Summary
Nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée des marqueurs de cellules souches de la leucémie sur les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primaire par cytométrie en flux. Nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes.
Abstract
La leucémie myéloïde aiguë (AML) est un hétérogène et si ne pas traitée, la maladie mortelle. C’est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie chez l’adulte. Au départ, AML est une maladie des cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques de leucémie et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches de la leucémie (LSC), avec cette cellule dynamique compartiment évoluer pour surmonter les diverses pressions de sélection imposée pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. Pour définir plus précisément la population de la LSC, l’ajout de CD90 et CD45RA permet la discrimination de la GPX normales et de cellules souches multipotentes dans le compartiment de cellules CD34 + CD38. Ici, nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée de plusieurs marqueurs LSC putatifs (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par cytométrie en flux multiparamétrique. De plus, nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes. Cette méthode de détection et de quantification de LSC putatif sont utilisables pour suivi clinique de la réponse de la chimiothérapie (i.e., maladie résiduelle), comme le LSC résiduelle peut provoquer une récidive AML.
Introduction
Leucémie myéloïde aiguë (LMA) est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie. Initialement, AML est une maladie clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. Récemment, clonale hétérogénéité de la population cellulaire blast a été établie essentiellement à l’aide de stratégies de séquençage (NGS) prochaines génération et montrant l’existence d’une évolution intra-clonale de cellules de tumeur1.
L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches leucémiques (LSC). Il est possible que ce compartiment cellulaire dynamique évolue pour surmonter les diverses pressions de sélection imposées pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. C’est pourquoi LSC sont censés être résistante aux traitements chimiothérapeutiques actuels et agir comme médiateur de la rechute de la maladie, avec de profondes implications cliniques2. Différents marqueurs ont été décrites pour caractériser la LSC comme CD1233, CLL-14, CD975 ou TIM-3,6. Le CD34 + CD38-compartiment de cellules blastiques est censé être enrichie pour LSC7 mais inclut également des HSC normal. CD90 et CD45RA expression appliquée à la CD34 + CD38-compartiment (P6) (Figure 1) permet de séparer plusieurs étapes de précurseurs hématopoïétiques normales et malignes8. Plus précisément, normaux CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-CSH, multipotentes progéniteurs (MPP) comme CD90dimCD45RA-cellules CD34 + CD38 et CD34 + CD38-CD90-CD45RA + cellules souches multipotentes lymphoïdes-amorcé (PPSP) peuvent être déterminées dans la plupart des AML cas8 ,,9. L’intensité de la fluorescence moyenne (IFM) de CD38 est particulièrement importante à considérer dans le compartiment de cellules CD34 +. Parce que l’intensité CD38 définit trois nouveaux compartiments cellulaires celle-ci : CD38 négatif (P6), CD38 dim (P7) et CD38 lumineux (P8) (Figure 1). L’IFM de CD38 peut être déterminée à l’aide de hematogones ou plasmocytes comme contrôle positif interne que ces cellules expriment fortement CD38.
Le modèle de sourisnull (NSG) immunodéficientes NOD/SCID/IL2Rγc est employé couramment pour greffe de normal et les cellules hématopoïétiques malignes humaines10,11. Série de xénotransplantation dosages sont utilisés pour valider expérimentalement fonction LSC ou HSC. Ces études ont été longuement analysés par les approches de séquençage à grande échelle. Néanmoins, on connaît moins le LSC et HSC lymphoblastiques de population de blast AML implantée chez des souris NSG par rapport à ses principaux AML (Figure 2).
