Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En integrerad plattform för Genome-wide mappning av kromatin stater med hög genomströmning ChIP-sekvensering i tumörvävnad

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/56972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

Här beskriver vi en optimerad hög genomströmning ChIP-sekvensering protokoll och computational analyser pipeline för bestämning av genome-wide kromatin staten mönster från fryst tumörvävnad och cellinjer.

Abstract

Histon ändringar utgör en viktig del av epigenomet och spelar en viktig reglerande roll i fastställande av transkriptionell status för associerade loci. Dessutom har förekomsten av särskilda modifikationer använts för att bestämma position och identitet icke-kodande funktionselement som smakförstärkare. Under de senaste åren har kromatin immunoprecipitation följt av nästa generations sekvensering (ChIP-seq) blivit ett kraftfullt verktyg vid fastställandet av genome-wide profiler för enskilda Histon ändringar. Det har dock blivit allt tydligare att den kombinatoriska mönstren av kromatin modifieringar, kromatin stater, fastställa identitet och karaktär det associera genomisk locus. Därför arbetsflöden som består av stabila hög genomströmning (HT) metoder för profilering ett antal Histon modifiering märken, liksom computational analyser rörledningar kan hantera myriader av ChIP-Seq profilering datamängder, behövs för omfattande bestämning av epigenetisk staterna i stort antal prover. Den HT-ChIP-Seq arbetsflöde presenteras här består av två moduler: 1) ett experimentellt protokoll för profilering flera Histon ändringar från små mängder tumörprover och cellinjer i en 96-väl format; och 2) en computational data analys pipeline som kombinerar befintliga verktyg för att beräkna både enskilt varumärke beläggning och kombinatoriska kromatin staten mönster. Tillsammans underlättar dessa två moduler lätt bearbetning av hundratals ChIP-Seq prover på ett snabbt och effektivt sätt. Arbetsflödet presenteras här används för att härleda kromatin staten mönster från 6 Histon mark profiler i melanom tumörer och cellinjer. Sammantaget presenterar vi ett omfattande ChIP-seq-arbetsflöde som kan tillämpas på dussintals människors tumörprover och cancer cellinjer att bestämma epigenetisk avvikelser i olika maligniteter.

Introduction

Flesta däggdjur genomen (98-99%) består av icke-kodande sekvens, och dessa nocoding regioner innehåller reglerande element känt att delta i kontrollen av genuttryck och kromatin organisation1,2. I en normal cell är specifika montering av genomisk DNA i komprimerade kromatinstruktur avgörande för rumslig organisation, reglering och exakt timing av olika DNA-associerade processer3,4,5. I en cancercell dock kan kromatin modifieringar av avvikande epigenetiska mekanismer leda till felaktig organisation av kromatinstruktur, inklusive tillgång till föreskrivande element, kromosomala looping system och gen uttryck mönster6, 7,8,9,10.

Trots senaste framsteg, har vi begränsad förståelse av epigenetiska förändringar som är associerade med tumör progression eller terapeutiskt svar. Epigenomet består av en rad ändringar, inklusive Histon märken och DNA-metylering, som tillsammans bildar ett dynamiskt tillstånd (kallad kromatin staten) som inkräktar på gen uttryck nätverk och andra processer som är kritiska för att upprätthålla cellulära identitet. Förändringar i förstärkare har nyligen visats i flera maligniteter genom att studera H3K27Ac profiler11. Även om sådana studier ger insikt om sambandet mellan isolerade epigenetiska varumärken, mer än 100 epigenetiska förändringar har varit identifierade12,13 utan tydlig förståelse av deras biologiska roller och ömsesidigt beroende. Dessutom finns ett ännu större antal möjliga kombinatoriska mönster av dessa Histon och DNA ändringar, och det är dessa kombinatoriska mönster - inte enskilda ändringar - som dikterar epigenetiska staterna14. Därför finns det enorma behovet av att identifiera förändringar i dessa kromatin stater under cancer progression eller Svaren till terapi. Omfattande kunskap av epigenomet förändringar i cancer har halkat delvis på grund av tekniska (t.ex. generationen av storskaliga data från liten mängd kliniska material/enstaka celler) och analytisk (e.g. algoritmer att definiera kombinatoriska staterna) utmaningar. Därför finns det kritiska behov av robusta hög genomströmning metoder för profilering stort antal Histon modifiering märken från kliniska material och lätt att implementera beräkningsvetenskapliga metoder att förutsäga kombinatoriska mönster som kommer att underlätta bestämning av epigenetiska stater associerade med olika stadier av uppkomst och terapeutiska motstånd. Ytterligare, data finns från senaste epigenomet profilering studier15,16,17,18,19,20,21, 22,23 i normal vävnad och cellinjer kan integreras med kromatin profiler av tumörer för ytterligare insikter epigenomet bidrag till tumörbiologi.

