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Cancer Research

ट्यूमर के ऊतकों में उच्च प्रवाह चिप-अनुक्रमण का उपयोग कर क्रोमेटिन राज्यों के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक एकीकृत मंच

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

यहाँ, हम जमे हुए ट्यूमर ऊतकों और सेल लाइनों से जीनोम चौड़ा क्रोमेटिन राज्य पैटर्न के निर्धारण के लिए एक अनुकूलित उच्च प्रवाह चिप अनुक्रमण प्रोटोकॉल और गणनात्मक विश्लेषण पाइपलाइन का वर्णन ।

Abstract

हिस्टोन संशोधनों का epigenome के एक प्रमुख घटक का गठन और संबद्ध loci की transcriptional स्थिति का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण विनियामक भूमिकाएं निभाते हैं । इसके अलावा, विशिष्ट संशोधनों की उपस्थिति की स्थिति और पहचान गैर कोडिंग कार्यात्मक तत्वों ऐसे बढ़ाने के रूप में निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, क्रोमेटिन immunoprecipitation अगली पीढ़ी sequencing (चिप-seq) के बाद व्यक्तिगत हिस्टोन संशोधनों के जीनोम चौड़ा प्रोफाइल का निर्धारण करने में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है । तथापि, यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि क्रोमेटिन संशोधनों के मिश्रित पैटर्न, क्रोमेटिन राज्यों के रूप में भेजा, पहचान और संबद्ध जीनोमिक लोकस की प्रकृति का निर्धारण । इसलिए, कार्यप्रवाह हिस्टोन संशोधन चिह्नों की एक संख्या की रूपरेखा के लिए मजबूत उच्च प्रवाह (एचटी) के तरीके से मिलकर, साथ ही गणनात्मक विश्लेषण पाइपलाइनों चिप के असंख्य Seq रूपरेखा डेटासेट से निपटने में सक्षम, के लिए आवश्यक हैं नमूनों की बड़ी संख्या में epigenomic राज्यों का व्यापक निर्धारण. एचटी-चिप-Seq कार्यप्रवाह यहाँ प्रस्तुत दो मॉड्यूल के होते हैं: 1) एक 96-अच्छी तरह से प्रारूप में ट्यूमर के नमूनों और सेल लाइनों की छोटी मात्रा से कई हिस्टोन संशोधनों की रूपरेखा के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल; और 2) एक गणना डेटा विश्लेषण पाइपलाइन कि मौजूदा उपकरणों को जोड़ती है दोनों व्यक्तिगत निशान अधिभोग और मिश्रित क्रोमेटिन राज्य पैटर्न गणना । एक साथ, इन दो मॉड्यूल एक तेज और कुशल तरीके से चिप Seq नमूनों के सैकड़ों के आसान प्रसंस्करण की सुविधा । यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह मेलेनोमा ट्यूमर और सेल लाइनों में 6 हिस्टोन मार्क प्रोफाइल से क्रोमेटिन राज्य पैटर्न प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कुल मिलाकर, हम एक व्यापक चिप seq कार्यप्रवाह है कि मानव ट्यूमर के नमूनों और कैंसर सेल लाइनों के दर्जनों के लिए लागू किया जा सकता है वर्तमान विभिंन द्रोह में epigenomic विचलन निर्धारित करते हैं ।

Introduction

स्तनधारी जीनोम के बहुमत (98-99%) गैर कोडिंग अनुक्रम के शामिल हैं, और इन nocoding क्षेत्रों में नियामक जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन संगठन1को नियंत्रित करने में भाग लेने के ज्ञात तत्व होते हैं,2। एक सामांय कोशिका में, जीनोमिक डीएनए के विशिष्ट विधानसभा संकुचित क्रोमेटिन संरचना में स्थानिक संगठन, विनियमन और विभिंन डीएनए के सटीक समय के लिए महत्वपूर्ण है-संबद्ध प्रक्रियाओं3,4,5। एक कैंसर कोशिका तथापि, ंयायपालिका epigenetic तंत्र द्वारा क्रोमेटिन संशोधनों में क्रोमेटिन संरचना के अनुचित संगठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, विनियामक तत्वों के लिए उपयोग सहित, गुणसूत्र लूप सिस्टम, और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न6, 7,8,9,10.

हाल के अग्रिमों के बावजूद, हम epigenetic परिवर्तन है कि ट्यूमर प्रगति या चिकित्सीय प्रतिक्रिया के साथ जुड़े रहे है की समझ सीमित है । epigenome संशोधनों की एक सरणी के होते हैं, हिस्टोन के निशान और डीएनए मिथाइल, जो सामूहिक रूप से एक गतिशील राज्य फार्म (क्रोमेटिन राज्य के रूप में निर्दिष्ट) है कि जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क और अंय को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं पर पिंग्स सहित सेलुलर पहचान । हाल ही में, बढ़ाने में परिवर्तन H3K27Ac प्रोफाइल11का अध्ययन करके कई द्रोहियों में दिखाया गया है । हालांकि ऐसे अध्ययनों अलग epigenetic के निशान के संबंध में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, 100 से अधिक epigenetic संशोधनों की पहचान की गई है12,13 उनकी जैविक भूमिकाओं की स्पष्ट समझ के बिना और निर्भरता. इसके अलावा, वहां इन हिस्टोन और डीएनए संशोधनों के संभव मिश्रित पैटर्न की एक भी बड़ी संख्या में हैं, और यह इन मिश्रित पैटर्न-नहीं व्यक्तिगत संशोधनों है-कि epigenetic राज्यों14हुक्म । इसलिए, वहां जबरदस्त कैंसर प्रगति या चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं के दौरान इन क्रोमेटिन राज्यों में परिवर्तन की पहचान की जरूरत है। epigenome के कैंसर में परिवर्तन का व्यापक ज्ञान तकनीकी (जैसे नैदानिक सामग्री की छोटी राशि से बड़े पैमाने पर डेटा की पीढ़ी के कारण भाग में ठंड गया है/एकल कोशिकाओं) और विश्लेषणात्मक (उदाहरण के लिए परिभाषित एल्गोरिदम मिश्रित स्टेट्स) चुनौतियां । इसलिए, नैदानिक सामग्री से हिस्टोन संशोधन के निशान की बड़ी संख्या की रूपरेखा और मिश्रित पैटर्न जो सुविधा होगी की भविष्यवाणी करने के लिए आसान गणना दृष्टिकोण को लागू करने के लिए मजबूत उच्च प्रवाह तरीकों के लिए महत्वपूर्ण जरूरत है tumorigenesis और उपचारात्मक प्रतिरोध के विभिंन चरणों के साथ जुड़े epigenetic राज्यों का निर्धारण । इसके अलावा, हाल ही में epigenome profile अध्ययनों से उपलब्ध डेटा15,16,17,18,19,20,21, 22,23 सामांय ऊतकों में और सेल लाइनों ट्यूमर जीव विज्ञान के लिए epigenome योगदान में आगे अंतर्दृष्टि के लिए ट्यूमर के क्रोमेटिन प्रोफाइल के साथ एकीकृत किया जा सकता है ।