Les numéros de LSC sont donc intrinsèquement faibles, identification et quantification de LSC sont difficiles et la méthode décrite ici peut être épuisée comme un essai de cytométrie en flux au diagnostic et au suivi clinique pour évaluer la réponse de la chimiothérapie (comme résiduel LSC peut provoquer une récidive AML). La présence de LSC peut indiquer la maladie résiduelle positive (MRD). À ce jour, MRD surveillance principalement dans AML s’appuient sur des méthodes moléculaires (c.-à-d., RT-PCR, NGS)10,12. Toutefois, dans ce protocole nous détectons expression de la protéine simultanée de plusieurs marqueurs HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par multiparamétriques écoulement cytometry2,8,9. Cette combinaison d’anticorps peut être appliquée dans n’importe quel laboratoire de cytométrie de flux standard et ce dosage MRD de débit est particulièrement intéressant lorsque MRD par PCR en temps réel (RT-PCR) n’est pas possible, c'est-à-diresi spécifique de la leucémie moléculaire marqueurs ne sont pas détectables dans l’échantillon diagnostic d’AML. En outre, le présent protocole, est complémentaire aux techniques plus sensibles MRD moléculaires, puisqu’il vise à détecter et à quantifier les cellules progénitrices hématopoïétiques anormales qui représente une caractéristique fonctionnelle cellulaire (Figure 3).
Nous montrons comment quantifier les trois populations de cellules souches hématopoïétiques et du compartiment de LSC putatif avec le degré de maturation par cytométrie de flux avec des anticorps disponibles dans la plupart des laboratoires cliniques. En outre, nous a confirmé la présence de ces compartiments cellulaires en correspondants patient-dérivés-xénogreffes (PDX) et au traitement suivi.
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Protocol
Nous suivons les normes européennes pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique local (#3097-2015120414583482v3).
1. préparation de l’échantillon
- Recueillir la moelle osseuse (2 mL) de novo de AML dans des tubes contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique anticoagulant (EDTA) à une concentration de 1,8 mg / mL de moelle osseuse.
- Effectuer la séparation de Ficoll, une séparation de gradient de densité à isoler des cellules mononucléaires de globules rouges et des granulocytes, comme suit. Diluer la moelle osseuse en 3 volumes de solution saline de tampon au phosphate (PBS : NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4 , KH2PO4 1,8 mM). Le recouvrement soigneusement 1 volume de Ficoll et 1 volume de moelle diluée. Faire tourner 30 minutes à 300 x g sans frein. Transférer la couche blanc couche leuco-plaquettaire de cellules mononucléées dans un nouveau tube stérile.
- Laver les cellules deux fois dans 10 mL de PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, afin de supprimer les composants de sérum contaminantes.
2. la lyse des globules rouges (RBC)
- Ajouter 2 mL de tampon de lyse (chlorure d’ammonium 0,8 %) à la cellule de granule, vortex doucement et incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
Remarque : si nécessaire, répétez cette étape. - Cellules de lavage en PBS comme décrit précédemment (1.3.).
3. le patient dérivé des xénogreffes.
- Obtenir les cellules blastiques de la moelle osseuse après la séparation de Ficoll et après épuisement de lymphocytes à l’aide d’immunomagnetic négatif sélection (CD3 pour T- et CD20 des lymphocytes B). Suivez les instructions du fabricant.
- Injecter 5 x 106 cellules blastiques d’AML dans la veine de queue de souris NSG inconditionnées. Utiliser un dispositif de retenue pour faciliter l’injection dans la veine queue. Garder des souris dans des conditions classiques et surtout dans des conditions spécifiques-exempts de micro-organismes pathogènes en tout temps, en utilisant des cages ventilées individuelles et en manipulation sous hotte à flux laminaire. Toutes les deux semaines, prenez 60 µL de sang par la méthode de collecte sous-maxillaire utilise un hématocrite capillaire. Place le capillaire dans un 5 mL rond tube inférieur. Arrêter le saignement en appliquant une légère pression à l’aide d’une petite compresse stérile. Expulser le sang avec une seringue propre.
- Ajouter 1ml de tampon de lyse et incuber pendant 5min. Puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min. laver avec PBS et centrifugre à 300 x g pendant 5 minutes. Retirer le surnageant, l’ajouter 100 µL PBS avec 10 % d’albumine sérique bovine (BSA) tache avec 3 anti-humain µL CD45-FITC et anti-murin 1 µL CD45-APC et incuber à 4 ° C pendant 30 minutes.
