Summary
Imaging retinale væv kan give én celle oplysninger, der ikke kan blive indsamlet fra traditionelle biokemiske metoder. Denne protokol beskriver forberedelse af retinale skiver fra zebrafisk for Konfokal billeddannelse. Fluorescerende kodet genetisk sensorer eller indikator farvestoffer tillade visualisering af mange biologiske processer i forskellige retinal celletyper.
Abstract
Nethinden er et komplekst væv, der initierer og integrerer de første skridt af vision. Dysfunktion af retinale celler er kendetegnende for mange blændende sygdomme, og fremtidige behandlinger hængsel på grundlæggende forståelser om hvordan forskellige retinal celler fungerer normalt. Vinder sådanne oplysninger med biokemiske metoder har vist sig vanskeligt fordi bidrag af bestemte celletyper er formindsket i de retinale celle milieu. Live retinal imaging kan give en opfattelse af mange biologiske processer på en subcellulært niveau, takket være et stigende antal genetisk kodet fluorescerende biosensorer. Denne teknik har imidlertid hidtil været begrænset til haletudser og zebrafisk larver, de yderste retinal lag af isolerede nethinder eller lavere opløsning billeder af nethinder med levende dyr. Her vil vi præsentere en metode til at generere levende ex vivo retinal skiver fra voksen zebrafisk for live imaging via Konfokal mikroskopi. Denne forberedelse udbytter tværgående skiver med alle retinal lag og de fleste celletyper synlig for at udføre Konfokal imaging eksperimenter ved hjælp af perfusion. Transgene zebrafisk udtrykker fluorescerende proteiner eller biosensorer i specifikke retinal celletyper eller organeller der bruges til at udtrække encellede oplysninger fra en intakt nethinden. Derudover kan retinal skiver indlæses med fluorescerende indikator farvestoffer, tilføjer til den metode alsidighed. Denne protokol blev udviklet for imaging Ca2 + inden for zebrafisk kegle fotoreceptorer, men med ordentlig markører det kunne tilpasses for at måle Ca2 + eller metabolitter i Müller celler, bipolar og horisontale celler, mikroglia, amacrine celler eller retinal ganglion celler. Den retinale pigment epitel fjernes fra skiver, så denne metode ikke er egnet til at studere denne celletype. Med praksis er det muligt at generere serielle skiver fra ét dyr til flere forsøg. Denne fleksible teknik giver et stærkt værktøj for at besvare mange spørgsmål om retinal cellebiologi, Ca2 +og energi homøostase.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er blevet meget udbredt i medicinske og grundlæggende videnskabelige forskning1, på grund af sin lille størrelse, hurtig udvikling og hvirveldyr organsystemer. Den naturlige gennemsigtighed af zebrafisk larver kombineret med etablerede metoder til transgenese har aktiveret detaljeret visualisering af cellulære processer i et levende dyr. Et antal genetisk kodet fluorescerende biosensorer har været målrettet mod specifikke zebrafisk celler til registrering af Ca2 + 2, hydrogenperoxid3, apoptotiske aktivering4 og ATP5.
In vivo billeddannelse af zebrafisk larver har ført til gennembrud inden for neuroscience, herunder kortlægning af hjernen kredsløb6 og udvikling af lægemidler til centralnervesystemet lidelser7. Zebrafisk er velegnet til vision forskning, fordi deres nethinder funktionen laminar struktur og neuron typer af højere hvirveldyr, og de viser robust visuelle adfærd8,9. Flere typer af retinale degenerations svarer til menneskers sygdom har været modelleret med succes og studerede i zebrafisk10,11, herunder levende billeddannelse af enkelte fotoreceptorer udarter i en nethinden2, 12.
Mens i vivo larve zebrafisk imaging er et værdifuldt redskab, bliver det mere udfordrende som fisk vokse og udvikle pigmentering, og nogle farmakologiske behandlinger ikke gennemsyre hele dyr. Yderligere, ændre visse cellulære processer med udvikling og alder, gør senere tidspunkt punkter kritisk forståelse funktion og progression af sygdommen hos voksne dyr. Biokemiske metoder såsom immunblot, maksimale PCR, O2 forbrug og metabolomic analyser kan give et vigtigt fingerpeg om biologi af nethinden som helhed, men det er vanskeligt at skelne bidrag af enkelte celletyper påvirket af sygdom. Imaging isolerede retinale væv ex vivo omgår disse spørgsmål, og mens imaging flad monteret nethinder giver et overblik over de ydre retina13, dybere indre retinal funktioner er skjult. Tværgående retinal skiver, såsom dem, der præsenteres i fast immunhistokemiske analyser, aktiverer et klart overblik over alle lag og celletyper men kun tilbyde et enkelt snapshot af de dynamiske processer i normal funktion og sygdom.
