Summary
Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.
Abstract
Leucemia mieloide acuta (AML) è un eterogeneo e se non trattata, la malattia mortale. È la causa più comune di mortalità per leucemia-collegato in adulti. Inizialmente, AML è una malattia delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio di leucemia e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Eterogeneità si estende alla presenza di cellule staminali leucemia (LSC), con questa dinamica cella vano in evoluzione per superare varie pressioni di selezione imposto durante il trattamento e la progressione della leucemia. Per definire ulteriormente la popolazione di LSC, l'aggiunta di CD90 e CD45RA permette la discriminazione di HSCs normali e di progenitori multipotenti all'interno dello scompartimento CD34 + CD38-cella. Qui, descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di diversi markers putativi di LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) su cellule primarie di scoppio di AML umano mediante citometria a flusso multiparametrica. Inoltre, mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti. Questo metodo di rilevazione e quantificazione di putativi LSC può essere utilizzati per il follow-up clinico della risposta di chemioterapia (cioè., malattia residua minima), come residuo LSC può causare la ricaduta AML.
Introduction
Leucemia mieloide acuta (AML) è la più comune causa di mortalità per leucemia-collegato. Inizialmente, AML è una malattia clonale di cellule staminali ematopoietiche (HSC) caratterizzata da arresto di differenziazione, conseguente accumulo delle cellule di scoppio e ha ridotto la produzione di elementi funzionali ematopoietici. Recentemente, clonale eterogeneità della popolazione cellulare blast è stata stabilita essenzialmente utilizzando strategie di sequenziamento (NGS) prossime generazione e mostrando l'esistenza di sviluppo intra-clonale di cellule di tumore1.
Eterogeneità si estende alla presenza di cellule staminali leucemiche (LSC). È supposto che questo comparto dinamico delle cellule si evolve per superare varie pressioni di selezione imposte durante il trattamento e la progressione della leucemia. LSC dovrebbero pertanto essere resistente ai regimi chemioterapeutici correnti e mediare la ricaduta di malattia, con profonde implicazioni clinico2. Vari indicatori sono state descritte per caratterizzare LSC come CD1233, CLL-14, CD975 o6di TIM-3. Il CD34 + CD38-vano delle cellule di scoppio è considerato essere arricchita per LSC7 ma include anche normale HSC. CD90 e CD45RA espressione applicata per il CD34 + CD38-vano (P6) (Figura 1) consente di separare le diverse fasi di precursori emopoietici normali e maligne8. In particolare, CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotenti progenitori normali (MPP) come CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-cellule e CD34 + CD38-CD90-CD45RA + cellule progenitrici multipotenti linfoide-innescato (LMPP) possono essere determinate nella maggior parte di AML casi8 ,9. L'intensità media di fluorescenza (MFI) di CD38 è particolarmente importante da considerare all'interno del compartimento delle cellule CD34 +. Perché CD38 intensità definisce tre compartimenti cellulari nuovi della stessa: CD38 negativo (P6), CD38 dim (P7) e CD38 brillante (P8) (Figura 1). Il MFI di CD38 può essere determinato utilizzando hematogones e/o cellule di plasma come controllo positivo interno come queste cellule esprimono fortemente CD38.
Il modello immunodeficiente del topo NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) è ampiamente usato per engraftment delle normali e maligne umane ematopoietiche cellule10,11. Lo xenotrapianto seriale dosaggi sono utilizzati per convalidare sperimentalmente funzione LSC o HSC. Questi studi sono stati ampiamente analizzati da approcci di sequenziamento su larga scala. Tuttavia, meno è conosciuto circa il immunophenotype LSC e HSC della popolazione di scoppio AML engrafted nei topi NSG rispetto al suo primario AML (Figura 2).