Kromatin profilering har blivit ett kraftfullt verktyg för att identifiera de globala bindande mönster av olika kromatin ändringar15,24. Under de senaste åren har ChIP-seq blivit den ”gyllene standarden” för att studera DNA-protein interaktioner på en global skala25,26,27. För någon ChIP-seq experiment finns det kritiska steg krävs för dess framgång, inklusive vävnad behandling och avståndstagande, fastställelser optimal ultraljudsbehandling villkor, fastställelser optimal antikroppskoncentration för nederbörd, bibliotek förberedelse, efter sekvensering databehandling och efterföljande analys. Dessa steg innehåller viktiga kvalitetskontroll kontrollpunkter, och tillsammans, är avgörande för att korrekt identifiera potentiella mål för funktionella validering. Genom innovation i stegen, har flera tidigare studier utvecklat metoder för att utföra ChIP eller ChIP-Seq från liten mängd vävnader28,29,30,31,32 . Vidare tyder vissa studier protokoll för hög genomströmning ChIP experiment följt av PCR baserat kvantitering33,34. Slutligen finns nu vissa offentligt tillgängliga analys plattformar för ChIP-Seq data såsom Easeq35 och Galaxy36. En integrerad plattform för att utföra ChIP-Seq i en hög genomströmning mode i kombination med en computational pipeline att utföra enda varumärke samt kromatin staten analyser har dock saknats.

Det här protokollet beskriver ett komplett och omfattande ChIP-seq arbetsflöde för genome-wide mappning av kromatin staterna i tumörvävnad och cellinjer, med lätt för att följa riktlinjer som omfattar alla steg som krävs för ett lyckat experiment. Genom att anta en hög genomströmning metod tidigare beskrivits av Blecher-Gonen o.a. 37, detta protokoll kan utföras på dussintals prover parallellt och har tillämpats på cancer cellinjer och mänskliga tumörer såsom melanom, kolon, prostata och glioblastoma multiforme. Vi visar metoden för sex core Histon ändringar som representerar viktiga komponenter av epigenetiska reglerande landskap i mänskliga melanom cell linjer och tumörprover. Dessa ändringar inkluderar H3K27ac (smakförstärkare), H3K4me1 (aktiva och balanserande smakförstärkare), H3K4me3 (initiativtagare), H3K79me2 (transkriberas regioner), H3K27me3 (polycomb förtryck), och H3K9me3 (heterochromatic förtryck). Dessa märken kan användas antingen ensamt eller i kombination för att identifiera funktionellt distinkta kromatin stater som representerar både repressiva och aktiva domäner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla kliniska prover erhölls efter riktlinjerna i institutionella Review Board.

1. buffert förberedelse

  1. Gör 200 mL TE buffert (10 mM Tris-HCl, 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra pH 8,0).
  2. Gör 200 mL STE buffert (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 140 mM NaCl).
  3. 200 mL av 2,0 M glycin (37.52 g av glycin i 200 mL vatten) och värm den till 65 ° C.
  4. Gör 200 mL 5% natrium deoxicholat (DOC) lösning (10 g av DOC i 200 mL vatten).
  5. Gör 500 mL ChIP skörd buffert (12 mM Tris-Cl, 0,1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 6 mM EDTA, 0,5% sodium dodecyl sulfate (SDS)).
  6. Gör 500 mL förtunningsbuffert ChIP (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Gör 500 mL RIPA tvättbuffert (STE, 1% Triton x-100, 0,1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Gör 500 mL RIPA/500 tvättbuffert (RIPA bufferten + 360 mM NaCl).
  9. Gör 500 mL LiCL tvättbuffert (TE, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
  10. Gör 500 mL direkt eluering buffert: 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5% SDS.
  11. Gör 50 mL antikropp bindande/Blocking buffert (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0.2% IgG-fri BSA).