Vi præsenterer her, en metode til at generere ex vivo tværgående retinal skiver fra voksen zebrafisk for billeddannelse. Det er svarer til metoder for at forberede elektrofysiologiske og morfologiske undersøgelser14,15, med vigtige ændringer for tid bortfalder imaging ex vivo bruger Konfokal padder og zebrafisk retinal skiver mikroskopi. Fluorescens svar af biosensorer eller farvestoffer i skiver overvåges i realtid med en Konfokal mikroskop samtidigt med at levere farmakologiske midler ved hjælp af perfusion. Metoden blev udviklet for imaging fotoreceptorer, kan det være muligt at bruge det til at visualisere Müller celler, bipolar celler, vandrette celler, amacrine celler eller retinal ganglion celler med passende fluorescerende markører. Derudover kan skiver indlæses med fluorescerende celle-gennemtrængelige farvestoffer til betænkningen cellernes levedygtighed, vesikulær transport, mitokondrie-funktion eller redox tilstand. Denne alsidige forberedelse giver mulighed for visualisering af en bred vifte af subcellulært processer i hele nethinden, herunder Ca2 + dynamics, signaltransduktion og metabolisk tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt ved University of Washington institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. forberedelse af dyr og udstyr
Bemærk: Den retinale pigment epitel (ÅV) er en mørk plader af vævet omkring ydersiden af nethinden hvis pigmentering kan overskygge retinal funktioner og skade væv når Konfokal imaging ex vivo. I mørket, ÅV af zebrafisk er trukket tilbage fra nethinden; mørke tilpasse fisk til at lette fremtidige fjernelse af ÅV fra nethinden før udskæring og billedbehandling.
- Overføre fisk til en gydende tank fyldt med fiskevand, og derefter wrap de gydende tank med mørk stof eller placere den i et mørkt skab.
- Mørke tilpasse zebrafisk i mindst 1 time før eutanasi tillade nær komplet adskillelse af ÅV fra nethinden. 30 min mørke tilpasning er tilstrækkelige til at fjerne de fleste ÅV, selvom dele af det kan forblive indtrængere mellem fotoreceptorer.
- Smelte ~ 15 mL af råolie gelé i et 50 mL bægerglas på en varm tallerken og derefter trække 3 mL af væsken i en 3-mL slip tip sprøjte. Invertere sprøjte, sted i et reagensglas rack, og tillade vaseline til at afkøle.
- Foretage en genanvendelig udskæring kammer på et almindeligt 7 cm X 2,5 cm objektglas.
- Ved hjælp af klare neglelak, maling smalle linjer til at oprette en 3 cm X 2,5 cm rektanglet i midten af diaset, lad det tørre og derefter tilføje endnu et lag neglelak til linjerne.
- Forberede imaging stiger på dæksel glider til at holde skiver under imaging. Skiver udgør "trin" af stigen.
- For statiske imaging eller injektion eksperimenter med minimal løsning flow, gøre Vaselin stiger bestående af to flad bred parallelle strimler af vaseline på 18 mm firkantede glas dækning underkjoler. Brug sprøjten til at anvende to fladtrykt ~ 1 cm lang udstrygningspræparater afkølede vaseline 0,5 cm fra hinanden på cover slip.
- Klar væv slicer.
- Rense en dobbelt kant barberblad med ethanol og lade det luft tørre. Skær det i kvarte med saks, først på langs i to halvdele og derefter på tværs af hver vinge.
- Placere udskæring salen på scenen af væv pålægsmaskine, centrere det vandret på scenen og markere en lang kant med permanent markør til tilpasning.
- Indlæse en klinge sektion på væv slicer arm, sikre, at vingen ligger fladt og centreret på diaset uden at røre neglelak, så forsigtigt stramme apparatet blade. Lavere blade arm ved at justere knop ¼ tænder, derefter sted en skrot af filterpapir i midten af den billeddiagnostiske afdeling og test skære det. Hvis papiret ikke er skære fuldt igennem, remount klingen.
- Ved hjælp af sprøjten, placerer en enkelt lille dot afkølede vaseline i en 10-cm petriskål ~ 1,5 cm til højre for midten. Tryk på en billeddannelse stige ind i det ved hjælp af pincet med vaseline opad. Gøre en anden lille vaseline dot ~ 1 cm fra fjorden kanten af den billeddiagnostiske afdeling.
- Passer Vaselin sprøjte med en 20g kanyle og tag hætten det. Hold nålen på sprøjten og bruge det til at gøre to 1 cm lange tynde parallelle strimler af vaseline på langs i midten af den udskæring kammer. Space strimler ~ 1 cm fra hinanden.
- Gøre en genbrugelig wire øje loop værktøj af indpakning i midten af en ~ 4 cm segment af 30 g wolfram tråd omkring et par lukkede pincet én gang stramt. Justere diameter af løkken ved at skubbe wire op eller ned pincet, indtil det er lidt større end en zebrafisk øje, typisk ~ 2-3 mm. Twist wire-enderne og sikre dem til slutningen af en 6-cm træ stick ved hjælp af laboratoriet tape.
