Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En integreret Platform for Genome-wide kortlægning af kromatin stater ved hjælp af høj overførselshastighed ChIP-sekventering i Tumor væv

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

Her, beskriver vi en optimeret høj overførselshastighed ChIP-sekventering protokol og beregningsmæssige analyser rørledning til bestemmelse af genome-wide kromatin tilstand mønstre fra frosne tumor væv og cellelinjer.

Abstract

Histon ændringer udgør en større komponent af epigenome og spiller en vigtig lovgivningsmæssig rolle ved fastsættelsen af transcriptional status af associerede loci. Derudover er tilstedeværelsen af specifikke ændringer blevet brugt til at bestemme den holdning og identitet ikke-kodende funktionelle elementer såsom smagsforstærkere. I de seneste år, er kromatin immunoprecipitation efterfulgt af næste generation sequencing (ChIP-FF.) blevet et stærkt værktøj til at bestemme genome-wide profiler af individuelle Histon ændringer. Dog er det blevet stadig tydeligere, at de kombinatorisk mønstre af kromatin ændringer, omtales som kromatin stater, bestemme identitet og karakter af den tilknyttede genomisk locus. Derfor arbejdsprocesser bestående af robust høj overførselshastighed (HT) metoder til profilering en række Histon ændring mærker, samt beregningsmæssige analyser rørledninger i stand til at håndtere myriader af ChIP-Seq profilering datasæt, er nødvendige for omfattende bestemmelse af epigenomiske stater i stort antal prøver. The HT-ChIP-Seq arbejdsproces præsenteres her består af to moduler: 1) en forsøgsplan for profilering flere Histon ændringer fra små mængder af tumor prøver og cellelinjer i 96-brønds format. og 2) et beregningsmæssige data analyse rørledning, der kombinerer eksisterende værktøjer til at beregne både individuelle mark belægning og kombinatorisk kromatin tilstand mønstre. Sammen, lette disse to moduler nem behandling af hundredvis af ChIP-Seq prøver på en hurtig og effektiv måde. Arbejdsprocessen præsenteres her bruges til at udlede kromatin tilstand mønstre fra 6 Histon mark profiler i melanom tumorer og cellelinjer. Samlet, præsenterer vi en omfattende ChIP-seq arbejdsproces, der kan anvendes til snesevis af menneskelige tumor prøver og kræft cellelinjer til at bestemme epigenomiske aberrationer i forskellige maligniteter.

Introduction

Fleste pattedyr genomer (98-99%) består af noncoding sekvens, og disse nocoding regioner indeholder regulerende elementer kendt for at deltage i kontrol af genekspression og kromatin organisation1,2. I en normal celle er den særlige samling af genomisk DNA i komprimerede kromatin struktur afgørende for den rumlige organisation, regulering og præcise timing af forskellige DNA-associerede processer3,4,5. I en kræftcelle dog kan kromatin ændringer af afvigende epigenetiske mekanismer føre til uretmæssig organisation af kromatin struktur, herunder adgang til regulerende elementer, kromosomale looping systemer og gen expression mønstre6, 7,8,9,10.

Trods de seneste fremskridt, har vi begrænset forståelse af epigenetiske ændringer, der er forbundet med tumor progression eller terapeutisk respons. Epigenome består af en række ændringer, herunder Histon mærker og DNA methylering, som samlet udgør et dynamisk tilstand (benævnt kromatin stat), der indvirker på gen expression netværk og andre processer, der er afgørende for at opretholde cellulære identitet. For nylig, ændringer i smagsforstærkere har været vist i flere maligniteter ved at studere H3K27Ac profiler11. Selv om sådanne undersøgelser giver indsigt i sammenhængen af isolerede epigenetiske mærker, mere end 100 epigenetiske ændringer har været identificeret12,13 uden klar forståelse af deres biologiske roller og indbyrdes afhængighed. Derudover er der et endnu større antal mulige kombinatorisk mønstre af disse Histon og DNA ændringer, og det er disse kombinatorisk mønstre - ikke enkelte ændringer - at dikterer epigenetiske stater14. Der er derfor enormt behov for at identificere ændringer i disse kromatin stater under kræft progression eller svar til terapi. Omfattende viden om epigenome forandringer i kræft har halter delvis på grund af tekniske (f.eks. generation af omfattende data fra små beløb af klinisk materiale/enkelt celler) og analytisk (fx algoritmer til at definere Kombinatorisk stater) udfordringer. Derfor er der kritiske behov for robust høj overførselshastighed metoder til profilering stort antal Histon ændring mærker fra klinisk materiale og let at implementere beregningsmæssige metoder til at forudsige kombinatorisk mønstre, som vil lette bestemmelse af epigenetiske stater forbundet med forskellige stadier af tumordannelse og terapeutiske modstand. Yderligere, data fra de seneste epigenome profilering undersøgelser15,16,17,18,19,20,21, 22,23 i normale væv og cellelinjer kan integreres med kromatin profiler af tumorer for yderligere indsigt i epigenome bidrag til tumor biology.

