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Cancer Research

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Abstract

Modificações do histone constituem um componente importante do Epigenoma e desempenham importantes funções reguladoras na determinação do estatuto transcriptional dos loci associados. Além disso, a presença de alterações específicas tem sido usada para determinar a posição e a identidade não-codificante funcional elementos como potenciadores. Nos últimos anos, a imunoprecipitação da cromatina, seguida de próxima geração sequenciação (ChIP-seq) tornou-se uma poderosa ferramenta para determinar os perfis de todo o genoma de modificações do histone individuais. No entanto, tornou-se cada vez mais claro que os padrões de combinatórios de modificações da cromatina, referidos como Estados de cromatina, determinam a identidade e a natureza do locus genômico associado. Portanto, os fluxos de trabalho consistindo de robustas metodologias de (HT) de alta produtividade para criação de perfil de um número de marcas de modificação de histona, bem como dutos de análises computacionais capazes de lidar com miríades de ChIP-Seq perfis de conjuntos de dados, são necessários para determinação abrangente dos Estados epigenomic em grande número de amostras. O HT-ChIP-Seq de fluxo de trabalho aqui apresentado é composto por dois módulos: 1) um protocolo experimental para o perfilamento várias modificações do histone de pequenas quantidades de amostras de tumor e linhas de células em um formato de 96 poços; e 2) um pipeline de análise de dados computacional que combina as ferramentas existentes para calcular tanto marca individual ocupação e padrões de estado cromatina combinatória. Juntos, esses dois módulos facilitam fácil processamento de centenas de amostras de ChIP-Seq de forma rápida e eficiente. O fluxo de trabalho apresentado aqui é usado para derivar padrões de cromatina estado 6 perfis de marca de histona em tumores de melanoma e linhas celulares. Em geral, apresentamos um fluxo de trabalho de ChIP-seq abrangente que pode ser aplicado a dezenas de amostras de tumor humano e linhas de células de câncer para determinar epigenomic de aberrações em várias malignidades.

Introduction

A maioria dos genomas de mamíferos (98-99%) é composta de sequência não-codificadoras e nestas regiões nocoding contêm elementos reguladores conhecidos para participar no controle da expressão gênica e cromatina organização1,2. Em uma célula normal, o assembly específico do DNA genômico na estrutura da cromatina compactada é fundamental para a organização espacial, a regulação e a cronometragem precisa de vários processos de DNA associada3,4,5. Em uma célula de câncer, no entanto, as modificações de cromatina por aberrantes mecanismos epigenéticos podem levar a organização inadequada da estrutura da cromatina, incluindo o acesso aos elementos reguladores, sistemas loop cromossômicos e de padrões de expressão de gene6, 7,8,9,10.

Apesar dos avanços recentes, nós limitamos a compreensão das alterações epigenéticas que estão associados com a progressão do tumor ou resposta terapêutica. A Epigenoma consiste de uma matriz de modificações, incluindo marcas de histona e metilação de DNA, que coletivamente formam um estado dinâmico (designado Estado de cromatina) que colide com redes de expressão de gene e outros processos críticos para a manutenção identidade celular. Recentemente, alterações em potenciadores foram mostradas em várias neoplasias malignas através do estudo de perfis de H3K27Ac11. Embora tais estudos fornecem insights sobre a correlação de marcas epigenéticas isoladas, mais de 100 modificações epigenéticas têm sido identificadas12,13 , sem uma compreensão clara das suas funções biológicas e interdependência. Além disso, há um número ainda maior de possíveis padrões combinatórios destes histona e modificações de DNA, e é desses padrões combinatórios - modificações não individuais - que ditam Estados epigenéticas14. Portanto, há uma enorme necessidade de identificar alterações nestes Estados de cromatina durante a progressão do câncer ou respostas à terapia. Conhecimento abrangente das alterações Epigenoma em cânceres tem sido atrasadas em parte devido à técnica (por exemplo, a geração de dados em larga escala de pequena quantidade de células de material/única clínicas) e analítico (por exemplo, algoritmos para definir desafios de combinatória Estados). Portanto, há uma necessidade crítica de robustas métodos de alta produtividade para criação de perfil de grande número de marcas de modificação do histone de material clínico e fácil de implementar abordagens computacionais para prever padrões combinatórios que facilitará determinação da epigenéticas Estados associados com diferentes estágios de resistência terapêutica e tumorigênese. Dados complementares, disponíveis a partir do recente Epigenoma de perfil estudos15,16,17,18,19,20,21, 22,23 em linhas de células e tecidos normais podem ser integrados com perfis de cromatina de tumores para mais introspecções Epigenoma contribuição à biologia do tumor.