- Forberede Ringers løsning.
- Tø 50 X supplement stamopløsning (tabel 1) og tilføje det frisk til HEPES-buffer, ikke-bikarbonat Ringers løsning (tabel 2) om morgenen af eksperimentet; fortynde 200 µL af supplement stamopløsning i hver 10 mL Ringers løsning i et konisk centrifugeglas eller sterilt glasflaske. For statiske imaging eksperimenter, forberede mindst 30 mL Ringers løsning pr. eksperiment. Mængden af Ringers løsning nødvendig for perfusion eksperimenter vil afhænge af strømningshastigheden og samlede eksperiment tid.
- Check at pH i opløsningen suppleret 7.4 ved hjælp af en digital pH-sonde eller pH papir, og justere i overensstemmelse hermed med fortyndet NaOH eller HCl.
- Oxygenat suppleret Ringers løsning på is af bobler med 100% ilt gas i mindst 5 min. ved hjælp af en standard medicinsk ilt tank og regulator forsynet med en slange, eller valgfri gas Bobleflasken manifold bruges til perfusion. Butik iltet Ringers løsning på is i en forseglet konisk centrifugeglas eller sterilt glasflaske nær dissektion mikroskop; Brug denne løsning for dissektion, billedbehandling, og til at fortynde farvestoffer eller farmakologiske midler.
- Hvis andre løsninger anvendes i forsøget, som Na+-gratis Ringers løsning (tabel 3), Gentag trin 1.9.1.-1.9.3.
- Saml petriskåle, pincet, mikro-saks og andre værktøjer i nærheden af dissektion mikroskop, og forberede en fisk vand-is bad for zebrafisk eutanasi.
2. udarbejdelsen af retinale skiver (Se figur 1)
- Arbejder under røde omgivende lys til at minimere lys tilpasning (som kan gøre ÅV stick mere stramt på nethinden), aflive zebrafisk ved nedsænkning i iskarret indtil touch svar er tabt, typisk 1-2 min. overføre fisk til en petriskål og bruger en skalpel til cervically splitte men ikke Hug hovedet af fisken.
- Brug wire loop til at løsne bindevæv omkring det ene øje, og derefter trække øjet frem forsigtigt med sløjfen i den ene hånd. Ved hjælp af mikro-saks i anden hånden, skære den hvide synsnerven under øjet, pas på ikke for at skære på bagsiden af øjet.
- Overføre øjet ved hjælp af pincet til en petriskål af kolde Ringers løsning på isen, og Gentag for det andet øje. Holde øjne i mørket eller under rødt lys, indtil ÅV er fjernet fra nethinden.
- Dissekere øjestykker under et lavt strømforbrug dissektion mikroskop i en dråbe af kolde Ringers løsning på et almindeligt glas dias i en petriskål.
- Gennembore hornhinden med fine pincet, derefter forsigtigt fjerne brikker Clear, sprødt hornhinden og sølvfarvede sclera med pincet eller saks. Fjern og kassér linsen og de fleste af sclera (Se figur 1A), og håndtere den isolerede øjestykket minimalt.
- Fedtstykker, små bidder af sclera, og sort ÅV kan forbliver knyttet til øjestykket og fjernet fra nethinden senere. Hvis nethinden adskiller fra ÅV taktfast 2.4.1, fortsætte med de samme trin ved hjælp af ekstra forsigtig ikke for at beskadige den sarte isolerede nethinden.
- Placer øjestykket åbne side ned (ÅV op) på diaset, og skåret i tredjedele eller kvartaler med en frisk enkelt kant barberblad i én bevægelse (Se figur 1B). Kassér stykker af væv, der er stærkt buet.
- Flad mount nethinden på filtrerpapir.
- Våd et stykke filtrerpapir med Ringers løsning og placere den på diaset ved siden af øjestykket stykker. Bruge flad pincet når du håndterer den intakte våde filtrerpapir for at undgå punktering det. Tilføje kolde Ringers løsning til at dække både filtrerpapir og væv.
- Bruge pincet i hver hånd, forsigtigt trække filtrerpapir nedenunder hver øjestykket stykke med ÅV og fotoreceptorer vender opad, dvs med bagsiden af øjet vender opad. Placer øjestykket stykker i en enkelt linje langs midten af filtrerpapir (Se figur 1 c). Håndtere øjestykket stykker forsigtigt med fine pincet kun nær en kant eller hjørne.
- For at hjælpe nethinder tiltræde filtrerpapir, placere den våde filtrerpapir på en tør køkkenrulle for 3 s at væge fugt nedad, men ikke Lad vævet blive tør. Gentag indtil øjestykket stykker ligger fladt på filtrerpapir. Anvende blide suge på undersiden af filtrerpapir hjælper flade nethinden, men dette trin er ikke afgørende.