Kromatin profilering er blevet et stærkt værktøj til at identificere de globale bindende mønstre af forskellige kromatin ændringer15,24. I de seneste år blevet ChIP-FF. den "gyldne standard" for at studere DNA-protein interaktioner på en global skala25,26,27. Til ethvert ChIP-seq eksperiment er der kritiske trin nødvendigt for dens succes, herunder væv forarbejdning og afstandtagen, indhenting optimal sonikering betingelser, indhenting optimal antistof koncentration for nedbør, bibliotek forberedelse, efter sekvensering databehandling og downstream analyse. Hvert af disse trin indeholder centrale kvalitetskontrol checkpoints, og når det tages sammen, er afgørende for korrekt at identificere potentielle mål for funktionelle validering. Gennem innovation i disse trin, har flere forudgående undersøgelser udviklet metoder til at udføre ChIP eller ChIP-Seq fra lille mængde væv28,29,30,31,32 . Yderligere, nogle undersøgelser har antydet, protokoller for høj overførselshastighed ChIP eksperimenter efterfulgt af PCR baseret kvantitering33,34. Endelig er nogle offentligt tilgængelige analyse platforme for ChIP-Seq data nu tilgængelige som Easeq35 og Galaxy36. Dog har en integreret platform til at udføre ChIP-Seq i en høj overførselshastighed mode i kombination med en beregningsmæssige rørledning til udføre enkelt mark samt kromatin stat analyser manglet.

Denne protokol beskriver en komplet og omfattende ChIP-seq arbejdsproces for genome-wide kortlægning af kromatin stater i tumor væv og cellelinjer, med let for at følge retningslinjerne omfatter alle de trin, der er nødvendige for en vellykket eksperiment. Ved at vedtage en høj overførselshastighed, der er tidligere beskrevet af Blecher-Gonen et al. 37, denne protokol kan udføres på snesevis af prøver i parallel og er blevet anvendt på kræft cellelinjer og menneskelige tumorer såsom melanom, tyktarmen, prostata og glioblastom multiforme. Vi demonstrere metodologien for seks core Histon modifikationer, som udgør centrale elementer i den epigenetiske lovgivningslandskab i menneskelige melanom cellelinjer og tumor prøver. Disse ændringer omfatter H3K27ac (smagsforstærkere), H3K4me1 (aktiv og klar smagsforstærkere), H3K4me3 (initiativtagere), H3K79me2 (transskriberet regioner), H3K27me3 (polycomb undertrykkelse), og H3K9me3 (heterochromatic undertrykkelse). Disse mærker kan bruges enten alene eller i kombination til at identificere funktionelt adskilte kromatin stater repræsenterer både repressive og aktive domæner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle kliniske prøver blev opnået efter retningslinjerne i institutionelle Review Board.

1. buffer forberedelse

  1. Gøre 200 mL af TE buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) pH 8.0).
  2. Gøre 200 mL af STE buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 140 mM NaCl).
  3. Gøre 200 mL 2,0 M Glycin (37.52 g af glycin i 200 mL vand) og varme det til 65 ° C.
  4. Gøre 200 mL 5% natrium deoxycholate (DOC) opløsning (10 g af DOC i 200 mL vand).
  5. Gøre 500 mL af ChIP høst buffer (12 mM Tris-Cl, 0,1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), 6 mM EDTA, 0,5% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS)).
  6. Gøre 500 mL af ChIP fortynding buffer (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Gøre 500 mL af RIPA vaskebuffer (STE, 1% Triton x-100, 0,1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Gøre 500 mL af RIPA/500 vaskebuffer (RIPA buffer + 360 mM NaCl).
  9. Gøre 500 mL af LiCL vaskebuffer (TE, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
  10. Gøre 500 mL af direkte eluering buffer: 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5% SDS.
  11. Gøre 50 mL af antistof bindende/blokering buffer (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% IgG-fri BSA).