Criação de perfil de cromatina, tornou-se uma poderosa ferramenta para identificar os padrões de ligação global de cromatina várias modificações15,24. Nos últimos anos, ChIP-seq tornou-se o "padrão ouro" para estudar interações DNA-proteína em uma escala global25,26,27. Para qualquer experiência de ChIP-seq, existem passos críticos necessários para seu sucesso, incluindo processamento de tecido e dissociação, determinar condições optimal sonication, determinar a concentração de anticorpo para a precipitação, preparação de biblioteca, pós-sequenciamento de processamento de dados e análise a jusante. Cada um destes passos contêm pontos de verificação de chave de controle de qualidade e quando tomados em conjunto, são crucial para adequadamente, identificando potenciais alvos para validação funcional. Através da inovação nessas etapas, vários estudos prévios desenvolveram metodologias para executar o ChIP ou ChIP-Seq de pequena quantidade de tecidos28,29,30,31,32 . Além disso, alguns estudos têm sugerido que os protocolos para experimentos de ChIP do elevado-throughput seguidos pelo PCR baseado quantificação33,34. Finalmente, algumas plataformas de análise disponível publicamente para ChIP-Seq dados agora estão disponíveis como Easeq35 e galáxia36. No entanto, uma plataforma integrada para a realização de ChIP-Seq em uma moda de alta produtividade em combinação com um encanamento computacional para executar marca única, bem como análises de estado cromatina tem faltado.

Este protocolo descreve um completo e abrangente ChIP-seq de fluxo de trabalho para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor e linhas de celular, com fácil de seguir diretrizes englobando todas as etapas necessárias para uma experiência bem sucedida. Através da adopção de um método de alta produtividade anteriormente descrito por Blecher-Gonen et al 37, este protocolo pode ser executado em dezenas de amostras em paralelo e tem sido aplicado com sucesso em linhas de células de câncer e tumores humanos como melanoma, cólon, próstata e glioblastoma multiforme. Vamos demonstrar a metodologia para seis modificações do histone de núcleo que representam os principais componentes da paisagem epigenética regulamentar em linhas de células de melanoma humano e amostras de tumor. Essas modificações incluem H3K27ac (intensificadores), H3K4me1 (potenciadores de ativos e equilibrados), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiões), H3K27me3 (polycomb de repressão) e H3K9me3 (heterocromático repressão). Estas marcas podem ser usadas sozinho ou em combinação para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintos que representam domínios repressivos e ativos.

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Protocol

Todas as amostras clínicas foram obtidas seguindo as orientações do Conselho de revisão institucional.

1. preparação buffer

  1. Fazer 200 mL de tampão TE (Tris-HCl, pH de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 10mm 8.0 de 10 mM).
  2. Fazer 200 mL de tampão STE (10 mM Tris-HCl, pH de EDTA 10 mM 8.0, 140 mM de NaCl).
  3. Fazer 200 mL de glicina 2,0 M (37,52 g de glicina em 200 mL de água) e aquecê-lo a 65 ° C.
  4. Fazer 200 mL de solução a 5% de sódio deoxycholate (DOC) (10 g de DOC em 200 mL de água).
  5. Fazer 500 mL de tampão de colheita de ChIP (12 mM Tris-Cl, 0,1 x solução salina tampão fosfato (PBS), EDTA, 0,5% sulfato dodecyl de sódio (SDS) de 6 mM).
  6. Fazer 500 mL de tampão de diluição de ChIP (10 mM Tris-Cl, 140 mM de NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Fazer 500 mL de tampão de lavagem RIPA (STE, 1% Triton x-100, 0,1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Fazer 500 mL de tampão de lavagem RIPA/500 (amortecedor de RIPA + 360 mM NaCl).
  9. Fazer 500 mL de tampão de lavagem LiCL (TE, LiCl, 0,5% de 250 mM NP-40, 0,5% DOC).
  10. Fazer 500 mL de tampão de eluição direto: pH 10 mM Tris-Cl 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM de NaCl, SDS 0,5%.
  11. Fazer 50 mL de tampão de ligação/bloqueio de anticorpo (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0,2% IgG-livre BSA).