- Laver le culot cellulaire deux fois dans du PBS (2 mL) avec 10 % de BSA et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Aliquote jusqu'à 1 x 106 cellules par 100 µL de PBS dans des tubes de cytométrie de flux.
- Enquête sur la prise de greffe toutes les deux semaines par l’analyse de chimérisme d’expression de CD45 (humain versus murin) utilisant l’écoulement cytometry (Figure 2 a et B).
- Au moment du sacrifice (comte de blast périphérique supérieure à 70 % ou de signes cliniques graves de la maladie), recueillir les cellules blastiques mononucléaires des rates concassées d’et de la moelle osseuse en rinçant les tibias et fémurs avec PBS comme décrit plus haut13. Euthanasier souris par dislocation cervicale après les lignes directrices internationales.
- Si le culot cellulaire contient RBC, effectuer la lyse des globules rouges avec le tampon de lyse (point 2.1).
- Laver les cellules granule deux fois dans du PBS (2 mL) avec 10 % de BSA et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
- Recueillir des cellules et aliquote à 1 x 106 cellules par 100 µL de PBS dans des tubes de cytométrie de flux.
4. coloration
- Ajouter vortex et anticorps conjugués (voir point 4.2). Incuber les cellules pendant 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante.
- Utilisez le panneau suivant pour primaires humaines ou des échantillons PDX comprenant 10 µL d’anti-CD36-FITC, 5 µL d’anti-CD19-DCE, 5 µL d’anti-CD33-PC5.5, 5 µL d’anti-CD90-APC, 5 µL d’anti-CD34-AA700, 5 µL d’anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL d’anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL de anti-CD123-PC7 et 2,5 µL d’anti-CD45-KO.
- Ôter les anticorps non liés en lavant les cellules dans 2 mL de PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension cellules dans 450 µL de PBS pour cytométrie final.
5. gating stratégie pour analyse en cytométrie en flux
- Acquisition de données (au moins 500 000 cellules) effectuer un cytomètre en flux équipée avec les lasers rouges, bleues et violettes. Vérifiez les paramètres de cytomètre chaque jour pour un alignement 1) optique, système 2) fluidique, sensibilité 3) optique et 4) normalisation à l’aide de LeukoSure
- Suivre la stratégie de déclenchement séquentielle pour définir l’expression de CD38 (Figure 1).
- Cellules à partir des échantillons de moelle osseuse normale permet de définir des hematogones ou des cellules de plasma qui servira de témoin positif pour l’expression de CD38.
Remarque : cette porte est particulièrement importante d’évaluer les populations de LSC putatives ultérieures dépendent de sa définition. - Définir les cellules précurseurs physiologique (les cellules blastiques normales) selon des critères de population faible CD45dim/SSC (diffusion latérale) (Figure 1 a). Au sein de cette population de blast, définir hematogones, qui affichent une CD38 ++ CD19 + phénotype (Figure 1 b) et enfin, utiliser CD36 et CD33 expression pour définir myeloblasts, monoblastes et érythroblastes (Figure 1). Déterminer CD34 expression sur hematogones comme illustré (Figure 1E). Évaluer plusieurs sous-populations de précurseurs dans les cellules blastiques définis comme P6-P10 (Figure 1). Séparer le compartiment CD34 de cellules blastiques dans P6, P7, P8 sous-populations de géniteur issues de préréglage CD38 gates. Veiller à ce que le compartiment P8 contienne les explosions qui ont la même intensité de CD38 comme le hematogones, que P6 contient des cellules qui sont CD38-basé sur la fluorescence CD38 moins un contrôle (FMO) et que les cellules P7 sont entre ces deux extrêmes en ce qui concerne CD38 expression (Figure 1).
- Cellules à partir des échantillons de moelle osseuse normale permet de définir des hematogones ou des cellules de plasma qui servira de témoin positif pour l’expression de CD38.
- Le CD34 + 38-(P6) cellules fermées, séparer HSC de LSC putatif à l’aide de l’expression CD90 et CD45RA (Figure 1F).