I numeri di LSC sono intrinsecamente bassi così, identificazione e quantificazione di LSC sono impegnativi e il metodo qui descritto può essere utilizzato come un test citofluorimetrico alla diagnosi e alla clinica seguire per valutare la risposta di chemioterapia (come residuo LSC può causare una ricaduta AML). La presenza di LSC può indicare positiva malattia minima residua (MRD). Ad oggi, MRD monitoraggio in AML per lo più si basano su metodi molecolari (cioè, RT-PCR, NGS)10,12. Tuttavia, in questo protocollo rileviamo l'espressione della proteina simultanea di diversi marcatori HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA, CD90) su cellule primarie di scoppio di AML umana da multiparametrico flusso cytometry2,8,9. Questa combinazione di anticorpi può essere applicata in qualsiasi laboratorio di citometria a flusso standard e questo saggio MRD di flusso è particolarmente interessante quando MRD da reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) non è possibile, cioè, se specifico di leucemia molecolare gli indicatori non sono rilevabili nel campione diagnostico AML. Inoltre, questo protocollo, è complementare alle tecniche MRD molecolari più sensibili, come esso mira a individuare e quantificare le cellule progenitrici ematopoietiche anomale che rappresenta una caratteristica funzionale delle cellule (Figura 3).
Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici ematopoietiche e il vano di LSC putativo con diverso grado di maturazione da citometria a flusso con anticorpi disponibili nella maggior parte dei laboratori clinici. Inoltre, abbiamo confermato la presenza di questi compartimenti cellulari nel corrispondenti paziente-derivato-xenotrapianti (PDX) e al trattamento di follow-up.
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Protocol
Seguiamo gli standard europei per l'uso di animali per scopi scientifici. Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (n. 3097-2015120414583482v3).
1. preparazione del campione
- Raccogliere midollo osseo (2 mL) da de novo AML in provette contenenti l'acido etilendiamminotetracetico dell'anticoagulante (EDTA) ad una concentrazione di 1,8 mg / mL di midollo osseo.
- Eseguire Ficoll separazione, una separazione di gradienti di densità per isolare le cellule mononucleari da globuli rossi e granulociti, come seguito. Diluire il midollo osseo in 3 volumi di soluzione salina tampone fosfato (PBS: 137mm NaCl, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM). Attentamente sovrapposizione 1 volume di Ficoll con 1 volume di diluito del midollo osseo. Rotazione di 30 minuti a 300 x g senza freno. Trasferire lo strato bianco del cappotto buffy di cellule mononucleate in una nuova provetta sterile.
- Lavare le cellule due volte in 10 mL di PBS) e centrifugare a 300 x g per 5 min, al fine di rimuovere contaminanti componenti del siero.
2. lisi dei globuli rossi (RBC)
- Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (cloruro di ammonio 0,8%) alla cella a pellet, vortice delicatamente ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
Nota: se necessario, ripetere questo passaggio. - Celle di lavaggio in PBS come precedentemente descritto (1.3.).
3. paziente derivato xenotrapianti.
- Ottenere le cellule di scoppio dal midollo osseo dopo la separazione Ficoll e dopo lo svuotamento di linfociti utilizzando immunomagnetica negativa selezione (CD3 per T- e CD20 per B-linfociti). Seguire le istruzioni del produttore.
- Iniettare le cellule di scoppio di 5 x 106 AML nella vena caudale dei topi NSG incondizionati. Utilizzare un dispositivo trattenente per facilitare l'iniezione della vena della coda. Tenere topi in condizioni convenzionali e soprattutto nelle circostanze specifiche-patogeno-senza affatto volte, utilizzando gabbie individuali ventilate e da manipolazione sotto cappa a flusso laminare. Ogni due settimane, prendere 60 µ l di sangue con il metodo di raccolta sottomandibolare utilizza un ematocrito capillare. Posto il capillare in un 5 mL fondo tubo tondo. Arrestare l'emorragia applicando leggera pressione utilizzando un tampone di garza sterile piccola. Expulse sangue con una siringa pulita.
- Aggiungere 1ml di tampone di lisi e incubare per 5min. Poi Centrifugare a 300 x g per 5 min. lavaggio con PBS e centrifugre a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante, aggiungere 100 µ l PBS con 10% albumina di siero bovino (BSA) macchia con 3 µ l anti-CD45-FITC e anti-murino 1 µ l CD45-APC e incubare per 30 minuti a 4 ° C.
- Lavare il pellet cellulare due volte in PBS (2 mL) con 10% BSA e centrifugare a 300 x g per 5 min.