2. tecido/célula linha de processamento e cross-linking

  1. Se o tecido for flash congelado, dethaw-lo no gelo antes da dissociação.
  2. Desassocie a 50 mg de tecido (~ 8 mg por anticorpo de modificação de histona) manualmente em 2 mL de Hanks equilibrado sal solução (HBSS) usando uma lâmina de barbear estéril. Picar o tecido em pedaços de 3 a 4 mm para cerca de 5 min em um prato de cultura de tecido estéril.
  3. Transferir a solução HBSS e tecido em um tubo de dissociador e adicionar outro 8 mL de HBSS. Mais desassocie o tecido usando um dissociador até homogeneizado.
  4. Para tumores de melanoma, coloque os tubos em um dissociador e executar os seguintes ciclos cada um uma vez nesta ordem: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 e m_heart_02.01.
  5. Arranhão 21 × 106 células em 10 mL de meio (~ 3 × 106 por modificação de histona e entrada; isso pode ser reduzido para 100.000 células por marca para populações raras) cultivado em cultura de tecido padrão prato e cobrá-los em um tubo cônico de 15 mL.
    Nota: Os suportes utilizados para a linhagem de células de melanoma representante WM115 são DMEM suplementado com 10% de soro Fetal bovino e 5% penicilina/estreptomicina.
  6. Crosslink os tecidos/células usando uma concentração de 1% de formaldeído final adicionando-se 200 µ l de 16% de formaldeído por 3 mL HBBS para tecido (ou 3 mL de meio para as células). Agitar a mistura em 10 rpm usando um mixer para exatamente 10 min a 37 ° C.
    Cuidado: Formol é tóxico e deve ser tratada em uma coifa adequado.
  7. Adicionar 200 µ l de glicina 2,0 M por 3 mL da amostra e continuar apertando a 10 rpm por mais 5 min a 37 ° C.
    Nota: Glicina atua como um quencher. Fazer a solução de glicina fresco cada mês como o pH pf que a solução tende ao longo do tempo.
  8. Gire as amostras a 934 x g por 5 min a 4 ° C, utilizando uma centrífuga de bancada. Remover o sobrenadante, adicionar 5 mL de PBS frio gelo, Centrifugar as amostras novamente a 934 x g e remover o sobrenadante.
  9. Flash congelar a pelota e armazená-lo a-80 ° C para posterior processamento.

3. tecido Lysis, Sonication e preparação de anticorpos

  1. Dissolva 1 comprimido de inibidor de protease por 10 mL de tampão de colheita do ChIP.
  2. Adicionar 300 µ l de tampão de colheita ChIP com inibidores de protease por 50 mg de tecido e deixar 30 min de Lise no gelo.
    Nota: Adicione 300 µ l de tampão de colheita ChIP com inibidores de protease por 10 X 17 de WM115 linhas de células de melanoma.
  3. Enquanto as células são Lise, ligar o o disruptor do banho-maria e o sistema de resfriamento associado e permitir que a temperatura chegar a 4 ° C. Coloque os tubos do sonicador no disruptor em tanque de imersão e proceda à sonicação os tecidos de melanoma em 60 ciclos com 30 s no e 30 s para obter fragmentos de cromatina de ~ 200-600 pares de bases (bp).
    Nota: Tempo Sonication pode diferir entre o tipo de tecido e deve ser ajustado em conformidade. Esta é uma etapa crítica e deve ser otimizada no experimento piloto antes de prosseguir para a imunoprecipitação.
  4. Durante sonication, lave 20 µ l de grânulos magnético de proteína G por anticorpo por amostra três vezes usando 1000 µ l de tampão de ligação/bloqueio (PBS 0,1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. Para ~ 8 mg de tecido de melanoma, incube 3 µ g de cada anticorpo de histona em 100 µ l de ligação / bloqueio de buffer para 2 h a 4 ° C com rotação usando um revólver de tubo. 12 amostras para um anticorpo singular contêm 240 µ l de grânulos, 36 µ g de anticorpo e 1200 µ l de tampão de ligação/bloqueio.
    Nota: Para 3 × 106 células, use 5 µ g de cada anticorpo e 30 µ l de grânulos magnéticos de proteína G por anticorpos. Anticorpo e grânulos de proteína-G devem ser titulados se diferentes quantidade de tecido está sendo usada. Este protocolo ilustra imunoprecipitação condições para as modificações de histona seis descritos (Tabela de materiais), no entanto, as concentrações de anticorpos devem ser otimizadas para outras modificações e fatores de transcrição.
  6. Para determinar o tamanho do fragmento, remover 20 µ l de solução de cromatina sonciated e adicionar um tampão de eluição mestre mistura (temperatura ambiente) contendo 44 µ l de eluição direta buffer, 1 µ l de RNase (20mg/mL) e 5 µ l Proteinase K (20mg/mL) por amostra. Incubar as amostras em um termociclador PCR pelo menos 2 h a 50 ° C. Purifica a amostra usando um kit de purificação de PCR, seguindo as instruções dos fabricantes.
  7. Certifique-se de cromatina é suficientemente cortada, determinando o tamanho do fragmento usando um instrumento de electroferograma de DNA de alta sensibilidade antes de prosseguir para a etapa 3.6. Ligue o instrumento de electroferograma.
  8. Carrega 2 µ l de reagente de buffer de alta sensibilidade em cada poço de uma tira de tubo óptico 8 poços. Carrega 2 µ l de escada alta sensibilidade para o primeiro bem e 2 µ l das amostras purificadas em poços restantes.
  9. Colocar tampões tubo óptico no tubo stips e vórtice as amostras a 2000 rpm por 1 min. abrir a tampa e uma nova fita de tela de alta sensibilidade e caixa de pontas de carregamento. Remova as tampas de strip-tease e carregar as amostras no instrumento electroferograma.
  10. Abra o software de análise, destacar os primeiro treze espaços na fita tela e pressione o guia início, no canto inferior direito. Fragmentos de cromatina, variando entre ~ 200-1000 bp são adequados para o ChIP.
  11. Transferir a solução lisada para tubos estéreis e girar os tubos no 21.130 x g, utilizando uma centrífuga de mesa para 15 min a 4 ° C. Transferi o sobrenadante para tubos novos.
  12. Determinar o volume total do líquido sobrenadante e remover 10% da solução total para o controle de entrada e armazená-lo em 4 ° C.