- Sorte plader af ÅV forbliver i øjestykket stykker, brug bøde tang til at forsigtigt skræl det væk med udgangspunkt i et hjørne (Se figur 1 d) mens væv, der sidder i en dråbe af Ringers løsning. Nethinden bør lift off filtrerpapir, Gentag trinnet fugtspredende i 2.5.3. Nethinden kan forekomme pink på grund af ubleget visuelle pigmenter.
- Gentag nethinden dissektion, flad montering trin i 2,4-2,6 til det andet øje, hvis det ønskes, at holde den første fast monterede nethinden nedsænket i koldt Ringers løsning. For at strømline proceduren for udskæring, kan stykker af begge nethinder placeres på et filtrerpapir. Når ÅV er blevet fjernet, kan protokollen foretages under normale værelse lys medmindre eksperimenter nødvendiggøre mørket.
- Placer filtrerpapir på et dias og trimme det i et rektangel med en enkelt kant barberblad, forlader ~ 0,5 cm filtrerpapir på hver side af linjen af nethinder. Flytte filter papir til rede udskæring kammer, skubbe lange filtrerpapir kanter i de tynde Vaselin linjerne ved hjælp af pincet og fordybe nethinder i 3-4 dråber af kolde Ringers løsning.
Bemærk: Nogle farvestoffer, såsom lipofile farvestoffer, er bedst indlæses i flade mounts på dette tidspunkt før udskæring. Disse kan indlæses, onde væk med en serviet og vaskes i salen, udskæring. For eksempel, C12 558/568 BODIPY intenst pletter retinal celle membraner og fotoreceptor ydre segmenter (Se figur 4A) når lastet på ~ 5 µg/mL i 15 min. ved stuetemperatur (typisk 23-27 ° C), efterfulgt af en vask i overskydende Ringers løsning . - Overføre udskæring kammeret til væv slicer fase, placere den lange kant langs den markerede linje og sikre salen slutter scenen med laboratoriet tape. Starter i den ene ende, klip nethinden og filter papir ved hjælp af faste, blide pres på den udskæring arm. Kontroller, at den første skive var skåret fuldt, derefter bruge en mikrometer for at skære ~ 400 µm skiver.
- Samle imaging stigen.
- Sted den udskæring kammer med skiveskåret retinal sektioner i petriskålen fra trin 1.7 støder op til imaging stigen (Se figur 1E). Fyld fadet med kolde Ringers løsning at dykke dens indhold.
- Brug af pincet og holde skiver neddykket, forsigtigt overføre strimler af filtrerpapir og nethinden til stigen ved at skubbe petriskålen fra venstre til højre. Passe på ikke for at røre nethinder direkte. Rotere udsnittene 90° og begrave filtrerpapir kanter i vaseline.
- Fint Placer retinal skiver i stigen med pincet så retinal lag er klart synlige mikroskopet dissektion (Se figur 1 g). Skiver på hver ende af stigen, sikre at vævet vender indad mod andre skiver at minimere bevægelse af væv under injektion eller flow. Kassér eventuelle retinal udsnit, der ikke er godt levet op til filtrerpapir (Se figur 2A).
- Hvis det ønskes, indlæse farvestoffer i retinal skiver på dette stadium og vask i overskydende Ringers løsning før billeddannelse.
Bemærk: Propidium Iodid (PI) og Hoechst 33342 håndfast pletten kerner af døde og alle celler, henholdsvis (Se figur 2B), når inkuberes med retinal skiver på 5 µg/mL i 20 min. ved stuetemperatur. Tetramethylrhodamine (TMRM) ophobes i aktivt respiring mitokondrier i hele nethinden når inkuberes ved 1 nM i 30 min. ved stuetemperatur. - Mens skiver farvning, forberede billeddiagnostiske afdeling og injektion apparatet. Bruge sprøjten til at skylle slanger med Ringers løsning og rense bobler, tillægger den billeddiagnostiske afdeling indløb den åbne ende af slangen og lukke hanen. Fjern sprøjten og fyld den med reagensproduktets til injektion og derefter vedhæfte det til slangen.
- Bruge pincet til at overføre coverslip med retinal skiver billeddiagnostiske afdeling, presning af coverslip til dot vaseline nær fjorden kanten af den billeddiagnostiske afdeling (Se figur 1 H). Fyld den billeddiagnostiske afdeling med Ringers løsning til at dække skiver.
3. imaging retinal skiver
- Placer fyldt imaging salen med apparatet tilsluttede injektion på scenen i en opretstående Konfokal mikroskop udstyret med en 20 eller 40 X vand dypning linse. Sikre imaging salen med fase klip.