2. væv/celle linje behandling og tværbinding

  1. Hvis væv er flash frosset, dethaw det på køl før dissociation.
  2. Ophæve tilknytningen mellem 50 mg af væv (~ 8 mg per Histon ændring antistof) manuelt i 2 mL af Hanks' Balanced Salt løsning (HBSS) ved hjælp af en steril barberblad. Hakkekød vævet i 3-4 mm stykker i ca 5 min i en steril vævskultur parabol.
  3. Overføre væv og HBSS løsning til et dissociator rør og tilføje en anden 8 mL af HBSS. Yderligere adskille væv ved hjælp af en dissociator indtil homogeniseret.
  4. For melanom tumorer, placere rør i en dissociator og Kør følgende cykler hver én gang i denne rækkefølge: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 og m_heart_02.01.
  5. Skrab 21 × 106 celler i 10 mL af medium (~ 3 × 106 per Histon ændring og input; det kan sænkes til 100.000 celler pr. mark for sjældne populationer) dyrkes i en standard vævskultur fad og samle dem i en 15 mL konisk slange.
    Bemærk: Lagermedier til repræsentative melanom cell line WM115 er DMEM suppleret med 10% føtal bovint Serum og 5% penicillin/streptomycin.
  6. Bitmapgenkendelse væv/celler ved hjælp af en 1% endelige formaldehyd-koncentrationen ved at tilføje 200 µL af 16% formaldehyd pr. 3 mL HBBS til væv (eller 3 mL medium for celler). Ryst blandingen på 10 rpm ved hjælp af en mixer i nøjagtig 10 minutter ved 37 ° C.
    Forsigtig: Formaldehyd er giftige og bør håndteres på en passende stinkskab.
  7. Tilføje 200 µL af 2,0 M Glycin pr. 3 mL af prøven og fortsat ryster på 10 rpm for en anden 5 min ved 37 ° C.
    Bemærk: Glycin fungerer som en quencher. Gøre friske glycin løsning hver måned som pH pf løsningen tendens til over tid.
  8. Spin prøver ved 934 x g i 5 min. ved 4 ° C ved hjælp af en benchtop centrifuge. Fjern supernatanten, tilsættes 5 mL af is kold PBS, centrifugeres prøver igen på 934 x g og Fjern supernatanten.
  9. Flash fryse pellet og opbevar den ved-80 ° C nemlig nøjere oparbejdelse.

3. Vævscentre Lysis, ultralydbehandling og antistof forberedelse

  1. Opløs 1 protease hæmmer tablet pr. 10 mL af ChIP høst buffer.
  2. Der tilsættes 300 µL af ChIP høst buffer med proteasehæmmere pr. 50 mg af væv og 30 min af lysis på is.
    Bemærk: Tilsæt 300 µL af ChIP høst buffer med proteasehæmmere pr. 1 X 107 af WM115 melanom cellelinjer.
  3. Mens cellerne lysing, slår den vandbad disruptor og tilknyttede kølesystem og tillader temperaturen at nå 4 ° C. Placer sonikator rør i vandbad disruptor og sonikeres melanom væv for 60 cyklusser på 30 s på og 30 s off til at opnå kromatin fragmenter af ~ 200-600 basepar (bp).
    Bemærk: Sonikering tid kan variere mellem vævstype og bør justeres i overensstemmelse hermed. Dette er et kritisk skridt og bør optimeres i pilot eksperiment, før du fortsætter til immunoprecipitation.
  4. Under sonikering, vaske 20 µL af protein G magnetiske perler per antistof pr. prøve tre gange med 1000 µL af bindende/blokerende buffer (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. ~ 8 mg af melanom væv, Ruger 3 µg hver Histon antistof i 100 µL af bindende / blokerende buffer i 2 timer ved 4 ° C med rotation ved hjælp af en tube revolver. 12 prøver for en ental antistof indeholder 240 µL af perler, 36 µg antistof og 1200 µL af bindende/blokerende buffer.
    Bemærk: For 3 × 106 celler, bruge 5 µg hver antistof og 30 µL af Protein G magnetiske perler per antistof. Antistof og Protein-G perler bør titreres, hvis der bruges forskellige mængde af væv. Denne protokol illustrerer immunoprecipitation betingelser for de beskrevne seks Histon ændringer (Table of Materials), dog antistof koncentrationer bør optimeres for andre modifikationer og transkriptionsfaktorer.
  6. Til at bestemme fragment størrelse, fjerne 20 µL af sonciated kromatin løsning og tilføje en eluering buffer master mix (stuetemperatur) der indeholder 44 µL af direkte eluering buffer, 1 µL af RNase (20mg/mL) og 5 µL Proteinase K (20mg/mL) pr. prøve. Inkuber prøver i en PCR termisk cycler i mindst 2 timer ved 50 ° C. Rense prøven ved hjælp af en PCR rensning kit efter fabrikantens forskrifter.
  7. Sikre kromatin er tilstrækkeligt forskydes ved at bestemme fragment størrelse ved hjælp af en høj følsomhed DNA elektroferogrammet instrument, før du fortsætter til trin 3.6. Drej på elektroferogrammet instrument.
  8. Læg 2 µL af høj følsomhed buffer reagens i hvert hul i en 8-godt optisk rør strip. Læg 2 µL af høj følsomhed stige i de første godt og 2 µL af renset prøver i de resterende brønde.
  9. Placer optisk rør caps på tube stips og vortex prøverne ved 2000 rpm i 1 min. Åbn låget og indsætte en ny høj følsomhed skærmen tape og kasse med lastning tips. Fjern strip caps og indlæse prøverne på elektroferogrammet instrument.
  10. Åbn analyse software, fremhæve de første tretten pladser på skærmen tape og tryk på Start-knappen i nederste højre hjørne. Kromatin fragmenter spænder mellem ~ 200-1000 bp er egnet til ChIP.
  11. Oploesningen sonicated sterile rør og spin rør på 21,130 x g ved hjælp af en bordplade der centrifugeres i 15 min. ved 4 ° C. Overføre supernatanten til nye rør.
  12. Bestemme den samlede rumfang supernatant og fjerne 10% af den samlede løsning for Input kontrol og opbevares ved 4 ° C.