4. imunoprecipitação da cromatina

  1. Dissolva 2 tabletes de inibidor de protease por 20 mL de tampão de diluição do ChIP.
  2. Depois sonication diluir a amostra restante 5 vezes usando tampão de diluição de ChIP para trazer os níveis de SDS até 0,1%. Dilua a 270 µ l do sobrenadante restante com 1080 µ l de tampão de diluição do ChIP para obter um volume total final de 1350 µ l.
  3. Quando termina a incubação do anticorpo e proteína grânulos magnéticos de G, colocar o tubo em um ímã e remover o sobrenadante.
  4. Com o tubo ainda sentado sobre o ímã, lave os grânulos uma vez adicionando 750 µ l de tampão de diluição de ChIP com inibidores de protease.
    Nota: É importante para não perturbar os grânulos ou girar os tubos durante esta etapa.
  5. Retire o ChIP de tampão de diluição lavar e Resuspenda os grânulos em 240 µ l do tampão de diluição de ChIP mesmo. Alíquota 20 µ l de grânulos para 12 tubos separados, cada um dos quais é usado para uma amostra de tecido separado.
  6. Alíquota lisado material uniformemente a grânulos de proteína G com anticorpo específico e tombo usando um revólver do tubo durante a noite a 4 ° C.

5. lavagem e reversa reticulação de complexos de Immunoprecipitated DNA-proteína

  1. Na manhã seguinte após a reticulação reversa, transferir a solução de anticorpo-proteína para uma placa de 96 poços e coloque-o sobre o suporte magnético. Permitir que os grânulos de aderir para pelo menos 30 s e remover o sobrenadante.
  2. Lave os grânulos 5 vezes com 150 µ l de tampão de lavagem gelado RIPA usando uma pipeta multicanal. Durante as etapas de lavagem, fazer não Pipetar os grânulos, mas mover o ímã continuamente da direita para a esquerda para 30 s por lavagem.
  3. Lave as amostras duas vezes com 150 µ l de tampão de lavagem gelado RIPA-500.
  4. Lave as amostras duas vezes com 150 µ l de tampão de lavagem LiCl gelado.
  5. Lavar as amostras com 150 µ l de tampão de lavagem TE gelado e remover o tampão TE imediatamente. Esta etapa pode ser omitida para aplicações de entrada baixas.
  6. Adicione o controle de entrada da etapa 3.7 em frescos poços da placa de 96 poços, contendo as amostras de DNA de ChIP.
  7. Após as etapas de lavagem, adicione uma eluição reserva mestre mistura (temperatura ambiente) contendo 44 µ l de tampão de eluição direto, 1 µ l de RNase (20mg/mL) e 5 µ l Proteinase K (20mg/mL) por amostra ChIP e entrada para reticulação reversa.
  8. Incubar as amostras usando um termociclador PCR por 4 h a 37 ° C, 4 h a 50 ° C e 8-16 h a 65 ° C.

6. purificação e quantificação de DNA precipitado

  1. A manhã seguinte, o lugar as amostras de volta sobre o ímã e a transferência de sobrenadante para uma nova placa PCR de 96 poços que contém o DNA de immunoprecipitated.
  2. Adicione 2.3 x grânulos paramagnéticos a solução (115 µ l para 50 µ l de solução) e, cuidadosamente, pipeta e descer 25 vezes usando uma pipeta multicanal. A solução se tornará homogênea se corretamente misturado.
  3. Incube a solução à temperatura ambiente fora do ímã de 4 min. lugar as amostras de volta sobre o ímã e incubam a temperatura ambiente por mais 4 min. descartar o sobrenadante.
  4. Deixando as amostras sobre o ímã, adicione 150 µ l de etanol 70% (vol/vol) e incubar a temperatura ambiente por 30 s sem perturbar os grânulos.
  5. Remova o etanol e repita a lavagem. Permitir que os grânulos paramagnéticos de ar seco sobre o ímã por 5 min.
    Nota: Remova todos o etanol após a segunda lavagem como etanol restante irá interferir com a purificação.
  6. Remover as amostras do ímã e adicione 30 µ l de pH de 10 mM Tris-Cl 8.0. Misture pipetando 25 vezes e incubar as amostras à temperatura ambiente fora do ímã para 4 min.
  7. Coloque o ímã as amostras e incubar a temperatura ambiente por outro µ l de 4 min. 20 transferência de cada amostra para uma nova placa de 96 poços para preparação de biblioteca. Armazene os restantes 10 µ l de DNA de ChIP em caso de quaisquer problemas potenciais com geração de bibliotecas.
  8. Nesta fase, quantificar o DNA de ChIP antes da preparação da biblioteca. A concentração de DNA é medida com reagentes de DNA de alta sensibilidade. Determine a distribuição de tamanho de DNA precipitado, usando um processo de instrumento de electroferograma de DNA alta sensibilidade ao passo 7.1.