- Aliquota fino a 1 x 106 cellule per 100 µ l di PBS in tubi di citometria a flusso.
- Indagine engraftment ogni due settimane da analisi di chimerism di espressione di CD45 (umano e murino) mediante citometria a flusso (Figura 2A e B).
- A sacrifice (conteggio periferico esplosione superiore al 70% o gravi segni clinici di malattia), raccogliere le cellule mononucleari di scoppio dalle milze schiacciate e dal midollo osseo irrigando tibie e femori con PBS come precedentemente descritto13. Eutanasia topi di dislocazione cervicale seguendo linee guida internazionali.
- Se il pellet cellulare contiene RBC, eseguire la lisi dei globuli rossi con buffer di lisi (punto 2.1).
- Lavare le cellule pallina due volte in PBS (2 mL) con 10% BSA e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
- Raccogliere le cellule e aliquota fino a 1 x 106 cellule per 100 µ l di PBS in tubi di citometria a flusso.
4. colorazione
- Aggiungere vortice e anticorpi coniugati (cfr. punto 4.2). Incubare le cellule per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
- Utilizzare il seguente pannello per umano primario o campioni PDX composto da 10 µ l di anti-CD36-FITC, 5 µ l di anti-CD19-ECD, 5 µ l di anti-CD33-PC5.5, 5 µ l di anti-CD90-APC, 5 µ l di anti-CD34-AA700, 5 µ l di anti-CD45RA-APC-H7, 5 µ l di anti-CD38-Pacific Blue, 5 µ l di anti-CD123-PC7 e 2,5 µ l di anti-CD45-KO.
- Rimuovere gli anticorpi non legati lavando le cellule in 2 mL di PBS mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min.
- Risospendere le cellule in 450 µ l di PBS per l'analisi cytometric di flusso finale.
5. strategia per analisi di citometria a flusso di gating
- Effettuare l'acquisizione di dati (almeno 500.000 cellule) su un citometro a flusso dotato di laser rossi, blu e violetto. Verificare le impostazioni citometro ogni giorno per allineamento 1) ottico, sistema 2) fluidico, sensibilità 3) ottico e 4) standardizzazione utilizzando fluorosfere
- Seguire la strategia di gating sequenza per definire l'espressione di CD38 (Figura 1).
- Utilizzare le celle da campioni di midollo osseo normale per definire hematogones o cellule di plasma che servirà come controllo positivo per l'espressione di CD38.
Nota: questa porta è particolarmente importante per valutare come popolazioni di LSC putativi successive dipendono dalla sua definizione. - Definire le cellule precursori fisiologici (normali cellule di scoppio) di criteri di CD45dim/SSC (dispersione laterale) popolazione bassa (Figura 1A). All'interno di questa popolazione di scoppio, definire hematogones, che mostrano un CD38 + + CD19 + fenotipo (Figura 1B) e infine, utilizzare l'espressione CD36 e CD33 per definire i myeloblasts, monoblasts ed eritroblasti (Figura 1). Determinare l'espressione CD34 sui hematogones come mostrato in (Figura 1E). Valutare diverse sottopopolazioni di precursori all'interno delle cellule di scoppio definite come P6-P10 (Figura 1). Separare l'alloggiamento di CD34 delle cellule di scoppio nel P6, P7, P8 sottopopolazioni di cellule progenitrici basate su preset CD38 cancelli. Accertarsi che il vano P8 contiene le esplosioni che hanno la stessa intensità CD38 hematogones, che P6 include celle che sono basati su CD38 sulla fluorescenza CD38 meno un controllo (FMO) e che le cellule P7 sono tra i due estremi per quanto riguarda CD38 espressione (Figura 1).
- Utilizzare le celle da campioni di midollo osseo normale per definire hematogones o cellule di plasma che servirà come controllo positivo per l'espressione di CD38.
- Dal CD34 + 38-(P6) cellule gated, separare HSC da presunti LSC utilizzando espressione CD90 e CD45RA (Figura 1F).