4. kromatin Immunoprecipitation

  1. Opløs 2 protease hæmmer tabletter pr. 20 mL af ChIP fortynding buffer.
  2. Efter ultralydbehandling fortyndet den resterende prøve 5 gange ved hjælp af ChIP fortynding buffer til at bringe SDS niveauer ned til 0,1%. Fortynd 270 µL af resterende supernatanten med 1080 µL af ChIP fortynding buffer til at opnå en endelige samlede volumen af 1350 µL.
  3. Når inkubation af antistof og protein G magnetiske perler er færdig, placere røret på en magnet og Fjern supernatanten.
  4. Med røret stadig sidder på magneten, vaske perlerne én gang ved at tilføje 750 µL af ChIP fortynding buffer med proteasehæmmere.
    Bemærk: Det er vigtigt ikke at forstyrre perlerne eller rotere rørene under dette trin.
  5. Fjerne ChIP fortynding buffer vaske og resuspend perlerne i 240 µL af den samme ChIP fortynding buffer. Alikvot 20 µL af perler i 12 separate rør, hver især bruges til en separat vævsprøve.
  6. Alikvot sonicated materiale, jævnt protein G perler med specifikke antistof og tumler ved hjælp af en tube revolver natten over ved 4 ° C.

5. vask og omvendt Crosslinking af Immunoprecipitated DNA-protein komplekser

  1. Den næste morgen efter reverse crosslinking, antistof-protein opløsning overføres til en 96-brønd plade og placere den på den magnetiske stå. Tillad perler til at overholde for mindst 30 s og Fjern supernatanten.
  2. Vaske perlerne 5 gange med 150 µL af iskold RIPA wash buffer ved hjælp af en multi-kanal pipette. Under vask skridt, lave ikke afpipetteres perlerne, men flytte magneten kontinuerligt fra højre til venstre for 30 s pr. vask.
  3. Vask prøver to gange med 150 µL af iskold RIPA-500 wash buffer.
  4. Vask prøver to gange med 150 µL af iskolde LiCl wash buffer.
  5. Vask prøver en gang med 150 µL af iskold TE wash buffer og fjerne TE buffer straks. Dette trin kan udelades for lav input applikationer.
  6. Tilføje Input kontrol fra trin 3.7 til frisk wells af 96-brønd pladen som indeholder ChIP DNA-prøver.
  7. Efter vask skridt, tilføje en eluering buffer master mix (stuetemperatur) der indeholder 44 µL af direkte eluering buffer, 1 µL af RNase (20mg/mL) og 5 µL Proteinase K (20mg/mL) pr. ChIP og Input prøve for omvendt crosslinking.
  8. Inkuber prøver ved hjælp af en PCR termisk cycler i 4 timer ved 37 ° C, 4 h ved 50 ° C og 8-16 h ved 65 ° C.

6. rensning og kvantificering af udfældet DNA

  1. Den næste morgen, sted prøverne tilbage på magnet og overførsel supernatanten til en ny 96-brønd PCR plade, som indeholder immunoprecipitated DNA.
  2. Tilføje 2,3 x Paramagnetiske perler til løsning (115 µL til 50 µL opløsning) og omhyggeligt afpipetteres op og ned 25 gange bruger en multikanals pipette. Løsningen bliver homogen, hvis korrekt blandet.
  3. Inkuber løsning ved stuetemperatur off magnet for 4 min. sted prøverne tilbage på magnet og inkuberes ved stuetemperatur i en anden 4 min. Fjern supernatanten.
  4. Mens prøverne på magneten, Tilføj 150 µL af 70% ethanol (vol/vol) og inkuberes ved stuetemperatur i 30 s uden at forstyrre perlerne.
  5. Fjerne ethanolen og Gentag vask. Tillad Paramagnetiske perlerne til luft tørre på magnet i 5 min.
    Bemærk: Fjern alle ethanol efter den anden vask som resterende ethanol vil forstyrre rensning.
  6. Fjernes prøverne fra magneten og tilføje 30 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Bland når der afpipetteres 25 gange, og der inkuberes prøverne ved stuetemperatur off magnet i 4 min.
  7. Prøveemner tilbage på magnet og inkuberes ved stuetemperatur til en anden 4 min. Transfer 20 µL af hver prøve til en ny 96-brønd plade for biblioteket forberedelse. Gemme de resterende 10 µL af ChIP DNA i tilfælde af eventuelle problemer med generation af biblioteker.
  8. På dette stadium, kvantificere ChIP DNA før bibliotek forberedelse. DNA-koncentration måles med høj følsomhed DNA reagenser. Fastlægge størrelsen fordelingen af udfældet DNA ved hjælp af en høj følsomhed DNA elektroferogrammet instrument fortsætter til trin 7.1.