- Lavere dypper linsen over stigen, og fokusere på en skive i den ene ende af stigen under svagt trans-belyste lys. Undersøge hver skive for tværgående orientering, tilstedeværelsen af fotoreceptor ydre segmenter og sikker vedhæftning til filtrerpapir.
- Vælg den bedste bid for gang lapse imaging og konfigurere mikroskop software for gang lapse billede erhvervelse. Tabel 4 beskrives typiske indstillinger for forskellige fluorescerende markører og farvestoffer.
Bemærk: Sats på billede erhvervelse vil variere afhængigt af mikroskop, fluorescerende marker(s) og biologisk proces undersøges. For eksempel bruge 800 x 800 pixel opløsning, 2 µs/pixel scanning hastighed og en 10-s billedhastighed for imaging calcium dynamics i fotoreceptorer med GCaMP3 og et rødt farvestof.- Hvis den er tilgængelig, skal du bruge softwaren til at spore fysiske vartegn i Skive (fotoreceptor ydre segmenter, cell organer, kerner) at støtte potentielle omlægning i løbet af tid, bortfalder. Også indstille software til at overvåge real-time fluorescens i hele udsnittet.
- Begynde imaging og overvåge baseline fluorescens. Når fluorescens i hele udsnittet stabiliserer (typisk inden for 2-5 min), fortsætte med eksperimentet. Til injektion, åbne sprøjten stophane, derefter langsomt trykkes og trække tilbage i stemplet to gange for at støtte blanding.
Bemærk: For eksempel, afskaffe mitokondrie funktion ved at indsprøjte en koncentreret opløsning af protonophore CCCP at nå frem til en endelig koncentration på 1 µM i den billeddiagnostiske afdeling. Dette fremkalder en robust Ca2 + brast i fotoreceptor cytosol rapporteret af GCaMP, så et støt fald i mitokondrielle membran potentiale rapporteret af TMRM. - Nøje overvåge skiver for afdrift under eksperimentet, og bruge softwaren til at foretage mikro-justeringer efter fysiske lokaliteter. Typisk glider i Z-retning under injektion eller perfusion er < 5 µm.
4. imaging retinal skiver under perfusion eksperimenter hvor løsninger er ændret eller flød løbende
Bemærk: Imaging retinal skiver under perfusion eksperimenter hvor løsninger er ændret eller flød kontinuerligt er lignende setup til statisk afbildning eller injektion forsøg, med følgende ændringer.
- I stedet for Vaselin stiger beskrevet taktfast 1.4, bruge mere robuste voks stiger til holde nethinde skiver støt under løsning flow.
- Placer to små parallel cylindre unflavored dental voks ~ 0,5 cm fra hinanden på en coverslip. På en flad overflade, skal du bruge en tommelfinger til at trykke på hver cylinder ned og ud mod parallelle kanten af coverslip. Score begge fladtrykte cylindre vandret med en #1 coverslip (Se figur 1E, højre side) derefter smøre et tyndt lag vaseline mellem wax strips med en spatel.
- Ved montering af imaging stigen i trin 2.10.2, Tryk snittede filtrerpapir kanter i voks noder ved hjælp af fine pincet (figur 1 g).
- Du kan angive til perfusion i trin 2.12, fylde sprøjten reservoirer med preoxygenated løsninger, eller brug valgfri gas manifold for at oxygenat løsninger i hver reservoir. Skyl alle slanger med Ringers løsning, sikre alle linjer flyde når åbnet og rense store bobler.
- Før påfyldning den billeddiagnostiske afdeling i trin 2.13, skal du bruge sprøjten til at placere en anden dot vaseline over hvert udsatte hjørne af coverslip til at forhindre det i at glide sideværts under flow.
- Når den billeddiagnostiske kammer er fyldt og monteret på stadiet mikroskop, tænde indsugningsventil og forbinde indsugningsventil slangen. Teste strømmen af Ringers løsning og bruge micropositioner til at placere indsugningsventil røret over udstrømning kammeret, således at små mængder af flydende trækkes før kammeret overløb (typisk ~ 1 mm over løsning overfladen for en 2 mL/min. strømningshastighed). Holde Ringers løsning flyder mens du vælger skiver i trin 3.4.
- For at foretage eksperiment i trin 3.4 for perfusion, omdirigere strømmen af løsninger ved at lukke hanen af den første løsning under åbning af den anden løsning.
- For eksempel for at nedbryder ekstracellulære Na+ fra den billeddiagnostiske afdeling, bruge to sprøjte reservoirer fyldt med Ringers løsning eller Na+-gratis løsning (tabel 3). Flow Ringers løsning at etablere baseline, derefter skifte til Na+-gratis løsning. Dette resulterer i store cytosole Ca2 + øger i fotoreceptor ydre segmenter og celle organer (Se figur 4).