2. vävnads-eller cellprodukter linje bearbetning och Cross-linking

  1. Om vävnaden är flash frozen, dethaw det på is före dissociation.
  2. Avassociera 50 mg av vävnad (~ 8 mg per Histon modifiering antikropp) manuellt i 2 mL av Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) med hjälp av en steril rakblad. Finhacka vävnaden i 3 till 4 mm bitar under cirka 5 minuter i en steril vävnadsodling maträtt.
  3. Överföra vävnad och HBSS lösning i ett dissociator rör och lägga till ytterligare 8 mL HBSS. Ytterligare avassociera vävnaden med hjälp av en dissociator tills homogeniserade.
  4. För melanom tumörer, placera rören i en dissociator och kör följande cykler var en gång i denna ordning: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 och m_heart_02.01.
  5. Skrapa 21 × 106 celler i 10 mL av medium (~ 3 × 10-6 per Histon modifiering och ingång; det kan sänkas till 100 000 celler per mark för sällsynta populationer) odlas i en standard vävnadsodling skålen och samla dem i en 15 mL koniska rör.
    Obs: Media som används för representativa melanom cell fodrar WM115 är DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint Serum och 5% penicillin/streptomycin.
  6. Crosslink vävnader och celler använda 1% slutliga formaldehyd koncentration genom att lägga till 200 µL 16% formaldehyd per 3 mL HBBS för vävnad (eller 3 mL medium för celler). Skaka blandningen på 10 varv med en mixer för exakt 10 min vid 37 ° C.
    Försiktighet: Formaldehyd är giftig och bör hanteras i en lämplig dragskåp.
  7. Tillsätt 200 µL av 2,0 M glycin per 3 mL av provet och Fortsätt skaka på 10 rpm för en annan 5 min vid 37 ° C.
    Obs: Glycin fungerar som en törstsläckare. Gör färska glycin lösning varje månad som pH pf lösningen tenderar över tid.
  8. Snurra proverna vid 934 x g i 5 minuter vid 4 ° C med en bänkmonterade centrifug. Ta bort supernatanten, tillsätt 5 mL av is kallt PBS, Centrifugera proverna igen vid 934 x g och avlägsna supernatanten.
  9. Blixt frysa pelleten och förvara den vid-80 ° C för vidare bearbetning.

3. vävnad Lysis, ultraljudsbehandling och antikropp förberedelse

  1. Lös upp 1 proteas hämmare tablett per 10 mL av ChIP skörd buffert.
  2. Tillsätt 300 µL av ChIP skörd buffert med proteashämmare per 50 mg av vävnad och 30 min med Lys på is.
    Obs: Tillsätt 300 µL av ChIP skörd buffert med proteashämmare per 1 X 107 WM115 melanom cell linjer.
  3. Cellerna lyseringslösning, slå på den i vattenbad disruptor och associerade kylsystemet och låta temperaturen nå 4 ° C. Placera någon sonikator rören i vattenbad disruptor och Sonikera melanom vävnader för 60 cykler vid 30 s på och 30 s off att erhålla kromatin fragment av ~ 200-600 baspar (bp).
    Obs: Ultraljudsbehandling tid kan variera mellan vävnadstyp och bör justeras. Detta är ett kritiskt steg och bör optimeras i pilot experiment innan du fortsätter till immunoprecipitation.
  4. Under ultraljudsbehandling, tvätta 20 µL av protein G magnetiska pärlor per antikropp per prov tre gånger med 1000 µL av bindande/blockerande buffert (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. För ~ 8 mg av melanom vävnad, inkubera 3 µg varje Histon antikroppar i 100 µL av bindande / blockerande buffert för 2 h vid 4 ° C med rotation med en tube revolver. 12 prover för en singular antikropp innehåller 240 µL av pärlor, 36 µg av antikropp och 1200 µL av bindande/blockerande buffert.
    För 3 × 106 celler, använder du 5 µg av varje antikropp och 30 µL av Protein G magnetiska pärlor per antikropp. Antikropp och Protein-G pärlor bör titreras om olika mängd vävnad används. Detta protokoll illustrerar immunoprecipitation villkoren för de beskrivna sex Histon ändringarna (Tabell för material), dock antikropp koncentrationer bör optimeras för andra modifieringar och transkriptionsfaktorer.
  6. Bestämma fragment storlek, bort 20 µL av sonciated kromatin lösning och lägga till en eluering buffert master mix (rumstemperatur) som innehåller 44 µL av direkta eluering buffert, 1 µL RNase (20mg/mL) och 5 µL proteinas K (20mg/mL) per prov. Inkubera proverna i en PCR termocykel för minst 2 h vid 50 ° C. Rena provet med hjälp av en PCR-rening kit efter tillverkarens anvisningar.
  7. Säkerställa kromatin är tillräckligt klippt genom att bestämma fragment storlek använder en högkänslig DNA elektroferogram instrument innan du fortsätter till steg 3.6. Slå på instrumentet elektroferogram.
  8. Fyll 2 µL av hög känslighet buffert reagens i varje brunn av en 8-bra optisk tub remsan. Fyll 2 µL av hög känslighet stege i den först väl och 2 µL av renat prover i återstående brunnarna.
  9. Placera optisk tub caps på tube stips och vortex proverna vid 2000 rpm för 1 min. Öppna locket och sätt en ny hög känslighet skärmen tejp och låda av lastning tips. Strip locken och läsa in proverna i elektroferogram instrument.
  10. Öppna analysprogram, Markera först tretton utrymmen på skärmen bandet och tryck på Start-fliken i det nedre högra hörnet. Kromatin fragment mellan ~ 200-1000 bp är lämpliga för ChIP.
  11. Överföra den sonicated lösningen till sterila tuber och snurra rören vid 21,130 x g använder en bordsskiva centrifug för 15 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till nya rör.
  12. Fastställ den totala volymen av supernatanten och ta bort 10% av den totala lösningen för Inspelningsvolym och förvara den vid 4 ° C.

4. kromatin Immunoprecipitation

  1. Lös 2 proteas hämmare tabletter per 20 mL förtunningsbuffert ChIP.
  2. Efter ultraljudsbehandling utspädd återstående provet 5 gånger med hjälp av ChIP förtunningsbuffert för att föra SDS nivåer ner till 0,1%. Späd 270 µL av återstående supernatanten med 1080 µL förtunningsbuffert ChIP att erhålla en slutlig total volym av 1350 µL.
  3. När inkubering av antikropp och protein G magnetiska pärlor är klar, placera röret på en magnet och avlägsna supernatanten.
  4. Med det röret som fortfarande sitter på magneten, tvätta pärlorna en gång genom att lägga till 750 µL förtunningsbuffert ChIP med proteashämmare.
    Obs: Det är viktigt att inte störa pärlor eller rotera rören under detta steg.
  5. Ta bort ChIP förtunningsbuffert tvätta och återsuspendera pärlorna i 240 µL av den samma ChIP förtunningsbuffert. Alikvotens 20 µL av pärlor i 12 separata rör, som används för ett separat vävnadsprov.
  6. Alikvot sonicated materialet jämnt protein G pärlor med specifika antikroppar och tumla med en tube revolver över natten vid 4 ° C.

5. tvätt- och omvänd Crosslinking av Immunoprecipitated DNA-proteinkomplex

  1. Nästa morgon efter omvänd crosslinking, överföra antikropp-protein lösningen till en plattan med 96 brunnar och placera den på det magnetiska stativet. Tillåta pärlor för att följa för minst 30 s och ta bort supernatanten.
  2. Tvätta pärlor 5 gånger med 150 µL av iskall RIPA tvättbuffert använder en flerkanalig Pipettera. Under tvätta stegen, gör inte Pipettera pärlorna, men kontinuerligt flytta magneten från höger till vänster för 30 s per tvätt.
  3. Tvätta av prov två gånger med 150 µL av iskall RIPA-500 tvättbuffert.
  4. Tvätta av prov två gånger med 150 µL av iskall LiCl tvättbuffert.
  5. Tvätta proverna en gång med 150 µL av iskallt TE tvättlösning och ta bort TE buffert omedelbart. Detta steg kan utelämnas för låg ingående applikationer.
  6. Lägga till Input från steg 3,7 i färska brunnar i den plattan med 96 brunnar som innehåller de ChIP DNA-proverna.
  7. Efter tvätt steg, lägga till en eluering buffert master mix (rumstemperatur) som innehåller 44 µL av direkta eluering buffert, 1 µL RNase (20mg/mL) och 5 µL proteinas K (20mg/mL) per ChIP och Input prov för omvänd crosslinking.
  8. Inkubera proverna med en PCR termocykel för 4 h vid 37 ° C, 4 timmar vid 50 ° C och 8-16 h på 65 ° C.

6. rening och kvantifiering av utfällda DNA

  1. De nästa morgon, plats tillbaka proverna på magnet och överför supernatanten till en ny PCR-plattan med 96 brunnar som innehåller immunoprecipitated DNA.
  2. Lägga till 2.3 x paramagnetiska pärlor lösning (115 µL för 50 µL av lösning) och noggrant Pipettera upp och ner 25 tider med en flerkanalig Pipettera. Lösningen blir homogen om ordentligt blandat.
  3. Inkubera i lösning vid rumstemperatur utanför magneten för 4 min. plats proverna tillbaka på magneten och inkubera vid rumstemperatur i en annan 4 min. Kassera supernatanten.
  4. Samtidigt lämnar prover på magneten, tillsätt 150 µL av 70% etanol (vol/vol) och inkubera i rumstemperatur i 30 s utan att störa pärlorna.
  5. Avlägsna etanolen och upprepa tvätten. Låt paramagnetiska pärlorna till luft torka på magneten för 5 min.
    Obs: Ta bort alla etanol efter den andra tvättningen eftersom återstående etanol kommer störa rening.
  6. Ta bort proverna från magneten och tillsätt 30 µL 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Blanda genom pipettering 25 gånger och inkubera proverna vid rumstemperatur utanför magneten för 4 min.
  7. Placera proverna på magneten och inkubera vid rumstemperatur i en annan 4 min. överföra 20 µL av varje prov till en nya plattan med 96 brunnar för bibliotek beredning. Lagra de återstående 10 µL av ChIP DNA vid eventuella problem med generation av biblioteken.
  8. I detta skede kvantifiera ChIP DNA innan biblioteket förberedelse. De DNA-koncentrationen mäts med högkänslig DNA reagenser. Bestämma storleksfördelningen av utfällda DNA använder en högkänslig DNA elektroferogram instrumentet fortsätter till steg 7,1.