7. bibliotek Generation using NEBNext Ultra II DNA bibliotek forberedelse Kit

  1. Generere biblioteker til NGS sekvensering ved hjælp af DNA bibliotek forberedelse efter de anbefalede protokol fra producenten. Alle reaktioner er udført i 96-brønd plader og inkubationer er udført i en PCR termisk cycler med låg temperatur sæt > 100 ° C og lydstyrken sat til 50 µL.
  2. Indekser anvendes Multiplex Oligos for NGS platform. Udfør ialt 10 x cykler til PCR-amplifikation ved hjælp af følgende indstillinger: indledende denaturering på 98 ° C til 30 s, denaturering på 98 ° C i 10 s, udglødning/udvidelse på 65 ° C i 30 s (10 x cyklusser), endelige udvidelse 65 ° C i 5 min og hold ved 4° C.
    Bemærk: Tabel 1 indeholder de primere, der anvendes til PCR-amplifikation.
  3. Efter PCR-amplifikation, fjerne prøverne og bringe samlede volumen til 100 µL bruger nukleasen-gratis vand. Udføre dobbeltsidet Paramagnetiske størrelse udvalg (0.55x/0.8x) ved første tilføje 55 µL af perler og bland når der afpipetteres 25 gange. Inkuber prøverne ved stuetemperatur off magnet i 4 min.
  4. Prøveemner tilbage på en magnet og inkuberes ved stuetemperatur i en anden 4 min. Dette trin bruges til at fastholde store fragmenter på de perler, der er uegnede til sekvensering.
  5. Overføre supernatanten til en ny 96-brønd PCR plade. Smid ikke supernatanten, da dette indeholder delvist oprenset DNA.
  6. Tilføje en anden 25 µL af Paramagnetiske perler og bland når der afpipetteres 25 gange og inkuberes ved stuetemperatur off magnet i 4 min.
  7. Placer prøver tilbage på magnet og inkuberes ved stuetemperatur i en anden 4 min og supernatanten. Dette trin bruges til at fastholde fragmenter af ~ 200 til 600 bp, der skal bruges for afsluttet biblioteker.
  8. Mens prøverne på magneten, Tilføj 150 µL af 70% ethanol (v/v) og tillade inkubere for 30 s uden at forstyrre perler (ikke Flyt på magnet). Fjerne ethanolen og Gentag vask en anden gang.
  9. Tillad Paramagnetiske perlerne til luft tørre på magnet for 5 min. Fjern alle ethanol efter den anden vask som resterende ethanol vil forstyrre rensning.
  10. Fjern prøverne fra magneten og tilsæt 25 µL af 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Bland når der afpipetteres 25 gange og inkuberes ved stuetemperatur off magnet for 4 min. sted prøverne tilbage på magnet og inkuberes ved stuetemperatur i en anden 4 min.
  11. Kvantificere biblioteker ved hjælp af en høj følsomhed DNA elektroferogrammet instrument før multiplexing for at sikre størrelser er egnet til sekvensering. Færdige biblioteker varierer mellem 200-600 bp og er blottet for alle primer dimerer.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, en anden 0,7 x Paramagnetiske perle rensning er udført for at fjerne uønskede primer dimerer, der er til stede på ~ 130 bp.
  12. Pool kvantificerede DNA baseret på entydigt indeks primere ifølge koncentration. For en pulje, der indeholder seks prøver med fusioner mellem 1 ng/µL og 6ng/µL, er fordelingen 15 µL af den laveste prøve og 2,5 µL af den højeste prøve. Dette er gjort for at sikre Læs tæller fordeles jævnt på hver vognbane af cellen flow.