- For tyngdekraft fodret perfusion systemer, overvågning af løsning i hver enkelt reservoir så strømningshastigheden er konstant under imaging. Hinden reservoirer efter behov med iltet løsninger, eller opretholde kontinuerlig ilt bobler med gas manifold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stabil positionering og tværgående orientering af skiver er nøglen til vellykket imaging med injektion eller perfusion af farmakologiske midler. En nøje gennemgang og flytte udsnittene inden Konfokal imaging som nødvendige for at sikre alle retinal lag er synlige (figur 2A, Skive ii). Hvis en skive drejes frem lidt (figur 2A, Skive iii), bundter af ydre segmenter bliver synlige og små justeringer kan foretages med pincet til at bringe de ønskede retinal lag i fokus. Skiver dårligt overholdt filtrerpapir (figur 2A, skær jeg) eller fastholde ÅV (figur 2A, skær iv) bør ikke anvendes for tid bortfalder billeddannelse.
Cellernes levedygtighed er altafgørende at observere fysiologiske processer ex vivo; en celle levedygtighed pletter såsom propidium Iodid (PI) anbefales at assay celle sundhed mens praktiserende nethinden udskæring. Døde celler nær den skårne kanter af alle skiver vil akkumulere PI i deres kerner (figur 2B, venstre paneler), mens 5-10 µm dybere ind i Skive, kan være afbildet i raske celler med normale morfologi og ingen PI farvning. For eksempel i fotoreceptorer vises PI negative celler under den skåret kant almindeligt en stereotype polariseret, aflange morfologi (figur 2B, rigtige paneler). Fotoreceptorer forblive levedygtige i retinal skiver for mindst 4 h når gemt i iltet Ringers løsning.
Mange retinal cellestrukturer kan visualiseres ved hjælp af kombinationer af transgene markører og farvestoffer; eksempel Konfokal billeder af frisk retinal skiver med dobbelt og tredobbelt fluorescerende mærkning er præsenteret i figur 3. For at visualisere dynamikken i kegle fotoreceptor endoplasmatiske reticulum (ER) i forhold til kernen, kan retinal skiver fra transgene fisk udtryk for normal god landbrugspraksis målrettet til kegle ER17 være counterstained med en nuklear farvestof (figur 3A). En lignende strategi kan være ansat til at se actin cytoskelettet ved hjælp af retinale skiver fra transgene zebrafisk udtrykker normal god landbrugspraksis-smeltet actin18 (figur 3B). Med en anden celle-specifikke promotor, kan Müller celler mærket med rødt fluorescerende protein tdTomato19 og visualiseret i retinal skiver (figur 3 c, toppanelet). Glukoseoptagelse i nethinden kan være analyserede i vivo af oralt gavaging voksen zebrafisk med en fluorescerende glukose analog (NBDG), som bliver inkorporeret i celler ses i en retinal skive21 (figur 3 c, nederste panel). Dobbelt transgene zebrafisk kan være ansat til at overvåge flere celle processer eller celletyper i tandem, såsom Ca2 + dynamics i en undertype af kegler. Figur 3D viser en tredobbelt mærkning ordningen for denne type af forsøg, med tdTomato udtrykt i lang bølgelængde kegler2 sammen medmitochondrially målrettet Ca 2 + -sensor (mito-GCaMP) udtrykt i alle kegler22 og en nuklear pletten.
Tid bortfalder billeddannelse af retinale celler er en afgørende fordel ved denne skive prep. For eksempel kan Ca2 + udsving i kegle fotoreceptor cytosol observeret og senere kvantificeres under farmakologisk manipulation, et eksperiment, der er afbildet i figur 4. Figur 4A viser retinal skiver udtryk for Ca2 + -sensor GCaMP2 (øverst) eller kontrol eGFP16 (nederst) i kegle fotoreceptorer counterstained med en rød lipofile farvestof. I dette eksperiment er Na+ isotonically forarmet fra den billeddiagnostiske afdeling bruger perfusion, fremmane store stigninger i cytosole Ca2 + for ydre segment og celle organ, som det fremgår af GCaMP (fig. 4A, top panel). Fluorescens af retinal skiver udtrykker Ca2 +-ufølsom eGFP er upåvirket ved denne behandling (figur 4A, nederste panel). Tid bortfalder film kan analyseres ved hjælp af ImageJ software til at isolere og kvantificere fluorescens svar fra enkelt kegle ydre segmenter, celle organer og synapser (figur 4B).
| Supplere løsning | ||
| 50 x materiel * koncentration (mM) | arbejde koncentration (mM) | |
| D-glukose | 500 | 10 |
| Sodium lactat | 50 | 1 |
| natrium pyruvat | 25 | 0,5 |
| L-glutamin | 25 | 0,5 |
| reduceret glutathion | 25 | 0,5 |
| ascorbinsyre | 15 | 0,3 |
| * gemme alikvoter ved-20 ºC < 6 måneder; tilføje frisk til Ringers løsning | ||
Tabel 1. Komponenter af 50 X supplere stamopløsning og endelige arbejde koncentrationer.