क्रोमेटिन विभिंन क्रोमेटिन संशोधनों के वैश्विक बाध्यकारी पैटर्न की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है15,24। हाल के वर्षों में, चिप seq एक वैश्विक स्तर पर25,26,27पर डीएनए-प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए "स्वर्ण मानक" बन गया है । किसी भी चिप-seq प्रयोग के लिए, इसकी सफलता के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदम हैं, जिसमें टिशू प्रोसेसिंग और संबद्धता, इष्टतम sonication की स्थिति को शामिल करना, तेज वर्षा के लिए इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता, पुस्तकालय की तैयारी, पोस्ट अनुक्रमण डेटा प्रोसेसिंग, और बहाव विश्लेषण । इन कदमों में से प्रत्येक मुख्य गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों होते हैं, और जब एक साथ लिया, ठीक कार्यात्मक सत्यापन के लिए संभावित लक्ष्यों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण हैं । इन चरणों में नवाचार के माध्यम से, कई पूर्व अध्ययनों के तरीकों के ऊतकों की छोटी राशि से चिप या चिप Seq प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया है28,29,30,31,32 . इसके अलावा, कुछ अध्ययनों से अधिक के लिए प्रोटोकॉल का सुझाव दिया है-प्रवाह चिप प्रयोग के बाद पीसीआर आधारित quantitation33,34। अंत में, चिप के लिए कुछ सार्वजनिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण प्लेटफार्मों-Seq डेटा Easeq35 और आकाशगंगा36के रूप में अब उपलब्ध हैं । हालांकि, चिप के प्रदर्शन के लिए एक एकीकृत मंच-Seq एक अभिकलन पाइप लाइन के साथ संयोजन में एक उच्च प्रवाह फैशन में एकल चिह्न प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्रोमेटिन राज्य विश्लेषण के अभाव रहा है ।

इस प्रोटोकॉल ट्यूमर ऊतकों और सेल लाइनों में क्रोमेटिन राज्यों की जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक पूर्ण और व्यापक चिप seq कार्यप्रवाह का वर्णन, आसान दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए एक सफल प्रयोग के लिए आवश्यक कदम के सभी शामिल । पहले Blecher-Gonen एट अल द्वारा वर्णित एक उच्च प्रवाह पद्धति अपनाने से । 37, इस प्रोटोकॉल समानांतर में नमूनों के दर्जनों पर प्रदर्शन किया जा सकता है और कैंसर सेल लाइनों और मेलेनोमा, बृहदांत्र, प्रोस्टेट, और ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी के रूप में मानव ट्यूमर पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है । हम छह कोर हिस्टोन संशोधनों कि मानव मेलेनोमा सेल लाइनों और ट्यूमर के नमूनों में epigenetic विनियामक परिदृश्य के प्रमुख घटकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए पद्धति का प्रदर्शन । इन संशोधनों में H3K27ac (बढ़ाने वाले), H3K4me1 (सक्रिय और अग्रसर बढ़ाने वाले), H3K4me3 (प्रवर्तक), H3K79me2 (प्रतिलिखित क्षेत्र), H3K27me3 (polycomb दमन), और H3K9me3 (heterochromatic दमन) शामिल हैं । ये निशान या तो अकेले या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है कार्यात्मक अलग क्रोमेटिन दोनों दमित और सक्रिय डोमेन का प्रतिनिधित्व राज्यों की पहचान ।

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Protocol

सभी नैदानिक नमूनों को संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशानिर्देशों के बाद प्राप्त किया गया.

1. बफर तैयारी

  1. ते बफर के 200 मिलीलीटर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 10 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) पीएच 8.0) बनाओ ।
  2. एसटी बफर के 200 मिलीलीटर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 10 मिमी EDTA पीएच 8.0, 140 मिमी NaCl) बनाओ ।
  3. 200 मिलीलीटर की 2.0 मीटर glycine (glycine के ३७.५२ ग्राम को 200 मिलीलीटर पानी में) और इसे 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें ।
  4. 5% सोडियम deoxycholate (doc) समाधान के 200 मिलीलीटर (डॉक्टर के 10 ग्राम पानी की 200 मिलीलीटर में) बनाओ ।
  5. चिप फसल बफर के 500 मिलीलीटर बनाओ (12 मिमी Tris-सीएल, 0.1 x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब), 6 मिमी EDTA, 0.5% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस)) ।
  6. चिप कमजोर पड़ने बफर के 500 मिलीलीटर (10 मिमी Tris-सीएल, 140 मिमी NaCl, 0.1% डॉक्टर, 1% ट्राइटन-एक्स, 1 मिमी EDTA) बनाओ ।
  7. RIPA वॉश बफर (एसटी, 1% ट्राइटन एक्स-100, 0.1% एसडीएस, 0.1% डॉक्टर) के 500 मिलीलीटर बनाओ ।
  8. RIPA/500 वॉश बफर (RIPA बफर + 360 mM NaCl) के 500 मिलीलीटर बनाओ ।
  9. LiCL वॉश बफर के 500 मिलीलीटर (ते, 250 मिमी LiCL, 0.5% NP-40, 0.5% डॉक्टर) बनाओ ।
  10. डायरेक्ट रेफरेंस बफर के 500 मिलीलीटर बनाएं: 10 एमएम Tris-सीएल पीएच 8.0, 5 एमएम EDTA, 300 एमएम NaCl, 0.5% एसडीएस ।
  11. एंटीबॉडी बाध्यकारी/अवरुद्ध बफर के 50 मिलीलीटर (पंजाब + 0.1% के बीच-20 + 0.2% आईजीजी मुक्त BSA) बनाओ ।