8. post ChIP-seq databehandling

  1. En pipeline, baseret på snakemake38,39 bruges til processen med alle følgende trin i en enkelt kommando. Vigtigere, hvert af disse trin diskuteres individuelt med tilhørende kommandoer.
  2. Bestemme kvaliteten af rå fastq sekventering læsninger ved hjælp af FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): Åbn unix terminal og lave om på bibliotek (cd) til den mappe, der indeholder rå fastq filerne for hver af seks Histon ændringer. Unix-terminaltypen, fastqc *fastq.gz, og tryk på [Retur]. Dette vil køre kvalitetskontrol målinger på alle fastq filer i mappen.
  3. Justere kvalitet læser til reference genom og fjerne dubletter før kompression til bam filer. Dette udføres ved hjælp af Butterfly version 1.1.239, SAMBLASTER version 0.1.2140og SAMTOOLS version 1.3.141: I unix terminaltypen, butterfly -m 1 - n 1--bedste--strata -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools Se -Sb - > histone1.bam og tryk på [Retur].
    Bemærk: path_to angiver den mappe, der indeholder hg19 menneskelige genom forsamling. Dette vil ændre sig afhængigt af organisme af interesse.
  4. Sortere bam filer ved hjælp af SAMTOOLS med følgende kommando: I unix-terminaltypen samtools sortere histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted og tryk på [Retur].
  5. Indeksere bam filer ved hjælp af SAMTOOLS med følgende kommando: I unix-terminaltypen samtools index histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai og tryk på [Retur].
  6. Bestemmer entydigt kortlagt og unaligned læsninger ved hjælp af SAMTOOLS flagstat med følgende kommando: unix terminaltypen, samtools flagstat histone1.sorted.bam og tryk på [Retur].
  7. Normalisere bam filer pr. Læs tæller ved at udføre stikprøvekontrol med følgende kommando: I unix-terminaltypen sambamba se -f bam-undersampling-frø = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools sortere -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam og tryk på [Retur].
  8. Indeksere bam filerne igen ved hjælp af SAMTOOLS med følgende kommando: I unix-terminaltypen samtools index histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai og tryk på [Retur].
  9. At visualisere ChIP-seq biblioteker på en genom-browser (dvs. UCSC eller IGV), generere stor kanon filer ved hjælp af deepTools version 2.4.040 af skalering af bam filer der læser per kilobase per million (RPKM). Dette kan udføres ved hjælp af følgende kommandoer:
    1. For standard stor kanon filer: I unix-terminaltypen, bamCoverage -b histone1. Downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw og tryk {tilbage].
    2. For input trækkes stor kanon filer: I unix-terminaltypen, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--forholdet fratræk--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW og tryk på [Retur].
  10. Identificere ChIP-seq signal berigelse over "Input" baggrunden ved hjælp af Model baseret analyse af ChIP-seq (MLA) version 1.4.225,26 og version 2.1.0. Bruge macs1 for "punktkilde" faktorer H3K4me3, H3K4me1 og H3K27ac og macs2 for "brede kilde" faktorer, H3K79me2, H3K27me3 og H3K9me3. Dette udføres ved hjælp af følgende kommandoer:
    1. For punkt kilde: I unix terminal type, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--keep-dup alle - n histone1.file og tryk på [Retur].
    2. For bred kilde: I unix-terminaltypen, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6--bred--bred-cutoff 1e-6--keep-dup alle--nomodel - n histone1.file og tryk på [Retur].
  11. Brug ChromHMM24 at identificere kombinatorisk kromatin tilstand mønstre baseret på Histon ændringer undersøgt ved hjælp af følgende kommandoer:
    1. I unix terminal type, cd/path_to/ChromHMM_folder og tryk på [Retur].
    2. En gang i adressekartotekstype ChromHMM java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output og tryk på [Retur].
    3. Type, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 og tryk på [Retur].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol tillader immunoprecipitation fra frosne tumor væv og cellelinjer, der kan udføres på snesevis af prøver parallelt med en høj overførselshastighed metode (figur 1A). Kromatin fragmenter bør variere mellem ~ 200-1000 bps for optimal immunoprecipitation. Vi har bemærket, at tid til at opnå samme klipning længde er forskellig for forskellige væv og celletyper. ChIP fra små mængder af væv succes afhænger holde lysate kolde på alle tidspunkter især under sonikering. Renset ChIP-DN skulle være kvantificeret, før du fortsætter til biblioteket forberedelse (figur 2A). Færdige biblioteker egnet til multiplexing og NGS bør variere mellem ~ 200-600 bp og være blottet for enhver primer dimerer (figur 2B). Ved post sekventering, er der mange kvalitetskontrol måleparametre, der bør være opfyldt, før du fortsætter til yderligere skridt af rørledningen, såsom MACS peak-kald eller ChromHMM analyse (figur 3). Mange af disse målinger kan bestemmes ved hjælp af programmer som FastQC og MultiQC. Kvalitet fastq læser justeres til det menneskelige genom med en sats på ~ 50-80% med et maksimum på en uoverensstemmelse. Anbefalede sekventering dybde er ~ 10-15 millioner entydigt kortlagt læser for "punktkilde" faktorer og ~ 20-30 millioner entydigt kortlagt læser for "brede kilde" faktorer27,41,42,43. Sorterede og indekseret BAM filer bruges til at generere stor kanon-filer, der kan visualiseres ved hjælp af genom browser f.eks IGV eller UCSC. ChIP prøver bør blive beriget over input DNA og enkelte Histon ændring skal vise en klar profil der repræsenterer en bestemt komponent i den epigenetiske landskab (figur 4A). Det er muligt, at i nogle væv vil blive højere niveauer af baggrundsstøj, som kan sløre ChIP-seq signal. Hvis dette sker, er det anbefales at generere input fratrukkede stor kanon filer og re visualisere på en genom-browser. For at bestemme kromatin stat profiler, udnytter vi ChromHMM algoritme24. ChromHMM bruger en flerdimensional skjulte Markov-Model til at identificere den mest fremtrædende re forekommende kombinatorisk og rumlige kromatin mønstre baseret på Histon ændringer undersøgt (figur 5). Ved hjælp af disse seks ændringer ChromHMM identificerer funktionelt adskilte kromatin stater repræsenterer både repressive og aktive domæner, såsom polycomb undertrykkelse (State 1), heterochromatic undertrykkelse (State 5), aktive transskription (State 8 og 9) og aktive smagsforstærkere (stat 13 og 14). Outputtet fra ChromHMM indeholder segmenterede bed filer for hver stat, der kan yderligere bruges til downstream analyse.