| Ringers løsning | |
| koncentration (mM) | |
| NaCl | 133 |
| KCl | 2.5 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| NaH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH til 7.4 ved hjælp af NaOH | |
| opbevares ved 4 ºC i steril flaske < 1 måned | |
Tabel 2. Komponenter af standard Ringers løsning.
| Na+-gratis Ringers løsning | |
| koncentration (mM) | |
| TRIS | 147 |
| HCl | 120 |
| KCl | 1 |
| CaCl2 · 2H2O | 2 |
| KH2PO4 | 1.5 |
| MgCl2 · 6H2O | 1.5 |
| HEPES | 10 |
| pH til 7.4 bruger HCl | |
| opbevares ved 4 ºC i steril flaske < 1 måned | |
Tabel 3. Komponenter af Na+-gratis Ringers løsning.
| Konfokal Imaging indstillinger | |||
| Fluorophore | Excitation | Emission Filter | |
| Bølgelængde | Laser intensitet | ||
| Normal god landbrugspraksis (herunder GCaMP) | 488 nm | 2 - 5% | eGFP eller AlexaFluor 488 |
| tdTomato | 559 nm | 5% | AlexaFluor 594 |
| PI | 559 nm | 2% | PI |
| Hoechst 33342 | 405 nm | 1% | DAPI |
| NBDG | 488 nm | 10% | eGFP eller AlexaFluor 488 |
| C12 558/568 BODIPY | 559 nm | 1% | AlexaFluor 594 |
| TMRM | 559 nm | 3% | RFP |
Tabel 4. Imaging betingelser for fluorescerende markører og farvestoffer præsenteret i tal 2-4.
Figur 1. Skematisk for at forberede frisk zebrafisk retinal skiver. (A) dissekere væk øjestykket, og kassér linse og sclera (trin 2.4.1.). (B) skåret øjestykket i tre stykker; Kassér lille kant stykke (trin 2.4.2.). (C) træk filtrerpapir under øjestykket stykker med indre nethinden vender mod filtrerpapir (skridt 2.5.1.-2.5.2.). (D) Flatten nethinden ved hjælp af en køkkenrulle til at væge Ringers løsning nedad gennem filtrerpapir (trin 2.5.3.), derefter forsigtigt skræl væk resterende ÅV med pincet (trin 2.6). Flytte filter papir til udskæring salen på væv slicer scenen og klippe 400 µm skiver (trin 2.8., 2.9.). (E) overførsel udskæring kammer med skiver og en voks eller vaseline stige til en petriskål Ringers løsning (trin 2.10.1.). (F) bruge fine pincet til at glide enkelt udsnit fra udskæring salen til stigen samtidig holde skiver neddykket. (G) rotere filterpapir strimler (sort) 90 ° og begrave kanterne af filterpapir i voks eller vaseline (skridt 2.10.2.-2.10.3.). (H) skematisk af den endelige imaging kammer fyldt med en stige og skiver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksempler på frisk zebrafisk retinal skiver vise ordentlig vedhæftning til filtrerpapir og cellernes levedygtighed. (A) Brightfield billede af friske retinal skiver i en vaseline stige. Skiver ii og iii vise god vedhæftning og tværgående retinal lag. Skiver i og iv har bevaret betydelige ÅV, eller er meget buet og ikke godt overholdt til filtrerpapir, og bør ikke være afbildet. Skalalinjen = 200 µm. (B) Top-down Z montage af en frisk retinal skive fra transgene zebrafisk udtrykker eGFP i kegle fotoreceptorer (Tg(gnat2:eGFP)16). Hoechst farvning etiketter alle kerner; propidium Iodid (PI) counterstaining etiketter kerner af døde celler, der vises i nærheden af den skåret kant af skive (venstre). Z-stakstørrelse trin = 1 µm; skalalinjen = 20 µm. fluorescerende imaging betingelser er skitseret i tabel 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Prøve Konfokal billeder af dobbelt - og triple-mærket ex vivo retinal skiver fra transgene voksen zebrafisk. (A) to-imaging farveskema beskæftiger transgene normal god landbrugspraksis markeret endoplasmatiske reticulum i kegler (Tg(gnat2:calr-GFP)17, top) med Hoechst nukleare kontrastfarve (blå, nederst). (B) NGL markeret actin i kegler (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, top) med Hoechst nukleare kontrastfarve (blå, nederst). (C) RFP mærket Müller celler (Tg(GFAP:tdTomato)19, top) fra en zebrafisk fodret fluorescerende glukose (NBDG) viser glukoseoptagelse i kegler20,21 (grøn, nederst). (Billedet er fra Kanow, et al. figur 2B 21) (D) eksempel på trefarvet imaging ved hjælp af dobbelt transgene zebrafisk. Venstre, RFP målrettet til lang bølgelængde kegle fotoreceptorer (Tg(trβ2:tdTomato)2). Center, calcium biosensor GCaMP målrettet til kegle fotoreceptor mitokondrier (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22). Højre, overlejret billeder af tdTomato (magenta), mito-GCaMP (grøn) og Hoechst nukleare kontrastfarve (blå). Billeder er maksimal