7. Biblioteca geração usando o NEBNext Ultra II DNA Kit biblioteca preparação

  1. Gere bibliotecas para sequenciamento NGS usando DNA Biblioteca preparação seguindo o protocolo recomendado do fabricante. Todas as reações são executadas em placas de 96 poços e incubação do é executadas em um termociclador PCR com o conjunto de temperatura tampa > 100 ° C e o volume de 50 µ l.
  2. Para índices, são utilizados os Oligos Multiplex para plataforma NGS. Realizar um total de 10 ciclos de x para amplificação por PCR usando as seguintes configurações: desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s, desnaturação a 98 ° C, durante 10 s, recozendo/extensão a 65 ° C por 30 s (10 x ciclos), extensão final 65 ° C por 5 min e espera a 4° C.
    Nota: A tabela 1 contém os primers utilizados para amplificação por PCR.
  3. Após a amplificação por PCR, remover as amostras e trazer o volume total de 100 µ l utilizando água livre de nuclease. Realizar seleção de dupla face tamanho paramagnético (0.55x/0.8x) por µ l 55 adicionando primeiro dos grânulos e misture pipetando 25 vezes. Incube as amostras à temperatura ambiente fora do ímã para 4 min.
  4. Coloque um ímã as amostras e incubar a temperatura ambiente por mais 4 minutos. Esta etapa é usada para reter fragmentos grandes sobre as contas que são impróprios para sequenciamento.
  5. Transferi o sobrenadante para uma nova placa PCR de 96 poços. Não desprezar o sobrenadante como contém DNA parcialmente purificado.
  6. Adicione outro 25 µ l de grânulos paramagnéticos e misturar pipetando 25 vezes e incubar a temperatura fora do ímã para 4 min.
  7. Colocar as amostras de volta sobre o ímã e incubar a temperatura ambiente por mais 4 minutos e descartar o sobrenadante. Esta etapa é usada para reter fragmentos de ~ 200 a 600 bp que será usado para finalizado bibliotecas.
  8. Deixando as amostras sobre o ímã, adicione 150 µ l de etanol 70% (v/v) e permitir a incubação por 30 s sem perturbar os grânulos (não passe enquanto o ímã). Remova o etanol e repita a lavagem uma segunda vez.
  9. Permitir que os grânulos paramagnéticos de ar seco sobre o ímã de 5 min. remover todo etanol após a segunda lavagem como etanol restante irá interferir com a purificação.
  10. Remover as amostras do ímã e adicione 25 µ l de pH de 10 mM Tris-Cl 8.0. Misture pipetando 25 vezes e incubar a temperatura fora do ímã de 4 min. lugar as amostras de volta sobre o ímã e incubam a temperatura ambiente por mais 4 minutos.
  11. Quantificar as bibliotecas usando um instrumento de electroferograma de DNA de alta sensibilidade antes de multiplexação para garantir tamanhos são apropriados para o sequenciamento. Concluídas as bibliotecas variam entre 200-600 bp e são desprovidas de todos os dímeros da primeira demão.
    Nota: Se necessário, outro 0.7 x purificação paramagnética do grânulo é realizada para remover dímeros cartilha indesejáveis que estão presentes em ~ 130 bp.
  12. O DNA quantificado com base em cartilhas de índice exclusivo de acordo com a concentração de piscina. Para uma piscina que contém seis amostras com concentrações de 1 ng / µ l e 6ng / µ l, a distribuição é 15 µ l da amostra mais baixa e 2,5 µ l da amostra maior. Isto é feito para garantir a leitura contagens serão distribuídas uniformemente em cada lane da célula de fluxo.