2. ऊतक/सेल लाइन प्रसंस्करण और पार से जोड़ने

  1. यदि ऊतक जमी फ़्लैश है, बर्फ पर यह पृथक्करण से पहले गल ।
  2. असंबद्ध 50 ऊतक के मिलीग्राम (~ 8 हिस्टोन संशोधन एंटीबॉडी प्रति मिलीग्राम) हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 2 मिलीलीटर में मैंयुअल रूप से एक बाँझ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर । एक बाँझ ऊतक संस्कृति पकवान में लगभग 5 मिनट के लिए 3 से 4 मिमी टुकड़े में ऊतक कीमा बनाना ।
  3. एक dissociator ट्यूब में ऊतक और HBSS समाधान स्थानांतरण और HBSS के एक और 8 मिलीलीटर जोड़ें । इसके अलावा homogenized तक एक dissociator का उपयोग ऊतक असंबद्ध ।
  4. मेलेनोमा ट्यूमर के लिए, एक dissociator में ट्यूबों जगह और इस क्रम में हर एक बार निंनलिखित चक्र चलाने: h_tumor_ 01.01, h_tumor_ 02.01, h_tumor_ 03.01 और m_heart_ 02.01 ।
  5. 21 × 106 कोशिकाओं के माध्यम से 10 मिलीलीटर में परिमार्जन (~ 3 × 106 हिस्टोन संशोधन और इनपुट के प्रति; यह दुर्लभ आबादी के लिए निशान प्रति 100,000 कोशिकाओं को कम किया जा सकता है) एक मानक ऊतक संस्कृति पकवान में वृद्धि हुई है और उंहें एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में इकट्ठा ।
    नोट: मीडिया प्रतिनिधि मेलेनोमा सेल लाइन WM115 के लिए इस्तेमाल किया DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 5% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक है ।
  6. Crosslink ऊतक (या कोशिकाओं के लिए मध्यम के 3 मिलीलीटर) के लिए 16% formaldehyde प्रति 3 मिलीलीटर HBBS के 200 µ एल जोड़कर एक 1% अंतिम formaldehyde एकाग्रता का उपयोग कर ऊतक/ 37 डिग्री सेल्सियस पर ठीक 10 मिनट के लिए एक मिक्सर का उपयोग कर 10 rpm पर मिश्रण शेक ।
    चेतावनी: Formaldehyde विषाक्त है और एक उचित धुएं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  7. नमूना के 3 मिलीलीटर प्रति 2.0 M glycine के 200 µ एल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 5 मिनट के लिए 10 rpm पर मिलाते हुए जारी है ।
    नोट: Glycine एक शमन के रूप में कार्य करता है । ताजा glycine समाधान हर महीने के रूप में पीएच पीएफ समाधान समय के साथ जाता है बनाओ ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 934 x g में नमूनों को एक benchtop केंद्रापसारक का प्रयोग स्पिन । supernatant निकालें, बर्फ ठंडा पंजाबियों के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, फिर 934 x g पर नमूने केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
  9. फ्लैश गोली फ्रीज और यह दुकान पर-80 डिग्री सेल्सियस आगे प्रसंस्करण के लिए ।

3. ऊतक Lysis, Sonication, और एंटीबॉडी तैयारी

  1. चिप फसल बफर के 10 मिलीलीटर प्रति 1 तंग अवरोधक गोली भंग ।
  2. 50 ऊतक के मिलीग्राम प्रति छेड़ने अवरोधकों के साथ चिप फसल बफर के 300 µ एल जोड़ें और बर्फ पर lysis के 30 मिनट की अनुमति दें ।
    नोट: WM115 मेलेनोमा सेल लाइनों के 1 X 107 के प्रति चिढ़ाने के साथ चिप हार्वेस्ट बफर के 300 µ एल जोड़ें ।
  3. कोशिकाओं lysing हैं, जबकि waterbath अवरोधक और संबद्ध शीतलन प्रणाली पर बारी और तापमान 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं । waterbath अवरोधक में sonicator ट्यूबों प्लेस और 30 एस पर 60 चक्र के लिए मेलेनोमा ऊतकों sonicate और 30 एस बंद ~ 200-600 आधार जोड़े (बीपी) के क्रोमेटिन टुकड़े प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: Sonication समय ऊतक प्रकार के बीच अलग कर सकते हैं और तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । यह एक महत्वपूर्ण कदम है और immunoprecipitation के लिए आगे बढ़ने से पहले पायलट प्रयोग में अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  4. sonication के दौरान, धोने 20 µ एल के प्रति एंटीबॉडी प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों का नमूना तीन बार का उपयोग कर के 1000 µ l बाइंडिंग/अवरुद्ध बफर (पंजाब + 0.1% के बीच-20 + 0.2% BSA) ।
  5. के लिए ~ 8 मेलेनोमा ऊतक के मिलीग्राम, एक ट्यूब रिवॉल्वर का उपयोग रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए बाइंडिंग/अवरुद्ध बफर के 100 µ एल में प्रत्येक हिस्टोन एंटीबॉडी के 3 µ जी । एक विलक्षण एंटीबॉडी के लिए 12 नमूने मोतियों की 240 µ l होते हैं, एंटीबॉडी के 36 µ जी और 1200 µ बाइंडिंग के एल/
    नोट: 3 × 106 कोशिकाओं के लिए, प्रत्येक एंटीबॉडी और एंटीबॉडी प्रति प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों की 30 µ एल के 5 µ जी का उपयोग करें । एंटीबॉडी और प्रोटीन-जी मोतियों का titrated होना चाहिए अगर विभिन्न मात्रा में टिशू का इस्तेमाल किया जा रहा है । इस प्रोटोकॉल वर्णित छह हिस्टोन संशोधनों (सामग्री की तालिका) के लिए immunoprecipitation शर्तों दिखाता है, तथापि, एंटीबॉडी सांद्रता अंय संशोधनों और प्रतिलेखन कारकों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  6. अंश का आकार निर्धारित करने के लिए, sonciated क्रोमेटिन समाधान के 20 µ l को निकालें और एक रेफरेंस बफ़र मास्टर मिक्स (कमरे का तापमान) जिसमें सीधे रेफरेंस बफर के 44 µ l को शामिल करें, 1 µ l की RNase (20mg/एमएल), और 5 µ l Proteinase K (20mg/एमएल) के प्रति नमूना जोड़ें । 50 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए एक पीसीआर थर्मल साइकिल चालक में नमूनों की मशीन । निर्माताओं के निर्देश के बाद एक पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर नमूना शुद्ध ।
  7. सुनिश्चित क्रोमेटिन के लिए 3.6 कदम आगे बढ़ने से पहले एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए electropherogram साधन का उपयोग कर टुकड़ा आकार का निर्धारण द्वारा पर्याप्त कतरनी है । electropherogram यंत्र चालू करा.
  8. लोड 2 µ एक 8 अच्छी तरह से ऑप्टिकल ट्यूब पट्टी के प्रत्येक कुआं में उच्च संवेदनशीलता बफर एजेंट के एल । शेष कुओं में शुद्ध नमूनों की पहली अच्छी तरह से और 2 µ एल में उच्च संवेदनशीलता सीढ़ी के 2 µ एल लोड ।
  9. ट्यूब stips पर ऑप्टिकल ट्यूब टोपियां और भंवर 1 मिनट के लिए 2000 rpm पर नमूनों प्लेस । ढक्कन खोलो और एक नया उच्च संवेदनशीलता स्क्रीन टेप और लोड हो रहा है सुझावों के बॉक्स डालें । पट्टी टोपियां निकालें और electropherogram साधन में नमूने लोड ।
  10. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें, स्क्रीन टेप पर पहले तेरह रिक्तियों को हाइलाइट करें और निचले दाएँ कोने में प्रारंभ टैब दबाएँ. क्रोमेटिन ~ 200-1000 बीपी के बीच लेकर टुकड़े चिप के लिए उपयुक्त हैं ।
  11. sonicated समाधान स्थानांतरण बाँझ ट्यूबों के लिए और २१,१३० x पर ट्यूबों स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक तालिका शीर्ष केंद्रापसारक का उपयोग कर । नई ट्यूबों के लिए supernatant स्थानांतरण ।
  12. supernatant का कुल वॉल्यूम निर्धारित करें और इनपुट नियंत्रण के लिए कुल समाधान का 10% निकालें और 4 ° c पर संग्रहीत करें ।