Remarque : le phénotype HSC est CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- et les cellules souches multipotentes (MPP) sont définis comme CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Le phénotype putatif de la LSC est CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + et la population en aval plus immature sont les progéniteurs lymphoïdes-amorcé (PPSP) définis comme CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. MRD suivi par RT-PCR
- Surveille les niveaux MRD par RT-PCR comme décrit plus haut14.
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Representative Results
Nous présentons ici une méthode pour déterminer les populations de souches dans des échantillons de la moelle osseuse humaine normaux et malins. Nous prélevé un PDX réussie de la moelle osseuse et la rate et cytométrie multiparamétriques comme décrit ci-dessus. Nous avons comparé plusieurs sous-populations de cellules blastiques entre le sérum du patient diagnostique et le PDX correspondante et en particulier, le compartiment de CD34 + CD38-géniteur, notamment enrichis en LSC putatif. Nous avons trouvé que la fraction de CD34 + CD38-blast est plus élevée chez les PDX par rapport à l’échantillon du patient diagnostique (3,48 % contre 0,53 %, Figure 2, D). Fait intéressant, nous avons trouvé un pourcentage plus élevé de LSC putatif (affichant un CD34 + CD38-CD90-phénotype CD45RA +) dans le PDX par rapport à l’échantillon primaire du patient (2,76 % contre 0,48 %, Figure 2E, F), ce qui suggère un possible enrichissement du malin cellules souches dans les tissus hématologiques dans ce modèle de souris. La fréquence des fractions de cellules progénitrices normal ne diffère pas entre le PDX et l’échantillon du patient.
En outre, nous avons étudié les populations de souches blast cellulaire basées sur l’expression du CD34, CD38, CD90 et CD45A (comme décrit dans le présent protocole) dans deux différents échantillons de patient, au diagnostic et au suivi de traitement pour déterminer le niveau de MRD. Le premier patient, le CD34 + CD38-fraction (P6) est passée de 0,06 % au moment du diagnostic de 3,33 % au premier suivi de traitement (Figure 3 a, B). En revanche, le CD34 + CD38-fraction (P6) décroît dans le deuxième patient de 7,8 % au moment du diagnostic à 2,27 % après le premier suivi de traitement (Figure 3 C, D). En conséquence, la fraction LSC putative a augmenté le premier patient de 0 % au moment du diagnostic de 0,65 % (Figure 3 a', B') et a baissé dans le deuxième patient de 6,57 % au moment du diagnostic de 1,44 %, suivi de traitement (Figure 3 ', D'). De même, le MRD suivi de marqueurs moléculaires (c.-à-d. les mutation NPM1 [premier patient] et CBFB-MYH11 translocation [second patient]) ont montré que MRD moléculaire diminuer moins le premier patient (0,8 %) par rapport au deuxième patient (0,05 %) pour le premier traitement point de suivi (Figure 3E, G). Enfin, pour valider que putatifs P6 LSC sont malignes, expression de leucémie associé à des antigènes CD123 et CD33 ont été estimées, montrant une expression anormale de CD33 pour deux patients (Figure 3F, G).