8. pós-processamento de dados do ChIP-seq

  1. Um pipeline com base no snakemake38,39 é usado para processo de todas as seguintes etapas em um único comando. Importante, cada um destes passos são discutidos individualmente com os respectivos comandos.
  2. Determinar a qualidade das leituras de sequenciamento bruto fastq usando FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): Abra o terminal unix e altere o diretório (cd) para a pasta que contém os arquivos de fastq cru para cada uma das seis modificações do histone. No tipo de terminal unix, fastqc *fastq.gz e pressione [retorno]. Isso executará métricas de controle de qualidade em todos os arquivos fastq na pasta.
  3. Alinhe a leituras de qualidade para o genoma de referência e remover duplicatas antes da compactação de arquivos de bam. Isto é realizado usando bowtie versão 1.1.239, SAMBLASTER versão 0.1.2140e SAMTOOLS versão 1.3.141: no unix terminal tipo, bowtie -m 1 - n 1..--melhor..--estratos -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools Ver os -Sb - > histone1.bam e imprensa [retorno].
    Nota: path_to indica a pasta que contém o assembly de genoma humano hg19. Isto mudará dependendo do organismo de interesse.
  4. Classificar arquivos de bam usando SAMTOOLS com o seguinte comando: o tipo de terminal unix, samtools tipo histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted e imprensa [retorno].
  5. Indexar arquivos bam usando SAMTOOLS com o seguinte comando: no tipo de terminal unix, samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai de índice e pressione [retorno].
  6. Determinar excepcionalmente mapeadas e desalinhadas leituras usando SAMTOOLS flagstat com o seguinte comando: no tipo de terminal unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam e pressione [retorno].
  7. Normalizar arquivos de bam por contagens de leitura por meio de amostragem aleatória, com o seguinte comando: o tipo de terminal unix, sambamba exibir bam -f-subamostragem-semente = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools classificar -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam e imprensa [retorno].
  8. Indexar os arquivos bam novamente usando o SAMTOOLS com o seguinte comando: no tipo de terminal unix, samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai de índice e pressione [retorno].
  9. Para visualizar o ChIP-seq bibliotecas em um navegador do genoma (i. e. UCSC ou IGV), gerar arquivos de figurão usando deepTools versão 2.4.040 dimensionando os arquivos bam de leituras por mil por milhão (RPKM). Isso pode ser realizada usando os seguintes comandos:
    1. Para arquivos padrão manda-chuva: o tipo de terminal unix, bamCoverage -b histone1. downsample.Sorted.bam - normalizeUsingRPKM - binSize 30 - smoothLength 300..--extendReads 200 -o histone1.bw e imprensa {RETURN].
    2. Para entrada subtraído arquivos figurão: no tipo de terminal unix, bamCompare..--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam..--bamfile2. input1.downsample.sorted.bam..--normalizeUsingRPKM..--relação de subtrair..--binSize 30..--smoothLength 300..--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW e imprensa [retorno].
  10. Identifique o enriquecimento de sinal do ChIP-seq sobre fundo de "Entrada" usando a análise do modelo com base de ChIP-seq (MACS) versão 1.4.225,26 e versão 2.1.0. Use macs1 para "ponto de origem" fatores H3K4me3, H3K4me1 e H3K27ac e macs2 por fatores "fonte ampla" H3K79me2, H3K27me3 e H3K9me3. Isto é realizado usando os seguintes comandos:
    1. Para o ponto de origem: Do tipo terminal unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5..--nomodel..--Mantenha-dup todas histone1.file - n e pressione [retorno].
    2. Para ampla fonte: No tipo de terminal unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6..--ampla..--larga-corte 1e-6..--Mantenha-dup todos..--nomodel histone1.file - n e pressione [retorno].
  11. Uso ChromHMM24 para identificar padrões de cromatina combinatória estado baseia-se a modificações do histone estudadas usando os seguintes comandos:
    1. No terminal unix digite cd/path_to/ChromHMM_folder e [retorno].
    2. Uma vez no ChromHMM tipo diretório, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output e pressione [retorno].
    3. Tipo, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/hg19 output_directory 15 e pressione [retorno].

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Representative Results

Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos de tumor congelado e linhas celulares que podem ser executadas em dezenas de amostras em paralelo usando um método de alta produtividade (figura 1A). Fragmentos de cromatina devem variar entre ~ 200-1000 bps para a imunoprecipitação ideal. Temos observado que o tempo necessário para atingir o mesmo comprimento de corte é diferente para diferentes tecidos e tipos de células. O sucesso do ChIP de pequenas quantidades de tecido depende de manter o lisado frio em todos os momentos, especialmente durante sonication. Purificada ChIP-DN Ashould ser quantificados antes de prosseguir para a preparação de biblioteca (Figura 2A). Concluído bibliotecas apropriadas para multiplexação e NGS devem variar entre bp ~ 200-600 e desprovida de qualquer dímeros de cartilha (Figura 2B). Após pós-sequenciamento, existem muitas métricas de controle de qualidade que devem ser cumpridas antes de proceder a novas medidas do gasoduto, tal como Mac pico-chamando ou ChromHMM análise (Figura 3). Muitos destes métricas podem ser determinados usando programas como o FastQC e MultiQC. Leituras de fastq de qualidade são alinhadas com o genoma humano a uma taxa de ~ 50-80% com um máximo de uma incompatibilidade. Uma profundidade de sequenciamento recomendada é 10 milhões exclusivamente mapeado leituras para o "ponto de origem" fatores e 20 milhões exclusivamente mapeado leituras para "fonte ampla" fatores27,41,42,43. Arquivos BAM classificados e indexados são usados para gerar arquivos de manda-chuva que podem ser visualizados utilizando um navegador de genoma como IGV ou UCSC. ChIP de amostras devem ser enriquecidas sobre DNA entrada e cada modificação do histone deve exibir um perfil distinto, que representa um componente específico da paisagem epigenética (Figura 4A). É possível que, em alguns tecidos, haverá mais elevados níveis de ruído de fundo que pode obscurecer o sinal do ChIP-seq. Se isso ocorrer, é recomendável para gerar arquivos de entrada figurão subtraídos e re-Visualizar no browser genoma. Para determinar perfis de estado de cromatina, nós utilizamos o algoritmo de ChromHMM24. ChromHMM usa um modelo de Markov escondidos multivariada para identificar os mais proeminentes re-ocorrendo combinatória e padrões espaciais de cromatina baseados as modificações do histone estudaram (Figura 5). Usando estes seis modificações ChromHMM identifica a cromatina funcionalmente distintos Estados que representam domínios repressivos e ativos, como polycomb repressão (estado 1), da repressão (5 do estado), transcrição ativa (estado, 8 e 9) e potenciadores de ativos (estado 13 e 14). A saída do ChromHMM inclui arquivos de cama segmentada para cada Estado que mais pode ser usado para análise a jusante.

Figure 1
Figura 1: fluxo de trabalho para o módulo de ChIP. Tecido de biópsia do tumor é primeiro desassociado e reticulado para capturar as interações proteína-ADN. Tecido é então lisado para obter fragmentos de cromatina apropriados para a imunoprecipitação e complexos histona-DNA são precipitados usando os seis anticorpos indicados. As amostras são lavadas, ligações cruzadas são invertidas e ChIP-DNA é purificado e quantificado. Bibliotecas são geradas a partir de DNA purificado e multiplexadas de acordo com índices exclusivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análise de electroferograma de ChIP-DNA purificado e preparação completa biblioteca. (A) electroferograma representante de purificado da cromatina contendo ChIP-DNA fragmentos bp ~ 200-600 que é adequado para a preparação de biblioteca. (B) electroferograma o representante de uma biblioteca concluída após amplificação e seleção de dupla face tamanho paramagnético que é apropriada para multiplexação e NGS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Fluxo de trabalho para o módulo de processamento de dados do ChIP-seq. Fluxo de trabalho exibindo passos críticos para processamento de dados do ChIP-seq e preparação para análise a jusante. O encanamento usado neste protocolo foi gerado usando o snakemake, no entanto, cada um destes passos também pode ser realizado individualmente, conforme descrito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Exibição de navegador do genoma da modificação do histone ChIP-seq faixas. A) ChIP-seq faixas geradas pelo deeptools exibindo ativas e reprimidas regiões circundantes o locus de ARN numa amostra representativa de melanoma tumor. Genes como ARN, CSDE1 são SIKE1 estão associados com todas as modificações do histone ativo (H3K27ac, H3K4me3 e H3K4me1) e transcrição ativa (H3K79me2), Considerando que os genes AMPD1, DENND2C e SYCP1 contêm polycomb repressivo marca H3K27me3 e não de acompanhamento contêm a transcrição ativa. B) chIP-seq faixas geradas pelo deeptools exibindo heterocromatina preparada através de genes ZNF na amostra de tumor representativa de melanoma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : ChromHMM modelo baseado em amostras de tumor melanoma. Perfil de emissão de um LearnModel de 15-estado baseada as seis modificações do histone estudou. ChromHMM identifica a cromatina funcionalmente distintos Estados que representam domínios repressivos e ativos, como repressão polycomb (estado 1), da repressão (estado 5), transcrição ativa (estado, 8 e 9) e potenciadores de ativos (State13 e 14 ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um módulo de ChIP-seq da elevado-produção completo e abrangente para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor humano e linhas celulares. Em qualquer protocolo de ChIP-seq, um dos passos mais importantes é a especificidade do anticorpo. Aqui, esse método ilustra imunoprecipitação condições para as modificações do histone seis descritos, os quais são ChIP-grau e validados anteriormente em nosso e outros laboratórios42,44,45 . Enquanto as mesmas concentrações de anticorpos foram aplicadas com sucesso em vários outros tipos de tumor, é fundamental para determinar a especificidade do anticorpo se estudar diversos fatores de interesse27.

Outro aspecto fundamental para uma experiência bem sucedida inclui a otimização das condições sonication. Tempo de sonication pode variar tanto entre amostra e tecido tipo e deve ser ajustado em conformidade. Para a otimização adequada, fazer um teste é executado para cada amostra incrementalmente, aumentando o tempo de sonication e continuamente verificando o tamanho do fragmento. Para a ChIP-experiência inicial fragmentos de cromatina devem variar entre ~ 200-1000 bp para a imunoprecipitação optimal, e ChIP-DNA purificado deve ser quantificada antes de prosseguir para a preparação de biblioteca. Este tamanho de fragmento garante ótima geração e retenção de DNA amplificado (~ 200 a 600 bp) que será usado para multiplexação e NGS. Se realizar estas experiências em forma de alta produtividade, um bom ponto de partida para multiplexação é ~ 8 amostras por raia para sequenciamento do pool. Embora essa quantidade de amostras pode produzir uma profundidade rasa sequenciamento, é útil para testar a qualidade do anticorpo antes de prosseguir. Um dos gargalos do pool de amostras múltiplas é desigual cobertura post sequenciamento. Um método de fluoremetric com base de quantificação é usada, no entanto, muitos-vezes costuma ser não equivalente a pronto para sequenciamento de moléculas em cada biblioteca. O melhor método para a quantificação de DNA de biblioteca é utilizar qPCR usando padrões feitos de pré-determinado pronto para sequenciamento moléculas de DNA.