Figure 1
Figur 1: arbejde-flow for ChIP modul. Biopsi tumor væv er først Busch og tværbunden for at fange protein-DNA interaktioner. Væv er derefter sonicated for at få kromatin fragmenter velegnet til immunoprecipitation og Histon-DNA komplekser er udfældet ved hjælp af de seks angivne antistoffer. Prøverne vaskes, cross-links tilbageføres og ChIP-DNA er renset og kvantificeres. Biblioteker er genereret fra oprenset DNA og multipleksede ifølge entydige indeks. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Elektroferogrammet analyse af renset ChIP-DNA og udfyldte bibliotek forberedelse. (A) repræsentant elektroferogrammet fra renset ChIP-DNA indeholdende kromatin fragmenter ~ 200-600 bp, der er egnet til biblioteket forberedelse. (B) repræsentant elektroferogrammet fra et udfyldt bibliotek efter forstærkning og dobbelt-sidet Paramagnetiske størrelse udvælgelse, der er egnet til multiplexing og NGS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Arbejde-flow for ChIP-seq databehandling modul. Arbejde-flow vise kritiske trin for ChIP-seq databehandling og forberedelse til downstream analyse. Den rørledning, der anvendes i denne protokol blev genereret ved hjælp af snakemake, men hvert af disse trin kan også udføres individuelt som beskrevet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Genom browservisning af Histon ændring ChIP-seq spor. A) ChIP-seq spor genereret af deeptools viser aktive og undertrykte regioner omkring de nationale tilsynsmyndigheder locus i en repræsentativ melanom tumor prøve. Gener som de nationale tilsynsmyndigheder, CSDE1 er SIKE1 er forbundet med alle aktive Histon ændringer (H3K27ac, H3K4me3 og H3K4me1) og aktive transskription (H3K79me2), der henviser til ledsagende generne AMPD1, DENND2C og SYCP1 indeholder polycomb repressive mark H3K27me3 og ikke indeholde aktive transskription. B) chIP-seq spor genereret af deeptools viser klar heterochromatin på tværs af ZNF gener i repræsentative melanom tumor prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : ChromHMM model baseret på melanom tumor prøver. Emission profil fra en 15-State LearnModel baseret på seks Histon ændringer studerede. ChromHMM identificerer funktionelt adskilte kromatin stater repræsenterer både repressive og aktive domæner, såsom polycomb undertrykkelse (State 1), heterochromatic undertrykkelse (State 5), aktive transskription (State 8 og 9) og aktive smagsforstærkere (State13 og 14 ). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en komplet og omfattende høj overførselshastighed ChIP-seq modul for genome-wide kortlægning af kromatin stater i menneskelige tumor væv og cellelinjer. I ethvert ChIP-seq protokol er et af de vigtigste skridt antistof specificitet. Her, illustreres denne metode immunoprecipitation betingelser for de beskrevne seks Histon ændringer, som alle er ChIP-grade og tidligere har valideret i vores og andre laboratorier42,44,45 . Mens de samme antistof koncentrationer har været anvendt med succes til forskellige andre tumortyper, er det afgørende at fastslå antistof specificitet, hvis studerer forskellige faktorer af interesse27.

Et andet nøgleaspekt for en vellykket eksperiment omfatter optimering af sonikering betingelser. Sonikering tid kan variere både mellem prøve og væv type og skal justeres i overensstemmelse hermed. For korrekt optimering udføres en prøvekørsel for hver prøve af trinvist stigende sonikering tid og løbende kontrol fragment størrelse. For den første ChIP-eksperiment kromatin fragmenter bør variere mellem ~ 200-1000 bp for optimal immunoprecipitation og renset ChIP-DNA skal kvantificeres før man går videre til biblioteket forberedelse. Dette fragment størrelse sikrer optimal generation og fastholdelse af amplificerede DNA (~ 200 til 600 bp), der bruges for multiplexing og NGS. Hvis udfører disse eksperimenter i en høj overførselshastighed måde, er et godt udgangspunkt for multiplexing til pool ~ 8 prøver pr. vognbane til sekvensering. Mens dette beløb af prøver kan producere en lavvandet sekventering dybde, er det nyttig ved afprøvning af antistof kvalitet, før du fortsætter. En af flaskehalsene for samle flere prøver er ulige dækning indlæg sekvensering. En fluoremetric metode baseret kvantitering bruges, men mange en gange det er normalt ikke svarer til sekvensering-ready molekyler i hvert bibliotek. Den bedste metode til kvantitering af bibliotek DNA er at udnytte qPCR ved hjælp af standarder lavet af forudbestemte sekventering-klar DNA molekyler.