Figure 1 : Stratégie de blocage utilisé pour précurseurs physiologiques et AML explosions. Terrain de densité avec blocage des précurseurs physiologiques pour une moelle osseuse normale. (A) Gating de cellules blastiques basé sur phénotype CD45dimSSClow dans toutes les cellules mononuclées. (B) Gating de hematogones (CD38 + CD19 +) pour vérification du CD38 positivité. (C). Gating stratégie de myeloblasts normales, monoblastes et érythroblastes basé sur CD33 et CD36. Les cellules blastiques (D) peuvent être séparés en CD34 + sous-populations ancêtre et à l’aide de l’expression de CD38 en P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) compartiments de la cellule. Gating (E) de hematogones basé sur l’expression CD34 et CD38, vérifiez CD38 positivité. (G) détermination du HSC, MPP, PPSP et sous-populations de LSC putatives à l’aide d’expression du CD90 et CD45RA comme précédemment décrivent9. À noter, aucune détection de LSC car ce n’est un échantillon de moelle osseuse normale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les populations de progéniteurs Blast cellulaire chez un patient en correspondant patient-dérivés-xénogreffe (PDX) par cytométrie multiparamétriques. (A-B) Analyse de chimérisme de PDX. (A) les explosions murins et humaines sont tout d’abord définies par la taille et la structure (FSC, SSC). (B) par la suite, le pourcentage d’humains contre murine CD45 coloration est révélatrice de la charge xenoengraftment et leucémie. Comparaison de CD34 + CD38-blast cellules pourcentage entre diagnostic primaire (C) et (D) PDX AML, exemple. Comparaison de LSC putatif (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) entre AML principal (E) et (F) PDX. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Populations progenitor cell Blast chez deux patients au moment du diagnostic et après le traitement induction rémission pour la détection de la maladie résiduelle (MRD). Analyse d’écoulement par cytométrie en flux de sous-populations de cellules CD34 + CD38-souffle chez deux patients représentatifs (A, C) au diagnostic et (B, D) après traitement d’induction de rémission. Chiffres (A'-D') illustrent respectifs P6 portes contenant LSC putatif pour deux patients au moment du diagnostic et après le traitement initial. Montré dans (E, G) est l’analyse de la maladie résiduelle (MRD) par marqueurs moléculaires utilisés pour ces deux patients sur une période de cinq mois (NPM1 mutation et fusion de gènes CBFß-MYH11, respectivement). (F, G) Expression de leucémie associé à antigènes CD123 et CD33 sur putatif P6 LSC, montrant une expression anormale de CD33 pour deux patients. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une évaluation précise et reproductible de membrane ou de marqueurs cytoplasmiques par cytométrie nécessite que les paramètres de l’instrument sont vérifiés tous les jours pour un alignement optique, bon fonctionnement du systeme fluidique, sensibilité optique et normalisation à l’aide de perles de calibration.
Détection des populations cellulaires blast AML utilisant CD90 et CD45RA par analyse en cytométrie en flux multi paramétrique est une méthode relativement simple et fiable. Une étape cruciale dans la présente analyse est une évaluation exacte de l’expression de CD38 sur les cellules blastiques, afin d’effectuer le blocage correct de la CD34 + CD38-population. CD38 intensité est définie à l’aide de cellules de la moelle osseuse normale spécifiquement sur hematogones et/ou plasmocytes (CD38 +). Intensité d’autres marqueurs est déterminée à l’aide de contrôles de l’isotype.
L’ajout de CD45RA et CD90 est utilisé pour distinguer les HSC de LSC putatif. Le dernier et pas de HSC peut-être la cause de la rechute de la maladie, ainsi ce protocole est d’intérêt pour la maladie résiduelle minimale de surveillance à l’aide de panneaux de cytométrie de flux. Surveillance des AML pendant le traitement est essentielle pour améliorer la stratification du risque et de guider la thérapie AML. Malheureusement, les marqueurs moléculaires appropriées ne sont pas disponibles pour tous les patients. Par conséquent, MRD suivi par cytométrie en flux peut être réalisable dans tous les cas de Lam. Même si cette méthode ne sont peut-être pas exhaustive, car il se focalise sur la majorité des cas d’AML qui ont un progéniteur CD34 + CD38- et une population de LSC putative. À noter, il est possible que le compartiment putatif de la LSC peut comporter des progéniteurs normaux, c'est-à-dire de PPSP). En outre, nous ne pouvons exclure qu’il y a des rares cas avec LSC fonctionnelle ne suit ne pas ce modèle d’expression anormale. À noter, même dans l’AML NPM1 muté qui sont considérés comme CD34 négatives, nous sommes capables de détecter LSC putatif. Par conséquent, malgré l’hétérogénéité et la complexité du compartiment AML LSC, notre méthode peut être utilisée comme un biomarqueur de la réponse de chimiothérapie pendant le suivi de l’AML.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par le Français Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Centre Nord), Fondation de France (Comité de leucémie), SIRIC Oncolille et Français du National Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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