4. क्रोमेटिन Immunoprecipitation

  1. चिप कमजोर पड़ने बफर के 20 मिलीलीटर प्रति 2 चिढ़ाने अवरोधक गोलियाँ भंग.
  2. sonication के बाद शेष नमूना 5 बार चिप कमजोर पड़ने बफर का उपयोग करने एसडीएस स्तर 0.1% नीचे लाने के लिए पतला । पतला चिप कमजोर पड़ने बफर के 1080 µ एल के साथ शेष supernatant के 270 µ एल का एक अंतिम कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए 1350 µ एल
  3. जब एंटीबॉडी और प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों की गर्मी खत्म, एक चुंबक पर ट्यूब जगह और supernatant हटा दें ।
  4. अभी भी चुंबक पर बैठे ट्यूब के साथ, टीज़ अवरोधकों के साथ चिप कमजोर पड़ने बफर के 750 µ एल जोड़कर एक बार मोती धोने ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है करने के लिए मोती परेशान नहीं है या इस कदम के दौरान ट्यूबों घुमाएगी ।
  5. चिप कमजोर पड़ने बफर धोने निकालें और एक ही चिप कमजोर पड़ने बफर के 240 µ एल में मोतियों को फिर से सस्पेंड । 12 अलग ट्यूबों में मोतियों की Aliquot 20 µ एल, जिनमें से प्रत्येक एक अलग ऊतक नमूने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  6. विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन जी मोतियों को समान रूप से sonicated सामग्री Aliquot और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक ट्यूब रिवॉल्वर का उपयोग कर tumble ।

5. Immunoprecipitated डीएनए की धुलाई और रिवर्स Crosslinking-प्रोटीन कॉंप्लेक्स

  1. रिवर्स crosslinking के बाद अगली सुबह, एक 96-अच्छी तरह से थाली के लिए एंटीबॉडी-प्रोटीन समाधान हस्तांतरण और यह चुंबकीय स्टैंड पर जगह है । की अनुमति दें मोतियों की माला का पालन करने के लिए कम से 30 एस और supernatant को दूर ।
  2. मोती धो एक बहु चैनल प्लास्टिक का उपयोग कर बर्फ ठंडा RIPA धोने बफर के 150 µ एल के साथ 5 बार । धोने के चरणों के दौरान, मोती प्लास्टिक नहीं है, लेकिन सही से चुंबक लगातार ले जाने के लिए 30 प्रति धोने के लिए छोड़ दिया ।
  3. दो बार के नमूनों को धो लें 150 µ l के साथ आइस-कोल्ड RIPA-500 वाश बफर.
  4. नमूनों को दो बार धो लें 150 µ के साथ बर्फ ठंडा LiCl धोने बफर के एल ।
  5. नमूनों को एक बार धोकर 150 µ l के साथ बर्फ-ठंडा ते धो बफर और निकालें बफर तुरंत । यह चरण कम इनपुट अनुप्रयोगों के लिए छोड़ा जा सकता है ।
  6. 96-अच्छी तरह से चिप डीएनए नमूने युक्त प्लेट के ताजा कुओं में 3.7 कदम से इनपुट नियंत्रण जोड़ें ।
  7. वाशिंग स्टेप्स के बाद इसमें एक रेफरेंस बफर मास्टर मिक्स (कमरे का तापमान) जिसमें डायरेक्ट रेफरेंस बफर के 44 µ एल, RNase के 1 µ एल (20mg/एमएल) और 5 µ एल Proteinase K (20mg/एमएल) प्रति चिप और रिवर्स crosslinking के लिए इनपुट सैंपल शामिल हैं ।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस, 4 एच पर 50 डिग्री सेल्सियस और 65 डिग्री सेल्सियस पर 8-16 एच में 4 एच के लिए एक पीसीआर थर्मल साइकिल चालक का उपयोग कर नमूने की मशीन ।

6. उपजी डीएनए की शुद्धि और ठहराव

  1. अगली सुबह, नमूने चुंबक पर वापस प्लेस और एक नया 96-खैर पीसीआर प्लेट जो immunoprecipitated डीएनए शामिल करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
  2. हल करने के लिए 2.3 x paramagnetic मोती जोड़ें (समाधान के 50 µ एल के लिए 115 µ एल) और ध्यान से प्लास्टिक ऊपर और नीचे 25 बार एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर । समाधान अगर ठीक से मिला समरूप बन जाएगा ।
  3. 4 मिनट के लिए चुंबक से कमरे के तापमान पर समाधान की मशीन । नमूनों चुंबक पर वापस प्लेस और एक और 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । supernatant को छोड़ें ।
  4. जबकि चुंबक पर नमूने छोड़ने, 70% इथेनॉल के 150 µ एल जोड़ने (vol/) और मोती परेशान बिना 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  5. इथेनॉल निकालें और धो दोहराएं । 5 मिनट के लिए चुंबक पर शुष्क हवा के लिए paramagnetic मोतियों की अनुमति दें ।
    नोट: शेष इथेनॉल शुद्धि के साथ हस्तक्षेप करेंगे के रूप में दूसरा धोने के बाद सभी इथेनॉल निकालें ।
  6. चुंबक से नमूने निकालें और 10 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.0 के 30 µ एल जोड़ें । pipetting द्वारा मिश्रण 25 बार और 4 मिनट के लिए चुंबक से कमरे के तापमान पर नमूनों की मशीन ।
  7. चुंबक पर नमूनों को वापस प्लेस और एक और 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन हस्तांतरण 20 प्रत्येक नमूने के µ एल के लिए एक नया 96-पुस्तकालय तैयार करने के लिए अच्छी तरह से थाली । पुस्तकालयों की पीढ़ी के साथ किसी भी संभावित मुद्दों के मामले में चिप डीएनए के शेष 10 µ एल की दुकान ।
  8. इस स्तर पर, पुस्तकालय तैयारी से पहले चिप डीएनए यों तो है । डीएनए एकाग्रता उच्च संवेदनशीलता डीएनए रिएजेंट के साथ मापा जाता है । एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए electropherogram साधन आगे बढ़ने के लिए 7.1 कदम का उपयोग करते हुए उपजी डीएनए के आकार वितरण का निर्धारण ।

7. पुस्तकालय NEBNext अल्ट्रा द्वितीय डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर पीढ़ी