En anden kritisk trin i ChIP-Seq datasæt analyse er efter sekvensering databehandling. Vigtigere, før du fortsætter til ethvert aspekt af downstream analyse findes forskellige kvalitetskontrol målinger, der skal være opfyldt, først. Programmer såsom FastQC vil give oplysninger om kvaliteten af rå fastq sekventering læsninger i form af pass eller mislykkes test. Mens fastq læst skal passere de fleste af målinger, omfatter nogle af de mere vigtige prøver basisstatistikker, Per sekvens base kvalitet, pr sekvens kvalitetsresultater og adapter forurening. FastQC-forarbejdede læser justeres til det menneskelige genom og bør kort med en sats på ~ 50-80% med et maksimum på en uoverensstemmelse. Priser er lavere end 50% kan indikere problemer i ChIP, bibliotek forberedelse eller sekvensering og kan omfatte forurening, lav kvalitet ChIP-DNA eller overdreven forstærkning i PCR. Under konvertering af SAM til BAM filer, dublerede læser først blive markeret og derefter fjernes efterfølgende ved hjælp af SAMBLASTER inden vi går videre til ned-prøvetagning. Mens nogle dobbeltarbejde er normal under PCR, er høje niveauer af dobbeltarbejde normalt vejledende af lav kvalitet ChIP-DNA, eller muligvis et problem med biblioteket forberedelse. Outputtet fra FastQC, butterfly og samblaster (kombineret i flagstat) kan alle ledes ind i MultiQC, som giver en komplet interaktiv Resumé af alle resultaterne, kvalitetskontrol. MultiQC viser kvalitetskontrol målinger fra outputfiler fastqc, butterfly og samblaster give oplysninger om grundlæggende statistik, justering procenter og PCR dobbeltarbejde priser henholdsvis.

Efter ned-prøvetagning normalisering, den næste og sandsynligvis vigtigste trin, er datavisualisering benytter en genom gennemser såsom IGV eller UCSC. Hver Histon ændring repræsenterer en nøglen komponent i den epigenetiske lovgivningslandskab, herunder H3K27ac (smagsforstærkere), H3K4me1 (aktiv og klar smagsforstærkere), H3K4me3 (initiativtagere), H3K79me2 (transskriberet regioner), H3K27me3 (polycomb undertrykkelse), og H3K9me3 (heterochromatic undertrykkelse). Ved hjælp af disse mærker, enten alene eller i kombination, kan disse histoner identificere aktiv, klar eller fortrængte smagsforstærkere og projektledere samt transcriptional status kodende regioner. Dette blev demonstreret ved hjælp af ChromHMM, hvor funktionelt adskilte kromatin stater repræsenterer både repressive og aktive domæner blev identificeret. Disse stater blev defineret af ental mærker, såsom polycomb undertrykkelse (H3K27me3), hetrochromatic undertrykkelse (H3K9me3) og aktive transskription (H3K79me2), samt kombinatorisk mærker, såsom aktiv smagsforstærkere (H3K4me1 og H3K27ac) og transskriberet smagsforstærkere (H3K4me1, H3K27ac og H3K79me2).

Den præsenteres integrerede platform er velegnet til bestemmelse af indflytning i histonerne eller transkriptionsfaktorer fra væv prøver. Vi har med succes udnyttet denne protokol til bestemmelse af belægning af de førnævnte seks mærker fra biopsi-størrelse melanom prøver. Dog har vi stadig ikke fastlagt det laveste beløb af væv kræves for succesfuld ChIP-Seq ansøgninger, fordi det er depenedent på vævstype samt tilgængelige antistof. Desuden, selv om vi udnytte rutinemæssigt denne protokol på friske, flash frosset og OCT frosne prøver, har vi ikke optimeret denne protokol for FFPE væv. Nogle nylige undersøgelser har rapporteret protokoller til sådanne væv46,47 og de foreslåede ændringer der kan inkorporeres inden for rammerne af denne platform til at teste, om de præsenteres platform vil være nyttigt fra FFPE væv. Vi mener, at dette vil være meget nyttig i bestemmelse af kromatin tilstand mønstre fra klinisk materiale fra patienter under kliniske forsøg. Samlet set beskriver denne protokol en komplet og omfattende ChIP-seq modul for genome-wide kortlægning af kromatin stater i menneskelige tumor væv, med let for at følge instruktioner omfatter alle de nødvendige komponenter til en vellykket eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke nogen konflikter.

Acknowledgments

Vi takke Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF kerne på MDACC for sekventering støtte. Det arbejde, der er beskrevet i denne artikel blev støttet af tilskud fra NIH grant (CA016672) til SMF kerne og NCI awards (1K99CA160578 og R00CA160578) til K. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma - Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA - IgG-free Sigma - Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag - 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Tags

Kræftforskning spørgsmål 134 ChIP-FF. kromatin immunoprecipitation næste generation sequencing Histon modifikation menneskelige tumor væv metastatisk melanom kromatin stat profiler
En integreret Platform for Genome-wide kortlægning af kromatin stater ved hjælp af høj overførselshastighed ChIP-sekventering i Tumor væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., … More

Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., Maitituoheti, M., Raman, A., Amin, S., Liu, Z., Rai, K. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. J. Vis. Exp. (134), e56972, doi:10.3791/56972 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter