Summary
أننا مخطط بروتوكول للكشف عن التعبير المتزامن للوكيميا الخلايا الجذعية علامات على الخلايا الأولية من سرطان الدم النقوي الحاد بالتدفق الخلوي. نعرض كيفية قياس الثلاث السلف السكان وعدد سكانها احلركه المفترضة مع زيادة درجة من النضج. نحن أكدت وجود هؤلاء السكان في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها.
Abstract
سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) هو غير المتجانسة، وإذا لم تعالج، المرض المميت. هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المرتبطة بسرطان الدم لدى البالغين. في البداية، مكافحة غسل الأموال هو مرض خلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) تتميز بإلقاء القبض على التمايز، تراكم اللاحقة من اللوكيميا انفجار الخلايا، وانخفاض إنتاج عناصر المكونة للدم الوظيفية. عدم التجانس ويمتد إلى وجود الخلايا الجذعية اللوكيميا (المهارات)، مع هذه الخلية الحيوية المقصورة المتطورة للتغلب على الضغوط المختلفة اختيار المفروضة أثناء تطور سرطان الدم والعلاج. لتعريف السكان احلركه، يسمح إضافة CD90 و CD45RA بالتمييز هسكس الطبيعي وفروعه multipotent داخل المقصورة الخلايا CD34 + CD38. هنا، فإننا مخطط بروتوكولا للكشف عن التعبير المتزامن لعدة علامات احلركه المفترضة (CD34، CD38، CD45RA، CD90) في الخلايا الانفجار الأساسي للبشرية في مكافحة غسل الأموال بتدفق مولتيباراميتريك الخلوي. وعلاوة على ذلك، نعرض كيفية قياس الثلاث السلف السكان وعدد سكانها احلركه المفترضة مع زيادة درجة من النضج. نحن أكدت وجود هؤلاء السكان في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها. يمكن استخدام هذا الأسلوب للكشف والتحديد الكمي للمهارات المفترضة للمتابعة السريرية لاستجابة العلاج الكيميائي (أي.، الحد الأدنى من الأمراض المتبقية)، كما احلركه المتبقية قد تسبب الانتكاس مكافحة غسل الأموال.
Introduction
سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المرتبطة بسرطان الدم. في البداية، مكافحة غسل الأموال هو مرض الاستنساخ من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) تتميز بإلقاء القبض على التمايز، تراكم اللاحقة لانفجار الخلايا، وانخفاض إنتاج عناصر المكونة للدم الوظيفية. في الآونة الأخيرة، أنشئت الاستنساخ تنافر انفجار الخلية أساسا باستخدام استراتيجيات التسلسل (خ ع) الجيل المقبل، وتشير إلى وجود تطور الاستنساخ داخل ورم الخلايا1.
عدم تجانس يمتد إلى وجود الخلايا الجذعية ليوكيميك (المهارات). هو الافتراض بأن تتطور هذه المقصورة الخلية الحيوية للتغلب على الضغوط التحديد المختلفة المفروضة أثناء تطور سرطان الدم والعلاج. ولذلك يفترض أن تكون مقاومة لنظم العلاج الكيميائي الحالي والتوسط في انتكاس المرض، مع آثار عميقة السريرية2احلركه. وقد وصف علامات مختلفة لتوصيف احلركه مثل CD1233, CLL-14، CD975 أو تيم-36. يعتبر الإثراء احلركه7 CD34 + CD38-حجرة الانفجار الخلايا بل يشمل أيضا HSC العادي. CD90 و CD45RA التعبير ينطبق على CD34 + CD38-المقصورة (P6) (الشكل 1) تصاريح لفصل عدة مراحل من السلائف المكونة للدم العادي والخبيث8. على وجه التحديد، العادي CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-هسكس, multipotent موروث (MPP) مثل CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-الخلايا CD34 + CD38-CD90-CD45RA + يمكن تحديد الخلايا اللمفاوية أعدادا السلف multipotent (لمب) في معظم مكافحة غسل الأموال الحالات8 ،9. الأسفار متوسط الكثافة (MFI) CD38 مهم بشكل خاص النظر داخل المقصورة الخلايا CD34 +. نظراً لكثافة CD38 يحدد ثلاث مقصورات خلية جديدة منها: CD38 السلبية (P6)، CD38 خافت (P7) ومشرق CD38 (P8) (الشكل 1). وقد يحدد مؤسسة مونتانيار CD38 استخدام أما هيماتوجونيس و/أو خلايا البلازما كرقابة داخلية إيجابية كما أعرب هذه الخلايا بشدة CD38.
الطراز الماوسفارغة (مجموعة موردي المواد النووية) العوز إيماءة/نظام/IL2Rγc يستخدم على نطاق واسع ل engraftment عادي والخلايا المكونة للدم الخبيثة الإنسان10،11. وتستخدم فحوصات السلالة المسلسل تجريبيا التحقق من الدالة احلركه أو HSC. هذه الدراسات قد تم تحليلها على نطاق واسع بالنهج تسلسل واسعة النطاق. على الرغم من ذلك، يعرف حول إيمونوفينوتيبي احلركه و HSC لمكافحة غسل الأموال الانفجار السكاني انجرافتيد في الفئران مجموعة موردي المواد النووية مقارنة مكافحة غسل الأموال الأولية (الشكل 2).
إعداد احلركه أصلاً منخفضة وبالتالي، والتحديد الكمي للمهارات التحدي والطريقة الموضحة هنا يمكن استخدامها مقايسة سيتوميتريك تدفق في التشخيص والمتابعة السريرية لتقييم استجابة العلاج الكيميائي (كما قد احلركه المتبقية تسبب الانتكاس مكافحة غسل الأموال). قد يشير إلى وجود احلركه الأمراض المتبقية ضئيلة الإيجابية (MRD). وحتى الآن، رصد في مكافحة غسل الأموال في معظمها تعتمد على الأساليب الجزيئية (أي، الرايت-بكر، خ ع)10،12. بيد في هذا البروتوكول يمكننا الكشف عن التعبير البروتين المتزامن لعدة علامات HSC/احلركه (CD34، CD38، CD45RA، CD90) في الابتدائي انفجار الخلايا لمكافحة غسل الأموال البشرية بتدفق مولتيباراميتريك الخلوي2،،من89. يمكن تطبيق هذا المزيج من الأجسام المضادة في أي مختبر قياس التدفق القياسي وهذا الإنزيم MRD تدفق مثير للاهتمام خاصة عند MRD بالوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (RT-PCR) ليس من الممكن، أيإذا اللوكيميا محددة جزيئية علامات لا يمكن كشفها في العينة التشخيصية مكافحة غسل الأموال. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول، مكمل للتقنيات الجزيئية MRD أكثر حساسية، كما أنها تهدف إلى كشف وتحديد الخلايا غير طبيعية السلف المكونة للدم الذي يمثل إحدى خصائص وظيفية خلية (الشكل 3).
نعرض كيفية قياس الثلاث المكونة للدم السلف السكان وحجرة احلركه المفترضة مع اختلاف درجة النضج بالتدفق الخلوي مع الأجسام المضادة متوفرة في معظم المختبرات السريرية. وعلاوة على ذلك، أكدت وجود هذه المقصورات الخلية في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها (PDX)، وفي العلاج متابعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ونحن نتابع المعايير الأوروبية لاستخدام الحيوانات للأغراض العلمية. أقر هذه الدراسة اللجنة المحلية للأخلاقيات (#3097-2015120414583482v3).
1. إعداد نموذج
- جمع نخاع العظم (2 مل) من حيثياته مكافحة غسل الأموال في الأنابيب التي تحتوي على حمض التخثر الإيثيلين (يدتا) بتركيز 1.8 ملليغرام كل مل نخاع العظام.
- أداء فيكل فصل، فصل كثافة متدرجة لعزل الخلايا وحيدات النوى من الخلايا الحمراء والمحببة، كما يتبع. تمييع نخاع العظام في 3 مجلدات من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (برنامج تلفزيوني: خ2ص4 ، غ2هبو4 ملم 10 ملم 137 كلوريد الصوديوم، بوكل 2.7 مم 1.8 مم). تراكب 1 حجم فيكل بحجم 1 من المخفف نخاع العظام بعناية. تدور 30 دقيقة على 300 غرام x دون الفرامل. نقل الطبقة البيضاء معطف بافي خلايا مونونوكليتيد في أنبوب عقيم جديدة.
- تغسل الخلايا مرتين في 10 مل من برنامج تلفزيوني) والطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق، بغية إزالة تلويث المصل المكونات.
2-تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC)
- إضافة 2 مل من تحلل المخزن المؤقت (كلوريد الأمونيوم 0.8 في المائة) إلى الخلية بيليه، دوامة بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، كرر هذه الخطوة. - أغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني كما تم وصفه سابقا (1.3.).
3-المريض المستمدة تكثيفها.
- الحصول على انفجار الخلايا من نخاع العظم بعد الانفصال فيكل وبعد استنفاد الخلايا الليمفاوية باستخدام إيمونوماجنيتيك السلبية التحديد (CD3 T-، و CD20 للخلايا الليمفاوية ب). اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
- حقن 5 × 106 مكافحة غسل الأموال انفجار الخلايا في هذا السياق ذيل من الفئران مجموعة موردي المواد النووية غير المشروطة. استخدام جهاز تقييدي لتيسير حقن الوريد الذيل. تبقى الفئران تحت الشروط التقليدية، وخاصة في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض خاصة في جميع الأوقات، باستخدام الأقفاص التهوية الفردية والتلاعب تحت غطاء الاندفاق الصفحي. كل أسبوعين، تأخذ 60 ميليلتر من الدم بطريقة جمع اللهاة استخدام الهيماتوكريت الشعرية. مكان شعري في 5 مل جولة الأنبوبة السفلي. إيقاف التسييل بتطبيق ضغط لطيف باستخدام وسادة صغيرة شاش معقم. اكسبولسي الدم بحقنه نظيفة.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل واحتضان لمدة 5 دقائق. ثم الطرد المركزي في 300 غرام x لأدنى 5 يغسل مع برنامج تلفزيوني وسينتريفوجري في 300 x ز لمدة 5 دقائق. إزالة المادة طافية، إضافة 100 ميليلتر برنامج تلفزيوني مع وصمة عار ألبومين المصل البقري 10% (BSA) مع 3 ميليلتر المضادة الإنسان CD45-فيتك والفاري المضادة 1 ميليلتر CD45-آسيا والمحيط الهادئ، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بيليه خلية يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني (2 مل) مع جيش صرب البوسنة 10% وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
- الكوة تصل إلى 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في أنابيب التدفق الخلوي.
- باستخدام المسح انجرافتمينت كل أسبوعين بتحليل تشيميريسم التعبير CD45 (البشرية مقابل مورين) التدفق الخلوي (الشكل 2 أ و ب).
- بتضحيات (انفجار الطرفية عدد أكبر من 70% أو علامات سريرية شديدة من المرض)، جمع وحيدات النوى انفجار الخلايا من سحق الطحال ونخاع العظام بالتنظيف تيبياس وقصبة مع برنامج تلفزيوني كما تم وصفه سابقا13. Euthanize الفئران بسرطان عنق الرحم التفكك اتباع المبادئ التوجيهية الدولية.
- إذا احتوت الخلية بيليه على ربك، أداء تحلل خلايا الدم الحمراء مع تحلل المخزن المؤقت (الخطوة 2، 1).
- أغسل بيليه الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (2 مل) مع جيش صرب البوسنة 10% وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
- جمع الخلايا والكوة إلى 1 × 106 خلايا للواحد 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في أنابيب التدفق الخلوي.
4-التلوين
- إضافة الأجسام المضادة مترافق (راجع الخطوة 4، 2) ودوامه. احتضان خلايا لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- استخدم لوحة التالية للبشرية الأولية أو عينات PDX يتألف من 10 ميليلتر لمكافحة--CD36-فيتك، 5 ميليلتر لمكافحة--CD19-النماء، 5 ميليلتر لمكافحة--CD33-PC5.5، 5 ميليلتر لمكافحة--CD90--آسيا والمحيط الهادئ، 5 ميليلتر لمكافحة--CD34-AA700، 5 ميليلتر لمكافحة--CD45RA--آسيا والمحيط الهادئ-H7، 5 ميليلتر الأزرق ومكافحة CD38--المحيط الهادئ، 5 ميليلتر من مكافحة--CD123-PC7 و 2.5 ميليلتر لمكافحة--CD45-كو.
- إزالة الأجسام المضادة غير منضم بغسل الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق الخلايا في 450 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لتحليل تدفق النهائي سيتوميتريك.
5-النابضة استراتيجية لتحليل التدفق الخلوي
- إجراء الحصول على البيانات (خلايا على الأقل 500,000) على سيتوميتير تدفق مجهزة بأشعة الليزر الأحمر والأزرق والبنفسجي. تحقق من إعدادات سيتوميتير كل يوم لمحاذاة 1) البصري ونظام 2) فلويديك حساسية 3) البصرية 4) توحيد استخدام فلوروسفيريس
- اتبع استراتيجية النابضة متسلسلة تعريف تعبير CD38 (الشكل 1).
- استخدام الخلايا من عينات نخاع العظم الطبيعي لتعريف هيماتوجونيس أو خلايا البلازما التي ستكون بمثابة السيطرة الإيجابية لتعبير CD38.
ملاحظة: هذه البوابة أهمية خاصة لتقييم اللاحقة السكان احلركه المفترضة تتوقف على التعريف الخاص به. - تحديد الخلايا السلائف الفسيولوجية (انفجار الخلايا الطبيعية) بالمعايير السكانية المنخفضة (الجانب مبعثر) CD45dim/SSC (الشكل 1A). داخل هذا الانفجار السكاني، تحديد هيماتوجونيس، الذي عرض CD38 + + CD19 + النمط الظاهري (الشكل 1B) وأخيراً، استخدام تعبير CD36 و CD33 لتعريف مييلوبلاستس ومونوبلاستس واريثروبلاستس (الشكل 1). تحديد التعبير CD34 في هيماتوجونيس كما هو موضح في (الشكل 1E). تقييم العديد من الفئات السكانية الفرعية السلائف داخل خلايا الانفجار يعرف P6-P10 (الشكل 1). فصل المقصورة CD34 انفجار الخلايا في P6، P7، P8 السلف الفئات السكانية الفرعية استناداً إلى إعداد مسبق CD38 غيتس. ضمان أن حجرة P8 يحتوي على الانفجارات التي لها نفس الكثافة CD38 هيماتوجونيس، أن يشمل P6 الخلايا التي CD38-استناداً إلى الأسفار CD38 ناقص واحد (FMO) مراقبة وما بين النقيضين فيما يتعلق CD38 الخلايا P7 التعبير (الشكل 1).
- استخدام الخلايا من عينات نخاع العظم الطبيعي لتعريف هيماتوجونيس أو خلايا البلازما التي ستكون بمثابة السيطرة الإيجابية لتعبير CD38.
- من CD34 + 38-(P6) فصل الخلايا، وبوابات HSC من احلركه المفترضة التي تستخدم تعبير CD90 و CD45RA (الشكل 1F).
ملاحظة: هو النمط الظاهري HSC CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-وفروعه multipotent (MPP) تعرف بأنها CD34 + CD38-CD90-CD45RA-. النمط الظاهري احلركه المفترضة هو CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + والسكان المتلقين للمعلومات غير ناضجة أكثر من موروث اللمفاوية معبي (لمب) يعرف CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6-رصد RT-PCR MRD
- رصد مستويات واسطة RT-PCR كما هو موضح سابقا من14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا نقدم طريقة لتحديد السكان السلف في عينات نخاع العظام البشرية العادية والخبيثة. ونحن جمع نخاع العظم والطحال من PDX ناجحة وإجراء قياس التدفق مولتيباراميتريك كما هو موضح أعلاه. أننا بالمقارنة مع الفئات السكانية الفرعية عدة خلايا الانفجار بين عينة المريض التشخيص و PDX المقابلة وخاصة، حجرة CD34 + CD38-السلف، لا سيما المخصب احلركه المفترضة. وقد وجدنا أن الكسر CD34 + CD38-الانفجار كان أعلى في PDX مقارنة بالعينة المريض التشخيص (3.48% مقابل 0.53 في المائة، الرقم 2، د). من المثير للاهتمام، وجدنا نسبة مئوية أعلى من احلركه المفترضة (عرض CD34 + CD38-CD90-CD45RA + النمط الظاهري) في PDX مقارنة بالعينة المريض الأولية (2.76% مقابل 0.48%، الشكل 2 هاء، واو)، مما يوحي إثراء ممكن الخبيثة السلف الخلايا في الأنسجة الدموية في هذا الطراز الماوس. تواتر السلف العادي خلية الكسور لم تختلف بين PDX وعينه المريض.
وعلاوة على ذلك، قمنا بدراسة السكان السلف انفجار الخلية استناداً إلى التعبير عن CD34، CD38، CD90، و CD45A (كما هو موضح في هذا البروتوكول) في عينات المرضى المختلفة في التشخيص ومتابعة العلاج لتحديد مستوى. في أول مريض، CD34 + CD38--كسر (P6) زاد من 0.06 في المائة في التشخيص إلى 3.33% في متابعة المعاملة الأولى (الشكل 3 أ، ب). وفي المقابل، CD34 + CD38--كسر (P6) انخفضت في المريض الثاني من 7.8 في المائة في التشخيص إلى % 2.27 في متابعة المعاملة الأولى (الشكل 3 ج، د). تبعاً لذلك، زادت في أول مريض من 0% في تشخيص 0.65 في المائة (الشكل 3A'، ب) الكسر احلركه المفترضة وانخفضت في المريض الثاني من 6.57% عند التشخيص إلى 1.44 في المائة في متابعة العلاج (الشكل 3 '، D'). وبالمثل، رصد المؤشرات الجزيئية (أي، NPM1 الطفرة [أول مريض] وازفاء كبفب-MYH11 [المريض الثاني]) أظهرت أن MRD الجزيئية تنخفض أقل من ذلك في أول مريض (0.8 في المائة) بالمقارنة مع المريض الثاني (0.05%) للمعالجة الأولى النقطة المتابعة (3E الشكل، ز). أخيرا، للتحقق من صحة أن احلركه P6 المفترضة الخبيثة، التعبير عن اللوكيميا المرتبطة المستضدات تم تقدير CD123 و CD33، عرض التعبير غير طبيعي من CD33 لكل المرضى (3F الشكل، ز).
الشكل 1 : النابضة الاستراتيجية المستخدمة للسلائف الفسيولوجية ومكافحة غسل الأموال الانفجارات. كثافة الأرض مع النابضة السلائف الفسيولوجية سيظهر لنخاع العظم عادي. (أ) Gating انفجار الخلايا استناداً إلى النمط الظاهري CD45dimSSClow في جميع مونونوكليتيد الخلايا. (ب) جاتينج من هيماتوجونيس (CD38 + CD19 +) للتحقق من CD38 الإيجابية. (ج)-النابضة استراتيجية طبيعية مييلوبلاستس ومونوبلاستس واريثروبلاستس على أساس CD33 و CD36. (د) انفجار الخلايا يمكن فصلها في CD34 + السلف الفئات السكانية الفرعية واستخدام تعبير CD38 في P6 (CD34 + CD38-)، P7 (CD34 + CD38dim)، P8 (CD34 + CD38 +) خلية المقصورات. (ﻫ) Gating من هيماتوجونيس استناداً إلى تعبير CD34 و CD38، تحقق من الإيجابية CD38. تصميم HSC (ز) MPP، لمب والمفترضة احلركه الفئات السكانية الفرعية استخدام التعبير عن CD90 و CD45RA كما سبق وصف9. من المذكرة، لا كشف احلركه كهذا عينة نخاع العظم عادي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : انفجار الخلية السلف السكان في مريض وفي المقابلة المريض-المشتقة-إكسينوجرافت (PDX) بقياس التدفق مولتيباراميتريك. (أ-ب) تشيميريسم تحليل PDX. يتم تعريف الانفجارات مورين والبشرية (أ) أولاً بحجم وهيكل (منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب). (ب) في وقت لاحق، النسبة المئوية للبشرية مقابل تلطيخ CD45 مورين إرشادي من عبء إكسينونجرافتمينت وسرطان الدم. مقارنة CD34 + CD38-انفجار الخلايا النسبة المئوية بين التشخيص الأولية (ج) ونموذج (د) PDX مكافحة غسل الأموال. مقارنة احلركه المفترضة (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) بين (ه) مكافحة غسل الأموال الأولية و PDX (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : انفجار الخلية السلف السكان في اثنين من المرضى عند التشخيص وبعد مغفرة التعريفي العلاج للكشف عن الأمراض المتبقية الحد الأدنى (MRD)- تحليل سيتوميتريك للانفجار CD34 + CD38 خلية الفئات السكانية الفرعية في اثنين من المرضى الممثل (أ، ج) تدفق في التشخيص و (ب، د) بعد العلاج التعريفي مغفرة. الأرقام (A '-D') توضح كل البوابات P6 تتضمن احلركه المفترضة لاثنين من المرضى عند التشخيص وبعد العلاج الأولى. يظهر في (ه، ز) هو تحليل الأمراض المتبقية الحد الأدنى (MRD) من المؤشرات الجزيئية المستخدمة لهذه اثنين من المرضى على مدى فترة خمسة أشهر (NPM1 الطفرة والانصهار جين CBFß-MYH11، على التوالي). (و، ز) التعبير عن اللوكيميا المرتبطة المستضدات CD123 و CD33 على احلركه P6 المفترضة، يظهر التعبير غير طبيعي من CD33 لكل المرضى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتطلب إجراء تقييم دقيق واستنساخه من علامات هيولى بالتدفق الخلوي أو غشاء أن إعدادات أداة يتم التحقق من كل يوم لمحاذاة البصري، سليمة الأداء نظام فلويديك والحساسية الضوئية، وتوحيد استخدام الخرز المعايرة.
الكشف عن خلية انفجار السكان في مكافحة غسل الأموال باستخدام CD90 و CD45RA بتحليل تدفق حدودي متعدد الخلوي أسلوب بسيط نسبيا ويمكن الاعتماد عليها. خطوة حاسمة في هذا التحليل إجراء تقييم دقيق لتعبير CD38 في انفجار الخلايا، من أجل أداء النابضة الصحيح CD34 + CD38-السكان. كثافة CD38 يتم تعريفه باستخدام خلايا النخاع العادي على وجه التحديد في هيماتوجونيس و/أو خلايا البلازما (CD38 +). كثافة علامات أخرى تحدد باستخدام عناصر تحكم ايستب.
إضافة CD45RA و CD90 يستخدم للتمييز بين HSC احلركه المفترضة. هذا الأخير ولا HSC ربما سبب انتكاس المرض، وبالتالي هذا البروتوكول من مصلحة للأمراض المتبقية ضئيلة الرصد باستخدام لوحات التدفق الخلوي. الرصد لمكافحة غسل الأموال من خلال العلاج الضروري لتحسين خطر التقسيم الطبقي وتوجيه العلاج بمكافحة غسل الأموال. ولسوء الحظ، لا تتوفر الواسمات الجزيئية الملائمة لجميع المرضى. ولذلك، رصد MRD بالتدفق الخلوي قد يكون ممكناً لجميع الحالات مكافحة غسل الأموال. على الرغم من أن هذا الأسلوب قد لا تكون شاملة كما أنها فوكاليزيس في معظم الحالات مكافحة غسل الأموال التي قد CD34 + CD38-السلف وعدد سكانها احلركه المفترضة. من المذكرة، فمن الممكن أن تشمل حجرة احلركه المفترضة العادية فروعه، أي، لمب). وعلاوة على ذلك، لا يستبعد أن هناك حالات نادرة مع المهارات الوظيفية لا تتبع هذا النمط من التعبير غير طبيعي. من المذكرة، حتى في مكافحة غسل الأموال المتحولة NPM1 التي تعتبر CD34 السلبية، نحن قادرون على كشف احلركه المفترضة. ولذلك، على الرغم من عدم التجانس وتعقيد حجرة احلركه مكافحة غسل الأموال، لدينا أسلوب قد تستعمل كالعلامات البيولوجية لاستجابة العلاج الكيميائي أثناء متابعة لمكافحة غسل الأموال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل جزئيا فيوجين لوريت الرابطة الفرنسية والسرطان le ليجويكونتري (مركز الشمال)، ومؤسسة دي فرنسا (اللوكيميا) "اللجنة"، أونكوليلي SIRIC، ومعهد السرطان الوطني الفرنسي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