  1. निर्माता से अनुशंसित प्रोटोकॉल के बाद डीएनए लाइब्रेरी तैयारी का उपयोग NGS अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों उत्पन्न करते हैं । सभी प्रतिक्रियाओं 96 में प्रदर्शन कर रहे हैं-अच्छी तरह से प्लेटें और गर्मी ढक्कन तापमान सेट के साथ एक पीसीआर थर्मल साइकिल चालक में प्रदर्शन कर रहे हैं > 100 डिग्री सेल्सियस और 50 µ एल पर सेट की मात्रा
  2. इंडेक्सेस के लिए NGS प्लेटफॉर्म के लिए मल्टीप्लेक्स ओलिगोस्पर्मिया का इस्तेमाल किया जाता है । निंनलिखित सेटिंग्स का उपयोग पीसीआर प्रवर्धन के लिए 10x चक्र की कुल प्रदर्शन: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, विकार के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 एस, एनीलिंग/विस्तार के लिए 65 ° c पर 30 s (10x चक्र), के लिए अंतिम विस्तार 65 ° c पर प्रारंभिक विकार 5 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
    नोट: 1 तालिका पीसीआर प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल प्राइमरों शामिल हैं ।
  3. पीसीआर प्रवर्धन के बाद, नमूनों को हटाने और nuclease मुक्त पानी का उपयोग कर 100 µ एल करने के लिए कुल मात्रा लाने. डबल-पक्षीय paramagnetic आकार चयन (0.55 x/0.8 x) पहले 55 µ l को जोड़ने के द्वारा मोतियों की एल और pipetting द्वारा मिश्रण 25 बार । 4 मिनट के लिए चुंबक से कमरे के तापमान पर नमूनों की मशीन ।
  4. एक चुंबक पर नमूने वापस प्लेस और एक और 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । इस चरण के लिए sequencing के लिए अनुपयुक्त है कि मोतियों पर बड़े टुकड़े को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  5. supernatant एक नया 96-well पीसीआर प्लेट के लिए स्थानांतरण । supernatant त्याग न करें क्योंकि इसमें आंशिक रूप से शुद्ध डीएनए होता है ।
  6. pipetting 25 बार और 4 मिनट के लिए चुंबक से कमरे के तापमान पर गर्मी से paramagnetic मोती और मिश्रण के एक और 25 µ एल जोड़ें ।
  7. जगह नमूने चुंबक पर वापस और एक और 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी और supernatant त्यागें । इस चरण के टुकड़ों को बनाए रखने के लिए उपयोग किया जाता है ~ 200 करने के लिए 600 bp कि अंतिम रूप दिया पुस्तकालयों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  8. जबकि चुंबक पर नमूने छोड़ने, 70% इथेनॉल के 150 µ एल जोड़ने (वी/) और मोती परेशान (जबकि चुंबक पर कदम नहीं है) के बिना 30 एस के लिए मशीन की अनुमति देते हैं । इथेनॉल निकालें और धो एक दूसरी बार दोहराएं ।
  9. 5 मिनट के लिए चुंबक पर शुष्क हवा के लिए paramagnetic मोतियों की अनुमति दें । शेष इथेनॉल के रूप में दूसरा धोने के बाद सभी इथेनॉल निकालें शुद्धि के साथ हस्तक्षेप करेंगे ।
  10. चुंबक से नमूने निकालें और 10 मिमी Tris-सीएल पीएच 8.0 के 25 µ एल जोड़ें । pipetting द्वारा मिश्रण 25 बार और 4 मिनट के लिए चुंबक से कमरे के तापमान पर गर्मी । एक और 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबक और गर्मी पर वापस नमूनों प्लेस ।
  11. आकारों को सुनिश्चित करने के लिए मल्टीप्लेक्सिंग से पहले एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए electropherogram साधन का उपयोग कर पुस्तकालयों को बढ़ाता है अनुक्रमण के लिए उपयुक्त हैं । पूरा पुस्तकालयों 200-600 बीपी के बीच सीमा और सभी प्राइमरी dimers से रहित हैं ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, एक और 0.7 x paramagnetic मनका शुद्धि ~ 130 बीपी पर मौजूद है कि अवांछित प्राइमरी dimers को दूर करने के लिए किया जाता है ।
  12. पूल एकाग्रता के अनुसार अद्वितीय सूचकांक प्राइमरों के आधार पर quantified डीएनए । 1 एनजी/µ एल और 6ng/µ एल के बीच सांद्रता के साथ छह नमूनों वाले एक पूल के लिए, वितरण सबसे कम नमूना के 15 µ एल और उच्चतम नमूना के 2.5 µ l है । यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है पढ़ें गिनती समान रूप से प्रवाह सेल के प्रत्येक लेन पर वितरित किया जाएगा ।

8. पोस्ट चिप-seq डाटा प्रोसेसिंग

  1. snakemake38,39 पर आधारित पाइपलाइन एक एकल आदेश में निम्न चरणों में से सभी की प्रक्रिया करने के लिए उपयोग किया जाता है । महत्वपूर्ण बात, इन चरणों के प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से संबद्ध आदेश के साथ चर्चा की है ।
  2. कच्चे fastq अनुक्रमण की गुणवत्ता का निर्धारण FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) का उपयोग कर पढ़ता है: ओपन यूनिक्स टर्मिनल और परिवर्तन निर्देशिका (सीडी) छह हिस्टोन संशोधनों में से प्रत्येक के लिए कच्चे fastq फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर में । unix टर्मिनल प्रकार में, fastqc * fastq. gz और प्रेस [वापसी] । यह फ़ोल्डर में सभी fastq फ़ाइलों पर गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स चला जाएगा ।
  3. संदर्भ जीनोम में गुणवत्ता पढ़ता संरेखित करें और bam फ़ाइलों के लिए संपीड़न से पहले डुप्लिकेट निकालें । यह bowtie संस्करण 1.1.239, SAMBLASTER संस्करण 0.1.2140, और SAMTOOLS संस्करण 1.3.141का उपयोग किया जाता है: unix टर्मिनल प्रकार में, bowtie-m 1-n 1--सर्वोत्तम--स्तर-S-q/path_to/hg19 histone1. fastq. gz | samblaster-removeDups | samtools देखें-Sb-> histone1. bam और प्रेस [वापसी] ।
    नोट: path_to hg19 मानव जीनोम विधानसभा युक्त फ़ोल्डर को इंगित करता है । यह ब्याज की जीव के आधार पर बदल जाएगा ।
  4. निम्न आदेश के साथ SAMTOOLS का उपयोग कर bam फ़ाइलों को सॉर्ट करें: unix टर्मिनल प्रकार में, SAMTOOLS सॉर्ट histone1. bam-m 2जी-@ 5-T histone1. temp-o histone1. क्रमबद्ध और प्रेस [वापसी] ।
  5. निम्न आदेश के साथ SAMTOOLS का उपयोग करके अनुक्रमणिका bam फ़ाइलें: unix टर्मिनल प्रकार में, SAMTOOLS अनुक्रमणिका histone1. सॉर्ट किया गया. bam histone1. सॉर्टेड. bam. बाई और प्रेस [वापसी] ।
  6. निम्न आदेश के साथ SAMTOOLS flagstat का उपयोग करते हुए अनन्य रूप से मैप की गई और unreading पढ़ता का निर्धारण: unix टर्मिनल प्रकार में, SAMTOOLS flagstat histone1. सॉर्ट किए गए bam और दबाएँ [RETURN] ।
  7. निम्न आदेश के साथ रैंडम नमूना करने से पठन गणना प्रति bam फ़ाइलों को सामान्य करें: unix टर्मिनल प्रकार में, sambamba दृश्य-f bam-नमूना-बीज = 3-s 0. X histone1. सॉर्टेड. bam | samtools मीडियाकर्मी-m 2जी-@ 5-T histone1. downsample. temp-o histone1. downsample. सॉर्टेड. bam and दबाएँ [RETURN].
  8. निम्न आदेश के साथ SAMTOOLS का उपयोग कर फिर से bam फ़ाइलें अनुक्रमणिका: unix टर्मिनल प्रकार में, SAMTOOLS index हिस्टोन. downsample. सॉर्ट किए गए. bam हिस्टोन. downsample. सॉर्टेड. bam. बाई और प्रेस [वापसी] ।
  9. एक जीनोम ब्राउज़र पर चिप seq पुस्तकालयों कल्पना (यानी UCSC या IGV), deepTools संस्करण 2.4.040 का उपयोग करके bigwig फ़ाइलें जनरेट करें bam फ़ाइलों को प्रति kilobase प्रति मिलियन (RPKM) को पढ़ता है । यह निंन आदेशों का उपयोग कर किया जा सकता है:
    1. मानक bigwig फ़ाइलों के लिए: unix टर्मिनल प्रकार में, bamCoverage-b histone1 । downsample. bam--normalizeUsingRPKM--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200-o histone1.bw और प्रेस {RETURN] ।
    2. इनपुट घटाई bigwig फ़ाइलों के लिए: unix टर्मिनल प्रकार में, bamCompare--bamfile1 histone1. downsample. सॉर्ट किया गया. bam--bamfile2 input1. downsample. सॉर्ट किया गया. bam--normalizeUsingRPKM--अनुपात घटाना--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200-o histone1.subtracted.bw और प्रेस [वापसी] ।
  10. चिप-seq (एमएसीएस) संस्करण 1.4.225,26 और संस्करण 2.1.0 के मॉडल आधारित विश्लेषण का उपयोग कर "इनपुट" पृष्ठभूमि पर चिप seq संकेत संवर्धन की पहचान करें । "बिंदु स्रोत" कारकों के लिए macs1 का प्रयोग करें H3K4me3, H3K4me1 और H3K27ac और macs2 के लिए "व्यापक स्रोत" कारकों H3K79me2, H3K27me3 और H3K9me3 । यह निम्न आदेशों का उपयोग किया जाता है:
    1. बिंदु स्रोत के लिए: unix टर्मिनल प्रकार में, macs14-t histone1. downsample. सॉर्ट किया गया. bam-c input1. downsample. सॉर्ट किया गया. bam-g hs-f bam-p 1e-5--nomodel--रखें-डप all-n histone1. फ़ाइल और प्रेस [वापसी] ।
    2. व्यापक स्रोत के लिए: unix टर्मिनल प्रकार में, macs2 callpeak-t histone1 । downsample. bam-c input1. downsample. सॉर्टेड. bam-g hs-f bam-p 1e-6--ब्रॉड--ब्रॉड-कटऑफ 1e-6---डप सब--nomodel-n histone1. फाइल और प्रेस [वापसी] ।
  11. का प्रयोग करें ChromHMM24 मिश्रित क्रोमेटिन राज्य हिस्टोन संशोधनों के आधार पर निंनलिखित कमांड का प्रयोग अध्ययन के पैटर्न की पहचान:
    1. यूनिक्स टर्मिनल प्रकार में, सीडी/path_to/ChromHMM_folder और प्रेस [वापसी] ।
    2. एक बार ChromHMM निर्देशिका प्रकार में, जावा-mx2G-जार ChromHMM. jar BinarizeBam-b 1000 hg19. txt/path_to/bam_directory/path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output और प्रेस [वापसी] ।
    3. प्रकार, जावा-mx2G-जार ChromHMM. जार LearnModel-b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 और प्रेस [वापसी] ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल एक उच्च प्रवाह विधि का उपयोग करते हुए समानांतर में नमूनों के दर्जनों पर किया जा सकता है कि जमे हुए ट्यूमर ऊतकों और सेल लाइनों से immunoprecipitation की अनुमति देता है (चित्र 1a). क्रोमेटिन टुकड़े इष्टतम immunoprecipitation के लिए ~ 200-1000 बीपीएस के बीच सीमा चाहिए । हमने उल्लेख किया है कि एक ही बाल काटना लंबाई प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय अलग ऊतक और कोशिका प्रकार के लिए अलग है । ऊतक की छोटी मात्रा से चिप की सफलता हर समय विशेष रूप से sonication के दौरान lysate ठंडा रखने पर निर्भर करता है । पुस्तकालय तैयारी (चित्रा 2a) के लिए आगे बढ़ने से पहले शुद्ध चिप-डीएन Ashould quantified हो । मल्टीप्लेक्सिंग और NGS के लिए उपयुक्त पूरा पुस्तकालय ~ 200-600 बीपी के बीच सीमा चाहिए और किसी भी प्राइमरी dimers (चित्रा बीसी) से रहित होना चाहिए । पोस्ट-sequencing पर, जैसे कि mac पीक कॉलिंग या ChromHMM विश्लेषण (चित्र 3), पाइपलाइन के आगे के चरणों के लिए कार्यवाही करने से पहले पूरा किया जाना चाहिए कई गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स हैं । इन मैट्रिक्स के कई FastQC और MultiQC जैसे कार्यक्रमों का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । गुणवत्ता fastq पुस्तकें ~ 50-80% की दर से मानव जीनोम के लिए एक बेमेल की एक अधिकतम के साथ गठबंधन कर रहे हैं । एक अनुशंसित sequencing गहराई है ~ 10-15 मिलियन अनन्य रूप से मैप की गई पढ़ता "बिंदु स्रोत" कारक के लिए और ~ 20-30 मिलियन अनन्य रूप से मैप किया गया पढ़ता "व्यापक स्रोत"कारकके लिए 27, 41, 42, 43. सॉर्ट और अनुक्रमित BAM फ़ाइलों bigwig फ़ाइलें कि IGV या UCSC जैसे जीनोम ब्राउज़र का उपयोग कर visualized किया जा सकता उत्पंन करने के लिए उपयोग किया जाता है । चिप नमूने इनपुट डीएनए पर समृद्ध किया जाना चाहिए और प्रत्येक हिस्टोन संशोधन एक अलग epigenetic परिदृश्य के एक विशिष्ट घटक (चित्रा 4a)का प्रतिनिधित्व प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करना चाहिए. यह संभव है कि कुछ ऊतकों में पृष्ठभूमि शोर के उच्च स्तर जो चिप-seq संकेत अस्पष्ट कर सकते हो जाएगा । यदि ऐसा होता है, यह इनपुट घटाया bigwig फ़ाइलें और फिर से एक जीनोम ब्राउज़र पर कल्पना उत्पंन करने के लिए सिफारिश की है । क्रोमेटिन राज्य प्रोफाइल का निर्धारण करने के लिए, हम ChromHMM एल्गोरिथ्म24का उपयोग । ChromHMM एक बहुभिंनरूपी छिपा मार्कोव मॉडल का उपयोग करता है सबसे प्रमुख पुनः की पहचान करने के लिए मिश्रित और स्थानिक क्रोमेटिन हिस्टोन संशोधनों के आधार पर पैटर्न का अध्ययन किया (चित्रा 5)। इन छह संशोधनों का उपयोग ChromHMM कार्यात्मक विशिष्ट क्रोमेटिन दोनों दमित और सक्रिय डोमेन, जैसे polycomb दमन (राज्य 1), heterochromatic दमन (राज्य 5), सक्रिय प्रतिलेखन (राज्य 8 और 9) का प्रतिनिधित्व करने वाले राज्यों की पहचान करता है और सक्रिय बढ़ाने (राज्य 13 और 14) । ChromHMM से उत्पादन प्रत्येक राज्य है कि आगे बहाव विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए विभाजित बिस्तर फ़ाइलें शामिल हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: चिप मॉड्यूल के लिए कार्य प्रवाह. biopsied किया ट्यूमर ऊतक पहले असंबद्ध और पार से प्रोटीन-डीएनए बातचीत पर कब्जा करने के लिए जुड़ा हुआ है । ऊतक तो immunoprecipitation और हिस्टोन के लिए उपयुक्त क्रोमेटिन टुकड़े प्राप्त करने के लिए sonicated है-डीएनए परिसरों छह संकेत एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए उपजी हैं. नमूनों धोया जाता है, पार लिंक उलट रहे है और चिप-डीएनए शुद्ध और quantified है । पुस्तकालयों को शुद्ध डीएनए से उत्पन्न कर रहे हैं और अद्वितीय अनुक्रमित के अनुसार मल्टीप्लेक्स. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : शुद्ध चिप-डीएनए और पूरा पुस्तकालय तैयार करने के Electropherogram विश्लेषण । (A) प्रतिनिधि electropherogram से शुद्ध चिप-डीएनए युक्त क्रोमेटिन टुकड़े ~ 200-600 बीपी कि पुस्तकालय की तैयारी के लिए उपयुक्त है । (ख) प्रतिनिधि electropherogram के बाद एक पूर्ण पुस्तकालय से प्रवर्धन और डबल पक्षीय paramagnetic आकार चयन कि मल्टीप्लेक्स और NGS के लिए उपयुक्त है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : चिप-seq डेटा प्रोसेसिंग मॉड्यूल के लिए कार्य-प्रवाह । कार्य-प्रवाह चिप-seq डेटा प्रोसेसिंग और बहाव विश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रदर्शित । इस प्रोटोकॉल में उपयोग की गई पाइपलाइन snakemakeका उपयोग करके जेनरेट की गई थी, हालांकि, इन चरणों में से प्रत्येक का वर्णन व्यक्तिगत रूप से भी किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : हिस्टोन संशोधन चिप के जीनोम ब्राउज़र दृश्य-seq पटरियों । एक) चिप seq एक प्रतिनिधि मेलेनोमा ट्यूमर के नमूने में NRAS लोकस आसपास सक्रिय और दमित क्षेत्रों को प्रदर्शित deeptools द्वारा उत्पंन पटरियों । जीन जैसे NRAS, CSDE1 SIKE1 हैं, सभी सक्रिय हिस्टोन संशोधनों (H3K27ac, H3K4me3 और H3K4me1) और सक्रिय प्रतिलेखन (H3K79me2) के साथ जुड़े हुए हैं, जबकि, जीन AMPD1, DENND2C, और SYCP1 polycomb दमन चिह्न H3K27me3 होते है और नहीं सक्रिय प्रतिलेखन शामिल हैं । ख) प्रतिनिधि मेलेनोमा ट्यूमर नमूने में ZNF जीन भर में शिष्ट heterochromatin प्रदर्शित deeptools द्वारा उत्पंन चिप seq पटरियों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : मेलेनोमा ट्यूमर के नमूनों पर आधारित ChromHMM मॉडल । छह हिस्टोन संशोधनों के आधार पर 15-राज्य LearnModel से उत्सर्जन प्रोफ़ाइल का अध्ययन किया । ChromHMM इस तरह के polycomb दमन (राज्य 1), heterochromatic दमन (राज्य 5), सक्रिय प्रतिलेखन (राज्य 8 और 9) और सक्रिय बढ़ाने (State13 और 14 के रूप में दोनों दमित और सक्रिय डोमेन, का प्रतिनिधित्व करने वाले कार्यात्मक विशिष्ट क्रोमेटिन राज्यों की पहचान करता है ). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल मानव ट्यूमर ऊतकों और सेल लाइनों में क्रोमेटिन राज्यों के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक पूर्ण और व्यापक उच्च प्रवाह चिप-seq मॉड्यूल का वर्णन । किसी भी चिप-seq प्रोटोकॉल में, सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक एंटीबॉडी विशिष्टता है । यहां, इस विधि वर्णित छह हिस्टोन संशोधनों, जिनमें से सभी चिप ग्रेड है और पहले हमारे और अंय प्रयोगशालाओं में मांय किया गया है के लिए immunoprecipitation शर्तों दिखाता है42,44,45 . जबकि एक ही एंटीबॉडी सांद्रता सफलतापूर्वक विभिन्न अन्य ट्यूमर प्रकार के लिए लागू किया गया है, यह एंटीबॉडी विशिष्टता का निर्धारण अगर ब्याज के विभिन्न कारकों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है27.

एक सफल प्रयोग के लिए एक और महत्वपूर्ण पहलू sonication शर्तों के अनुकूलन भी शामिल है । Sonication समय दोनों नमूना और ऊतक प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं और तदनुसार समायोजित किया जा करने के लिए है । उचित अनुकूलन के लिए, एक परीक्षण रन वृद्धिशील रूप से sonication समय बढ़ाने और लगातार टुकड़ा आकार की जांच द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए किया जाता है । प्रारंभिक चिप के लिए-प्रयोग क्रोमेटिन टुकड़े के बीच सीमा चाहिए ~ 200-1000 बीपी इष्टतम immunoprecipitation के लिए, और शुद्ध चिप-डीएनए पुस्तकालय तैयार करने के लिए आगे बढ़ने से पहले quantified किया जाना चाहिए । इस टुकड़े आकार सुनिश्चित करता है इष्टतम पीढ़ी और प्रवर्धित डीएनए के प्रतिधारण (~ 200 से 600 बीपी) कि मल्टीप्लेक्स और NGS के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । यदि इन प्रयोगों का एक उच्च-प्रवाह तरीके से प्रदर्शन कर रहा है, तो division के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु पूल है ~ sequencing के लिए प्रति लेन 8 नमूने । नमूनों की इस राशि एक उथले अनुक्रमण गहराई का उत्पादन हो सकता है, यह आगे बढ़ने से पहले एंटीबॉडी गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए उपयोगी है । एक से अधिक नमूने पूलिंग की अड़चनों में से एक असमान कवरेज पोस्ट अनुक्रमण है । आमतौर पर एक fluoremetric विधि आधारित quantitation प्रयोग किया जाता है, तथापि, कई-एक बार यह प्रत्येक पुस्तकालय में sequencing तैयार अणुओं के बराबर नहीं है । पुस्तकालय डीएनए के quantitation के लिए सबसे अच्छा तरीका है-पूर्व निर्धारित sequencing तैयार डीएनए अणुओं का बना मानकों का उपयोग qPCR इस्तेमाल करने के लिए है ।