Nota: il fenotipo HSC è CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- e i progenitori multipotenti (MPP) sono definiti come CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Il fenotipo LSC putativo è CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + e la popolazione a valle più immatura sono i progenitori linfoidi-innescato (LMPP), definiti come CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.
6. MRD monitoraggio mediante RT-PCR
- Monitorare i livelli di MRD mediante RT-PCR come descritto in precedenza14.
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Representative Results
Qui presentiamo un metodo per determinare le popolazioni di cellule progenitrici in campioni normali e maligne del midollo osseo umano. Abbiamo raccolto della milza e del midollo osseo da un successo PDX ed eseguita la citometria a flusso multiparametrica come descritto sopra. Abbiamo confrontato diverse sottopopolazioni delle cellule di scoppio tra il campione diagnostico del paziente e il corrispondente PDX e particolarmente, il vano di CD34 + CD38-progenitore, in particolare arricchite nel presunto LSC. Abbiamo trovato che la frazione di CD34 + CD38-blast era superiore in PDX rispetto al campione diagnostico (3,48% vs 0,53%, Figura 2, D). Interessante, abbiamo trovato una percentuale più elevata di putativi LSC (visualizzazione un CD34 + CD38-CD90-fenotipo CD45RA +) in PDX rispetto al campione primario (2,76% vs 0,48%, Figura 2E, F), suggerendo un possibile arricchimento del maligno cellule progenitrici in tessuti ematologiche in questo modello del topo. La frequenza delle frazioni delle cellule progenitrici normale non hanno differito fra il PDX e campione del paziente.
Inoltre, abbiamo studiato le popolazioni di cellule progenitrici delle cellule blast basate sull'espressione di CD34, CD38, CD90 e CD45A (come descritto in questo protocollo) in due diversi campioni pazienti, alla diagnosi ed al follow-up di trattamento per determinare il livello di MRD. Nel primo paziente, il CD34 + CD38-frazione (P6) è aumentato da 0,06% alla diagnosi a 3,33% al follow up primo di trattamento (Figura 3A, B). In contrasto, il CD34 + CD38-frazione (P6) è diminuito nel secondo paziente dal 7,8% al momento della diagnosi al 2,27% a primo seguito trattamento (Figura 3 C, D). Di conseguenza, la frazione LSC putativa aumentato nel primo paziente da 0% al momento della diagnosi a 0,65% (Figura 3A', B') ed è diminuito nel secondo paziente da 6,57% alla diagnosi a 1,44% a seguito di trattamento (Figura 3 ', D'). Allo stesso modo, MRD monitoraggio mediante marcatori molecolari (cioè, mutazione di NPM1 [primo paziente] e CBFB-MYH11 traslocazione [secondo paziente]) ha mostrato che molecolare MRD diminuzione meno nel primo paziente (0,8 per cento) rispetto al secondo paziente (0,05%) per il primo trattamento punto di follow-up (Figura 3E, G). Infine, per convalidare che il presunto P6 LSC sono maligni, espressione della leucemia associata antigeni CD123 e CD33 sono stati stimati, mostrando l'espressione anormale di CD33 per entrambi i pazienti (Figura 3F, G).