7. bibliotek Generation med hjälp av NEBNext Ultra II DNA bibliotek förberedelser Kit

  1. Generera bibliotek för NGS sekvensering använder DNA bibliotek förberedelse efter rekommenderade protokollet från tillverkaren. Alla reaktioner utförs i 96 brunnar och inkubationer utförs i en PCR termocykel med lock temperatur uppsättningen > 100 ° C och den volym som ställts in på 50 µL.
  2. För index används Multiplex Oligos för NGS-plattformen. Utföra sammanlagt 10 x cykler för PCR-amplifiering med följande inställningar: inledande denaturering vid 98 ° C i 30 s, denaturering på 98 ° C för 10 s, glödgning/förlängning vid 65 ° C i 30 s (10 x cykler), slutliga förlängning 65 ° C i 5 min och håll vid 4° C.
    Obs: Tabell 1 innehåller primers för PCR-amplifiering.
  3. Efter PCR-amplifiering, ta bort proverna och få total volym 100 µL med nuclease-gratis vatten. Utföra dubbelsidig paramagnetiska storlek urval (0.55x/0.8x) av första lägga 55 µL av pärlor och blanda genom pipettering 25 gånger. Inkubera proverna vid rumstemperatur utanför magneten för 4 min.
  4. Placera proverna på en magnet och odla i rumstemperatur i en annan 4 min. Det här steget används för att behålla stora fragment på pärlor som är olämpliga för sekvensering.
  5. Överför supernatanten till en ny PCR-plattan med 96 brunnar. Kasta inte bort supernatanten eftersom detta innehåller delvis renat DNA.
  6. Lägga till en annan 25 µL av paramagnetiska pärlor och blanda genom pipettering 25 gånger och odla i rumstemperatur utanför magneten för 4 min.
  7. Placera prover på magneten och odla i rumstemperatur i en annan 4 min och kasta bort supernatanten. Det här steget används för att behålla fragment av ~ 200 till 600 bp som kommer att användas för slutbehandlad bibliotek.
  8. Samtidigt lämnar prover på magneten, tillsätt 150 µL av 70% etanol (v/v) och tillåta inkubation för 30 s utan att störa pärlorna (inte flytta samtidigt på magneten). Avlägsna etanolen och upprepa tvätten en andra gång.
  9. Tillåta paramagnetiska pärlor för att lufttorka som på magneten för 5 min. ta bort alla etanol efter den andra tvättningen eftersom återstående etanol kommer störa rening.
  10. Ta bort proverna från magneten och tillsätt 25 µL 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Blanda genom pipettering 25 gånger och odla i rumstemperatur utanför magneten för 4 min. plats proverna tillbaka på magneten och odla i rumstemperatur i en annan 4 min.
  11. Kvantifiera bibliotek med en högkänslig DNA elektroferogram instrumentet innan multiplexing för att säkerställa storlekar är lämpliga för sekvensering. Färdiga bibliotek varierar mellan 200-600 bp och saknar alla primer dimerer.
    Obs: Om det behövs en annan 0,7 x paramagnetiska pärla rening utförs för att ta bort oönskade primer dimerer som finns på ~ 130 bp.
  12. Pool kvantifierade DNA baserat på unikt index primers enligt koncentration. För poolen som innehåller sex prover med koncentrationer mellan 1 ng/µL och 6ng/µL är fördelningen 15 µL av lägsta provet och 2,5 µL av högsta provet. Detta görs för att säkerställa Läs räkningarna fördelas jämnt på varje lane av cellen flöde.

8. ChIP-seq Data efterbearbetning

  1. En rörledning baserad på snakemake38,39 används till processen för alla följande steg i ett enda kommando. Ännu viktigare, dessa steg diskuteras individuellt med associerade kommandon.
  2. Bestämma kvalitet av rå fastq sekvensering läser med hjälp av FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): öppna unix terminal och ändra katalogen (cd) till mappen som innehåller filerna för raw fastq för var och en av de sex Histon-ändringarna. I unix terminaltyp, fastqc *fastq.gz och tryck på [Retur]. Detta kommer att köras kvalitetskontroll mätvärden på alla fastq filer i mappen.
  3. Justera kvalitet läsningar till referens genomet och ta bort dubbletter före komprimering till bam filer. Detta utförs med hjälp av bowtie version 1.1.239, SAMBLASTER version 0.1.2140och SAMTOOLS version 1.3.141: I unix terminaltyp, bowtie -m 1 - n 1--bästa--strata -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools Visa -Sb - > histone1.bam och tryck på [Retur].
    Obs: path_to anger den mapp som innehåller den hg19 mänskliga genom församlingen. Detta kommer att ändras beroende på organismen av intresse.
  4. Sortera bam filer med SAMTOOLS med följande kommando: I unix terminaltyp, samtools sortera histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted och tryck på [Retur].
  5. Indexfiler bam med SAMTOOLS med följande kommando: I unix terminaltyp, samtools index histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai och tryck på [Retur].
  6. Bestämma unikt mappade och rundbordsvridning läsningar med SAMTOOLS flagstat med följande kommando: I unix terminaltyp, samtools flagstat histone1.sorted.bam och tryck på [Retur].
  7. Normalisera bam filer per Läs räknas genom att utföra stickprov med följande kommando: I unix terminaltyp, se sambamba -f bam-delsampling-utsäde = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools sortera -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam och tryck på [Retur].
  8. Indexera bam filer igen med SAMTOOLS med följande kommando: I unix terminaltyp, samtools index histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai och tryck på [Retur].
  9. Att visualisera ChIP-seq bibliotek på en genomet webbläsare (dvs. UCSC eller IGV), generera pamp filer med deepTools version 2.4.040 genom att skala bam filer till läsningar per kilobase per miljon (RPKM). Detta kan utföras med följande kommandon:
    1. För standard pamp filer: I unix terminaltyp, bamCoverage -b histone1. downsample.sorted.BAM--normalizeUsingRPKM--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw och tryck på {RETURN].
    2. För input subtraheras pamp filer: I unix terminaltyp, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--baserat på subtrahera--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW och tryck på [Retur].
  10. Identifiera ChIP-seq signal berikning över ”Input” bakgrunden med hjälp av modellbaserad analys av ChIP-seq (Mac) version 1.4.225,26 och version 2.1.0. Använd macs1 för ”point source” faktorer H3K4me3, H3K4me1 och H3K27ac och macs2 för ”bred källa” faktorer H3K79me2, H3K27me3 och H3K9me3. Detta utförs med hjälp av följande kommandon:
    1. För punkt källa: I unix terminaltyp, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--keep-dup alla - n histone1.file och tryck på [Retur].
    2. För bred Källa: I unix terminaltyp, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6--bred--bred-cutoff 1e-6--keep-dup alla--nomodel - n histone1.file och tryck på [Retur].
  11. Användning ChromHMM24 att identifiera kombinatoriska kromatin staten mönster baserat på Histon ändringar studerade med följande kommandon:
    1. Skriv, cd/path_to/ChromHMM_folder i unix-terminalen och tryck på [Retur].
    2. En gång i ChromHMM katalog typ, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output och tryck på [Retur].
    3. Typ, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 och tryck på [Retur].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll tillåter immunoprecipitation från fryst tumörvävnad och cellinjer som kan utföras på dussintals prover parallellt med en hög genomströmning metod (figur 1A). Kromatin fragment bör variera mellan ~ 200-1000 bps för optimal immunoprecipitation. Vi har noterat att den tid som behövs för att uppnå samma klippning längd varierar för olika vävnader och celltyper. Framgången för ChIP från små mängder vävnad beror på att hålla den lysate kallt hela tiden speciellt under ultraljudsbehandling. Renat ChIP-DN skulle kvantifieras innan du fortsätter till biblioteket förberedelse (figur 2A). Färdiga bibliotek passar multiplexering och NGS bör variera mellan ~ 200-600 bp och sakna någon primer dimerer (figur 2B). Vid efter sekvensering, det finns många kvalitetskontroll mått som bör vara uppfyllda innan du fortsätter till ytterligare steg pipeline, såsom Mac peak-ringer eller ChromHMM analys (figur 3). Många av dessa mätvärden kan bestämmas med hjälp av program som FastQC och MultiQC. Kvalitet fastq läser anpassas till det mänskliga genomet på en kurs om ~ 50-80% med högst en obalans. En rekommenderad sekvensering djup är ~ 10-15 miljoner unikt mappas läsningar för ”point source” faktorer och ~ 20-30 miljoner unikt mappas läsningar för ”bred källa” faktorer27,41,42,43. Sorterad och indexerade BAM-filer används för att generera pamp filer som kan visualiseras med en genomet webbläsare såsom IGV eller UCSC. ChIP prover ska berikas över ingående DNA och varje Histon ändring bör visa en tydlig profil som representerar en viss komponent av epigenetiska landskapet (figur 4A). Det är möjligt i vissa vävnader att högre nivåer av bakgrundsljud som kan skymma ChIP-seq signalen. Om detta inträffar, är det rekommenderat att generera indata subtraherade pamp filer och åter visualisera en genomet webbläsare. För att avgöra kromatin staten profiler, använder vi ChromHMM algoritm24. ChromHMM använder en multivariat gömd Markovmodell för att identifiera de mest framträdande återkommer kombinatoriska och rumsliga kromatin mönster baserat på ändringarna som Histon studerade (figur 5). ChromHMM använder dessa sex ändringar och identifierar funktionellt distinkta kromatin stater som representerar både repressiva och aktiva domäner, såsom polycomb förtryck (läge 1), heterochromatic förtryck (staten 5), aktiva transkription (State 8 och 9) och aktiva förstärkare (State 13 och 14). Utdata från ChromHMM innehåller segmenterade bed filer för varje stat som kan vidare användas för efterföljande analys.

Figure 1
Figur 1: arbets-flöde för ChIP modul. Biopsier tumörvävnad är först längre är kopplade och tvärbunden för att fånga protein-DNA interaktioner. Vävnad är då sonicated för att erhålla kromatin fragment passar immunoprecipitation och Histon-DNA komplex fälls ut med hjälp av de sex angivna antikropparna. Prover är tvättade, tvärbindningar återförs och ChIP-DNA renas och kvantifieras. Bibliotek genereras från renade DNA och multiplexed enligt unika index. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Elektroferogram analys av renat ChIP-DNA och färdiga bibliotek förberedelse. (A) representant elektroferogram från renat ChIP-DNA innehållande kromatin fragment ~ 200-600 bp som är lämplig för bibliotek förberedelse. (B) representant elektroferogram från färdiga bibliotek efter förstärkning och dubbelsidig paramagnetiska storlek urval som passar för multiplexing och NGS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Arbets-flöde för ChIP-seq databehandling modul. Arbets-flöde visar kritiska steg för ChIP-seq databehandling och förberedelse för efterföljande analys. Rörledningen används i detta protokoll genererades med snakemake, men dessa steg kan också utföras individuellt som beskrivs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Genomet Webbläsarvy Histon ändring ChIP-seq spår. (A) ChIP-seq spår genereras av deeptools visar aktiva och bortträngda regioner som omger det nationella Regleringsmyndigheter locus i en representativ melanom tumör provet. Gener som de nationella Regleringsmyndigheterna, CSDE1 är SIKE1 är associerade med alla aktiva Histon ändringar (H3K27ac, H3K4me3 och H3K4me1) och aktiva transkription (H3K79me2), medan flankerande gener AMPD1, DENND2C och SYCP1 innehåller polycomb repressiva mark H3K27me3 och inte innehåller aktiva transkription. (B) chIP-seq spår genereras av deeptools visar redo Heterokromatin över ZNF gener i representativa melanom tumör provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : ChromHMM modell baserat på melanom tumörprover. Utsläpp-profil från en 15-State LearnModel baserat på de sex Histon ändringarna studerade. ChromHMM identifierar funktionellt distinkta kromatin stater som representerar både repressiva och aktiva domäner, till exempel polycomb förtryck (läge 1), heterochromatic förtryck (staten 5), aktiva transkription (State 8 och 9) och aktiva förstärkare (State13-14 ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det här protokollet beskriver en komplett och heltäckande hög genomströmning ChIP-seq modul för genome-wide mappning av kromatin staterna i mänsklig tumörvävnad och cellinjer. I ChIP-seq protokoll är en av de viktigaste stegen antikropp specificitet. Här, illustrerar denna metod immunoprecipitation villkor för beskrivs sex Histon ändringarna, varav alla är ChIP-grad och tidigare har validerats i våra och andra laboratorier42,44,45 . Medan samma antikropp koncentrationerna har framgångsrikt tillämpat olika andra tumortyper, är det viktigt att fastställa antikropp specificitet studerar olika faktorer av intresse27.

En annan viktig aspekt för ett lyckat experiment inkluderar optimering av ultraljudsbehandling villkor. Ultraljudsbehandling tid kan variera både mellan prov och vävnad typ och måste justeras. För korrekt optimering utförs provkörning för varje prov genom inkrementellt ökande ultraljudsbehandling tiden och kontinuerligt kontrollera fragment storlek. För inledande ChIP-experimentet kromatin fragment bör variera mellan ~ 200-1000 bp för optimal immunoprecipitation och renat ChIP-DNA ska kvantifieras innan du fortsätter till biblioteket förberedelse. Detta fragment storlek garanterar optimal produktion och lagring av amplifierade DNA (~ 200 till 600 bp) som ska användas för multiplexing och NGS. Om dessa experiment på ett sätt som hög genomströmning, är en bra utgångspunkt för multiplexering att pool ~ 8 prover per körfält för sekvensering. Medan denna mängd prover kan producera ett grunt sekvensering djup, är det användbart för att testa antikropp kvalitet innan du fortsätter. En av flaskhalsarna sammanslagning flera prover är ojämlik täckning inlägget sekvensering. Vanligtvis en fluoremetric metod baserad kvantitering används, dock många-en-gånger det motsvarar inte sekvensering-klar molekyler i varje bibliotek. Den bästa metoden för kvantitering av bibliotek DNA är att utnyttja qPCR använder standarder gjorde-av förutbestämda redo för sekvensering DNA-molekyler.

Ett annat viktigt steg i ChIP-Seq datamängd analys efter sekvensering databehandling. Viktigt, innan du fortsätter till någon aspekt av nedströms analys finns det olika kvalitetskontroll mått som bör uppfyllas först. Program som FastQC kommer att ge information om kvaliteten på raw fastq sekvensering läsningar i form av pass eller misslyckas testning. Medan den fastq läser bör passera de flesta mätvärden, inkluderar några av de viktiga testerna grundläggande statistik, Per sekvens bas kvalitet, Per sekvens kvalitetsresultat och adapter kontaminering. FastQC-bearbetade läser anpassas till det mänskliga genomet och bör karta med en hastighet av ~ 50-80% med högst en obalans. Priser lägre än 50% kan tyda på problem i ChIP, bibliotek beredning eller sekvensering och kan innehålla föroreningar, låg kvalitet ChIP-DNA eller överdriven förstärkning under PCR. Under konverteringen av SAM till BAM filer, dubbletter läser först bör flaggas och sedan bort därefter med SAMBLASTER innan du fortsätter till ned provtagning. Viss nivå av dubbelarbete är normalt under PCR, är höga nivåer av dubbelarbete vanligtvis tyder på låg kvalitet ChIP-DNA, eller möjligen ett problem med biblioteket förberedelse. Alla kan utgångar från FastQC, bowtie och samblaster (kombinerade i flagstat) ledas in i MultiQC som ger en komplett interaktiv Sammanfattning av alla Kvalitetskontrollresultat. MultiQC visar kvalitetskontroll mätvärden från utdatafilerna i fastqc, bowtie och samblaster ger information om grundläggande statistik, justering procenttal och PCR dubbelarbete priser respektive.

Efter ned-provtagning normalisering, det nästa och förmodligen viktigaste steget är datavisualisering med en genomet webbläsare såsom IGV eller UCSC. Varje Histon modifiering utgör en nyckelkomponent i det epigenetiska reglerande landskapet, inklusive H3K27ac (smakförstärkare), H3K4me1 (aktiva och balanserande smakförstärkare), H3K4me3 (initiativtagare), H3K79me2 (transkriberas regioner), H3K27me3 (polycomb förtryck), och H3K9me3 (heterochromatic förtryck). Genom att använda dessa märken antingen ensamt eller i kombination, kan dessa histoner identifiera aktiva, redo eller bortträngda smakförstärkare och initiativtagare, samt transkriptionell status av kodande regioner. Detta visades med hjälp av ChromHMM, där funktionellt distinkta kromatin stater som representerar både repressiva och aktiva domäner identifierades. Dessa stater var definieras av singular märken, såsom polycomb förtryck (H3K27me3), hetrochromatic förtryck (H3K9me3) och aktiva transkription (H3K79me2), samt kombinatoriska märken, såsom aktiv förstärkare (H3K4me1 och H3K27ac) och transkriberat Smakförstärkare (H3K4me1, H3K27ac och H3K79me2).

Presenterade integrerade plattformen är väl lämpad för bestämning av beläggning av histoner eller transkriptionsfaktorer från vävnader prover. Vi har framgångsrikt utnyttjat detta protokoll för bestämning av beläggning av ovan nämnda sex märken från biopsi-storlek melanom prover. Dock har vi fortfarande inte fastställt lägsta mängden vävnad som krävs för framgångsrik ChIP-Seq ansökningar eftersom det är depenedent på den vävnadstyp liksom tillgängliga antikropp. Dessutom, även om vi använder rutinmässigt detta protokoll på färska, flash frozen och ULT frysta prover, vi har inte optimerat detta protokoll för FFPE vävnader. Vissa nyare studier har rapporterat protokoll för sådana vävnader46,47 och de föreslagna ändringarna det kan införlivas inom ramen för denna plattform för att testa om de presenterade plattformen kommer att vara användbart från FFPE-vävnad. Vi tror att detta kommer att vara mycket användbara i bestämning av kromatin staten mönster från kliniska material som erhållits från patienter under kliniska prövningar. Sammantaget det här protokollet beskriver en komplett och heltäckande ChIP-seq modul för genome-wide mappning av kromatin staterna i mänsklig tumörvävnad, med lätt för att följa instruktioner som omfattar alla nödvändiga komponenter för ett lyckat experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konflikter.

Acknowledgments

Vi tackar Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF kärna på MDACC för sekvensering stöd. Det arbete som beskrivs i denna artikel stöddes av bidrag från NIH bidraget (CA016672) till SMF kärna och NCI awards (1K99CA160578 och R00CA160578) till K. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma - Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA - IgG-free Sigma - Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag - 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Tags

Cancerforskning fråga 134 ChIP-Seq kromatin immunoprecipitation nästa generations sekvensering Histon modifiering mänsklig tumörvävnad metastaserande melanom kromatin staten profiler
En integrerad plattform för Genome-wide mappning av kromatin stater med hög genomströmning ChIP-sekvensering i tumörvävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., … More

Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., Maitituoheti, M., Raman, A., Amin, S., Liu, Z., Rai, K. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. J. Vis. Exp. (134), e56972, doi:10.3791/56972 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter