니라 전자GSH 및 H2O2, 하지만 peroxynitrite47, 감지 하도록 설계 된 센서 포함 산화 질소48,49, 그리고 심지어 오존50. 이러한 센서를 라이브 셀 이미징 연구에서 구체적으로 이용 될 수 있다 고 민감하게 산화 종의 관심을 모니터링 합니다. 스펙트럼 unmixing 등 기술 발전, 그것도 공동 유사한 스펙트럼 특성을 가진 2 개의 센서를 표현 가능 (5 시간 서로 nm) 같은 셀, 그리고 각 센서51에 의해 방출 되는 형광의 비율을 별도 . 그들은 포함 업무가 동일한 파장에 방출이이 기술은 roGFP2와 하이퍼, 특정 관심의 이다. 짧게 언급 여기, 특정 센서 수 수 대상 미토 콘 드리 아, 관심의 산화 이벤트를 관찰 하는 것 같은 특정 세포내 구획에. 이러한 신흥 센서와 기술을이 방법의 범위는, 독자 임금 및 동료52에 의해 검토와 같은 세포내 redox 센서의 주제에 몇몇 최근 간행물을 부릅니다. Fluorogenic 유전자 인코딩된 라이브 셀 이미징 센서를 사용 하 여 산화 반응의 독성 학적 평가 동안 모니터링을 위한 강력한 도구입니다.
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Disclosures
이 문서에서 설명 하는 연구는 국민 건강 및 환경 효과 연구 실험실, 미국 환경 보호국, 검토 하 고 게시에 대 한 승인. 이 문서의 내용을 나타내는 기관 정책, 해석 안도 않습니다 상표명 또는 상용 제품의 언급 구성 승인 또는 사용을 위해 추천.
Acknowledgments
저자는 Katelyn Lavrich 실험 설계 및 원고 편집에 대 한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
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