Figura 1 : Strategia di gating utilizzato per precursori fisiologici e AML blasti. Densità di trama con gating dei precursori fisiologici mostrati per un midollo osseo normale. (A) Gating delle cellule di scoppio basata CD45dimSSClow fenotipo su tutte le cellule mononucleate. (B) Gating dei hematogones (CD38 + CD19 +) per la verifica di CD38 positività. (C). Gating strategia di myeloblasts normale, monoblasts ed eritroblasti basato su CD33 e CD36. Le cellule di scoppio (D) possono essere separati in sottopopolazioni di cellule progenitrici CD34 + e utilizzando l'espressione di CD38 in P6 (CD34 + CD38-), P7 (CD34 + CD38dim), P8 (CD34 + CD38 +) scomparti di cella. (E) Gating dei hematogones basato sull'espressione di CD34 e CD38, verificare CD38 positività. (G) determinazione di HSC, MPP, LMPP e presunte sottopopolazioni di LSC utilizzando espressioni di CD90 e CD45RA come precedentemente descritto9. Di nota, nessun rilevamento di LSC come questo è un campione di midollo osseo normale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Popolazioni di cellule progenitrici delle cellule Blast in un paziente e nel corrispondente paziente-derivato-dello xenotrapianto (PDX) mediante citometria a flusso multiparametrica. (A-B) Analisi di chimerism di PDX. (A) Murine ed umane blasti vengono innanzitutto definiti dalle dimensioni e struttura (FSC, SSC). (B) successivamente, la percentuale di umani contro murino CD45 macchiatura è indicativa dell'onere xenoengraftment e leucemia. Confronto di CD34 + CD38-blast cellule percentuale tra diagnostica primaria (C) e (D) PDX AML campione. Confronto di putativi LSC (CD34 + CD38-CD90-CD45RA +) fra AML primario (E) e (F) PDX. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Popolazioni di cellule progenitrici delle cellule Blast in due pazienti alla diagnosi e dopo terapia di induzione di remissione per il rilevamento di malattia minima residua (MRD). Flusso cytometric analisi delle sottopopolazioni di cellule CD34 + CD38-esplosione in due pazienti rappresentativi (A, C) alla diagnosi ed (B, D) dopo terapia di induzione di remissione. Figure (A'-D') illustrare rispettivi cancelli P6 contenente putativo LSC per due pazienti alla diagnosi e dopo il trattamento iniziale. Mostrato in (E, G) è l'analisi di malattia minima residua (MRD) di marcatori molecolari utilizzati per questi due pazienti per un periodo di cinque mesi (NPM1 mutazione e fusione del gene CBFß-MYH11, rispettivamente). (F, G) Espressione della leucemia associata antigeni CD123 e CD33 su presunti P6 LSC, mostrando l'espressione anormale di CD33 per entrambi i pazienti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Una valutazione accurata e riproducibile di membrana o marcatori citoplasmatici mediante citometria a flusso è necessario che le impostazioni dello strumento vengono verificate ogni giorno per allineamento ottico, corretto funzionamento del sistema fluidico, sensibilità ottica e standardizzazione usando le perle di calibrazione.
Rilevazione di popolazioni di cellule di scoppio in AML con CD90 e CD45RA attraverso l'analisi di citometria a flusso multiparametrica è un metodo relativamente semplice e affidabile. Un passo fondamentale in questa analisi è un'accurata valutazione dell'espressione di CD38 su cellule di scoppio, al fine di eseguire il corretto gating di CD34 + CD38-popolazione. Intensità di CD38 è definito utilizzando cellule normali del midollo osseo in particolare hematogones e/o le cellule di plasma (CD38 +). Intensità di altri marcatori viene determinato utilizzando controlli di isotipo.
L'aggiunta di CD45RA e CD90 è usato per distinguere HSC da LSC putativo. Il quest'ultimo e non HSC forse la causa della ricaduta di malattia, quindi questo protocollo è di interesse per la malattia residua minima monitoraggio utilizzando pannelli di citometria a flusso. Controllo della leucemia mieloide acuta durante il trattamento è essenziale per migliorare la stratificazione del rischio e per guidare la terapia AML. Purtroppo, marcatori molecolari appropriati non sono disponibili per tutti i pazienti. Di conseguenza, MRD monitoraggio mediante citometria a flusso può essere fattibile per tutti i casi AML. Anche se questo metodo non può essere esauriente come focalizza sulla maggior parte dei casi AML che hanno un CD34 + CD38-progenitore e una popolazione di LSC putativa. Di nota, è possibile che il presunto vano LSC può includere progenitori normali, cioè, LMPP). Inoltre, non possiamo escludere che ci sono casi rari con LSC funzionale non seguendo questo pattern di espressione anormale. Di nota, anche in AML NPM1 mutato che sono considerati CD34 negativi, siamo in grado di rilevare putativo LSC. Pertanto, nonostante l'eterogeneità e la complessità del vano AML LSC, il nostro metodo può essere utilizzato come biomarcatore della risposta di chemioterapia durante il follow-up di AML.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte il francese Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (centro nord), Fondation de France (Comitato di leucemia), Oncolille SIRIC e francese National Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
References
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