Outro passo crítico na análise de conjunto de dados do ChIP-Seq é de pós-sequenciamento processamento de dados. Importante, antes de prosseguir com qualquer aspecto da análise a jusante, existem várias métricas de controle de qualidade que devem ser atendidas primeiro. Programas como o FastQC irão fornecer informações a respeito da qualidade das leituras de sequenciamento bruto fastq sob a forma de passar ou falhar o teste. Enquanto o lê fastq deve passar a maioria das métricas, alguns dos testes mais importantes incluem estatísticas básicas, por sequência base qualidade, escores de qualidade de sequência e adaptador de contaminação. FastQC-processado leituras estão alinhadas com o genoma humano e devem mapear a uma taxa de ~ 50-80% com um máximo de uma incompatibilidade. Preços mais baixos do que 50% podem indicar problemas no ChIP, preparação de biblioteca ou sequenciamento e pode incluir a contaminação, baixa qualidade de DNA-ChIP ou amplificação excessiva durante a PCR. Durante a conversão de SAM para arquivos BAM, leituras duplicadas primeiro devem ser sinalizadas e então subsequentemente removido usando o SAMBLASTER antes de prosseguir para amostragem em baixo. Enquanto algum nível de duplicação é normal durante a PCR, níveis elevados de duplicação são geralmente indicativos de baixa qualidade DNA-ChIP, ou possivelmente um problema com a preparação de biblioteca. As saídas de FastQC, bowtie e samblaster (combinado em flagstat) podem ser canalizadas em MultiQC que fornece um resumo completo e interativo de todos os resultados de controle de qualidade. MultiQC exibe métricas de controle de qualidade de arquivos de saída de fastqc, bowtie e samblaster, fornecendo informações sobre estatísticas básicas, porcentagens de alinhamento e taxas de duplicação de PCR, respectivamente.

Após a normalização para baixo-amostragem, o passo seguinte e provavelmente o mais importante, é visualização de dados usando um navegador de genoma como IGV ou UCSC. Cada modificação do histone representa um componente-chave da paisagem epigenética reguladora, incluindo H3K27ac (intensificadores), H3K4me1 (potenciadores de ativos e equilibrados), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiões), H3K27me3 (polycomb de repressão), e H3K9me3 (heterocromático repressão). Usando estas marcas sozinho ou em combinação, estes histones podem identificar potenciadores de ativos, preparadas ou reprimidas e promotores, bem como o status transcriptional de regiões codificantes. Isto foi demonstrado usando ChromHMM, no qual foram identificados cromatina funcionalmente distintos Estados que representam domínios repressivos e ativos. Esses Estados foram definidos pelas marcas singular, como repressão polycomb (H3K27me3), repressão de hetrochromatic (H3K9me3) e transcrição ativa (H3K79me2), bem como marcas de combinatórias, como potenciadores de ativos (H3K4me1 e H3K27ac) e transcrito realçadores (H3K4me1, H3K27ac e H3K79me2).

A plataforma integrada apresentada é well-suited para determinação da ocupação de histonas ou fatores de transcrição de amostras de tecidos. Nós utilizaram com sucesso este protocolo para determinação da ocupação das marcas acima mencionadas seis amostras de biópsia-tamanho melanoma. No entanto, nós ainda não determinamos a menor quantidade de tecido necessária para aplicações bem sucedidas de ChIP-Seq porque é depenedent sobre o tipo de tecido, bem como anticorpo disponível. Além disso, embora nós rotineiramente utilizamos este protocolo em fresco, flash congelado e OCT congelada amostras, não otimizamos este protocolo para tecidos FFPE. Alguns estudos recentes têm relatado protocolos para tais tecidos46,47 , e as alterações propostas lá podem ser integradas no quadro desta plataforma para testar se a plataforma apresentada será útil de tecidos FFPE. Acreditamos que isso será muito útil na determinação de padrões de estado cromatina de material clínico, obtidos de pacientes em estudos clínicos. Em geral, este protocolo descreve um módulo de ChIP-seq completo e abrangente para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina em tecidos de tumor humano, com fácil de seguir instruções, englobando todos os componentes necessários para uma experiência bem sucedida.

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Disclosures

Autores declaram sem conflitos.

Acknowledgments

Agradecemos a Marcus Coyle, Curtis Gumbs, núcleo do SMF no MDACC para suporte de sequenciamento. O trabalho descrito neste artigo foi apoiado por subsídios do grant NIH (CA016672) ao núcleo do SMF e ICN awards (1K99CA160578 e R00CA160578) para K. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma - Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA - IgG-free Sigma - Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag - 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex

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References

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