चिप-Seq डेटासेट विश्लेषण में एक और महत्वपूर्ण कदम के बाद अनुक्रमण डेटा प्रोसेसिंग है । महत्वपूर्ण बात, बहाव विश्लेषण के किसी भी पहलू को आगे बढ़ने से पहले वहां विभिंन गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स है कि पहले से मुलाकात की जानी चाहिए रहे हैं । FastQC जैसे प्रोग्राम रॉ fastq अनुक्रमण की गुणवत्ता के बारे में जानकारी प्रदान करेगा पास या असफल परीक्षण के रूप में पढ़ता है । जबकि fastq पढ़ता मैट्रिक्स के सबसे पास होना चाहिए, और अधिक महत्वपूर्ण परीक्षणों में से कुछ बुनियादी आँकड़े, अनुक्रम आधार गुणवत्ता, प्रति अनुक्रम गुणवत्ता स्कोर, और अनुकूलक संदूषण शामिल हैं । FastQC-संसाधित पढ़ता मानव जीनोम के लिए गठबंधन कर रहे हैं और एक बेमेल की एक अधिकतम के साथ ~ 50-80% की दर से मैप करना चाहिए. 50% से कम दरों चिप, पुस्तकालय की तैयारी या अनुक्रमण में मुद्दों का संकेत हो सकता है और पीसीआर के दौरान संदूषण, कम गुणवत्ता चिप-डीएनए या अधिक प्रवर्धन शामिल कर सकते हैं । BAM फ़ाइलों के लिए SAM के कनवर्ज़न के दौरान, डुप्लिकेट पढ़ता पहले ध्वजांकित होना चाहिए और फिर बाद में SAMBLASTER का उपयोग कर नीचे करने के लिए आगे बढ़ने से पहले निकाल दिया नमूना । हालांकि कुछ स्तर के दोहराव पीसीआर के दौरान सामान्य है, दोहराव के उच्च स्तर आमतौर पर कम गुणवत्ता चिप-डीएनए, या संभवतः पुस्तकालय तैयारी के साथ एक समस्या का संकेत कर रहे हैं । FastQC, bowtie, और samblaster से outputs (flagstat में संयुक्त) सभी MultiQC जो सभी गुणवत्ता नियंत्रण परिणामों का एक पूर्ण इंटरैक्टिव सारांश प्रदान करता है में पाइप किया जा सकता है । MultiQC fastqc, bowtie, और samblaster के उत्पादन फ़ाइलों से गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक प्रदर्शित करता है बुनियादी आंकड़ों के बारे में जानकारी प्रदान करने, संरेखण प्रतिशत, और पीसीआर दोहराव दर क्रमशः ।

नीचे के बाद सामांय नमूना, अगले और शायद सबसे महत्वपूर्ण कदम, डेटा विज़ुअलाइज़ेशन IGV या UCSC के रूप में एक जीनोम ब्राउज़र का उपयोग कर रहा है । प्रत्येक हिस्टोन संशोधन epigenetic विनियामक परिदृश्य के एक प्रमुख घटक का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें H3K27ac (बढ़ाने वाले), H3K4me1 (सक्रिय और अग्रसर बढ़ाने वाले), H3K4me3 (प्रवर्तक), H3K79me2 (प्रतिलिखित क्षेत्र), H3K27me3 (polycomb दमन), और H3K9me3 (heterochromatic दमन) । इन चिह्नों का उपयोग करके या तो अकेले या संयोजन में, इन histones सक्रिय, शिष्ट या दमित बढ़ाने और प्रवर्तकों की पहचान कर सकते हैं, साथ ही साथ कोडिंग क्षेत्रों की transcriptional स्थिति । यह ChromHMM, जिसमें कार्यात्मक विशिष्ट क्रोमेटिन दोनों दमित और सक्रिय डोमेन का प्रतिनिधित्व राज्यों की पहचान की गई थी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । इन राज्यों को एकवचन चिह्नों द्वारा परिभाषित किया गया था, जैसे polycomb दमन (H3K27me3), hetrochromatic दमन (H3K9me3), और सक्रिय प्रतिलेखन (H3K79me2), साथ ही मिश्रित के निशान, जैसे सक्रिय बढ़ाने वाले (H3K4me1 और H3K27ac) और लिखित बढ़ाने वाले (H3K4me1, H3K27ac और H3K79me2).

प्रस्तुत एकीकृत मंच ऊतकों के नमूनों से histones या प्रतिलेखन कारकों के अधिभोग के निर्धारण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है । हम सफलतापूर्वक बायोप्सी से aforementioned छह मार्क्स आकार मेलेनोमा नमूनों के अधिभोग के निर्धारण के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है । हालांकि, हम अभी भी सफल चिप के लिए आवश्यक ऊतक की सबसे कम राशि निर्धारित नहीं है-Seq अनुप्रयोगों क्योंकि यह ऊतक प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपलब्ध एंटीबॉडी पर depenedent है. इसके अलावा, हालांकि हम नियमित रूप से ताजा, फ्लैश जमे हुए और जमे हुए नमूनों OCT पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग, हम FFPE ऊतकों के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित नहीं किया है । हाल के अध्ययनों से इस तरह के ऊतकों के लिए प्रोटोकॉल की सूचना दी है46,47 और प्रस्तावित परिवर्तन इस मंच के ढांचे में शामिल किया जा सकता है परीक्षण करने के लिए कि प्रस्तुत मंच FFPE ऊतकों से उपयोगी होगा । हमारा मानना है कि यह नैदानिक परीक्षणों के तहत रोगियों से प्राप्त नैदानिक सामग्री से क्रोमेटिन राज्य पैटर्न के निर्धारण में अत्यधिक उपयोगी हो जाएगा । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल मानव ट्यूमर ऊतकों में क्रोमेटिन राज्यों की जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक पूर्ण और व्यापक चिप seq मॉड्यूल का वर्णन, आसान निर्देशों का पालन करने के लिए एक सफल प्रयोग के लिए आवश्यक घटकों के सभी शामिल ।

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Disclosures

लेखक कोई विरोध नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

हम अनुक्रमण समर्थन के लिए MDACC में मार्कस Coyle, कर्टिस Gumbs, SMF कोर धंयवाद । इस लेख में वर्णित कार्य NIH अनुदान (CA016672) से अनुदान द्वारा समर्थित SMF कोर और NCI पुरस्कारों (1K99CA160578 और R00CA160578) के लिए के. आर.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma - Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA - IgG-free Sigma - Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag - 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex

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References

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