intensitet Z-fremskrivninger af 9 billeder over 7 µm væv dybde; skala barer repræsenterer 10 µm. fluorescerende imaging betingelser er skitseret i tabel 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ca2 + imaging med GCaMP og kontrol eGFP. (A) repræsentative billeder af frisk retinal skiver udtrykker den fluorescerende Ca2 + biosensor GCaMP (gnat2:GCaMP32, top) eller eGFP (nederst) i kegle fotoreceptorer. Venstre, skiver på baseline; højre, skiver 2 min efter Na+ var isotonically forarmet fra imaging kammeret ved hjælp af perfusion af en Tris-baseret ringetone løsning, som fælder Ca2 + i fotoreceptorer. Skalere barer = 10 µm. fluorescerende imaging betingelser er skitseret i tabel 4. (B) mener fluorescens ændringer af enkelt fotoreceptor rum (ydre segmenter, celle organer og synapser) under tid bortfalder billeddannelse af Na+ udtynding. Skiver var afbildet hver 10 s, stakke blev behandlet ved hjælp af ImageJ, og fluorescens af GCaMP eller eGFP var normaliseret for at signalere fra membran farvestof. Ubrudte linjer, GCaMP (n for ydre segmenter = 15, celle organer = 24, synapser = 26); stiplede linjer, eGFP (n for ydre segmenter = 26, celle organer = 20, synapser = 31). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo billeddannelse af frisk zebrafisk retinal skiver har vist sig for at være et alsidigt værktøj til at studere fotoreceptor biologi20,21,22, og er enestående, idet det giver mulighed for analyse af enkelt celler i et modent, fuldt differentierede nethinden. Med praksis er det muligt at udføre flere eksperimenter med væv fra en enkelt fisk, selv ved hjælp af seriel udsnit fra den samme del af nethinden. Ud over de udfordringer og forslag om forberedelse af padder retinal skiver af Elektrofysiologi studier14er der vigtige overvejelser for imaging eksperimenter.
For fotoreceptorer korrelerer cellernes levedygtighed generelt med celle morfologi, så det er vigtigt at håndtere den sarte nethinden minimalt, især efter ÅV er blevet fjernet. Efter udskæring, skal du bruge fine pincet til at skub forsigtigt skiver vandret fra udskæring salen (figur 1F) til at overføre dem til stigen i stedet for at løfte skiver lige op, og altid holde skiver neddykket i Ringers løsning. Om muligt samle stigen af retinale skiver nær Konfokal mikroskop til at minimere skader på skiver fra ryster under transport.
Stærk vedhæftning af retinale væv til filtret er kritisk for at skabe skiver, vil forblive stabil under injektion eller perfusion eksperimenter. Det er nødvendigt at omhyggeligt inspicere hver skive for morfologi og stabilitet lige før imaging (figur 2A); forsigtigt trykke tabellen mikroskop, mens visning skive bevægelse gennem Konfokal okulær linsen afslører stabilitet af et bestemt udsnit. Trods forholdsregler, glider i Z-retning under injektion eller perfusion kan præsentere udfordringer for analyse, så det er nyttigt at indlæse en kontrol farvestof, som lipofile farvestoffer for membraner og mitokondrier, at stabilt mærke en identificerbar cellestruktur til normalisering (figur 4A, magenta). Hvis skiver glider > 10 µm i Z-retning kan det ikke være muligt at udvinde brugbare encellede data. Moderat drift i X-Y-retningen kan korrigeres i post-processing bruger registrering software som MultiStackReg for ImageJ (RRID:SCR_002285).
Under statiske betingelser, bør fluorescens af markører i retinal skiver forblive stabil, selv om photobleaching kan opstå under imaging. Bør sikres at minimere laser eksponering under tid bortfalder ved raffinering parametre såsom laser intensitet, scanning hastighed og billedhastighed. Billedbehandling Kontroller anbefales for hver fluorescerende markør anvendes. Kontrolelementer omfatter indsprøjtning eller perfusing Ringers løsning uden farmakologisk agenter i separate eksperimenter eller gennemføre imaging eksperimenter med ikke-biosensor markører, der fluorescerer constitutively.
Afhængigt af Konfokal excitation laser bliver brugt, kan pigmenter i ÅV bidrage til autofluorescence og selv generere varme under imaging, så det er vigtigt at fjerne det meste af dette væv inden udskæring. Dark-adapting dyr hjælpemidler i fjernelse af ÅV samtidig minimere skader på den underliggende nethinden. Manglende evne til at afbilde ÅV er en begrænsning af denne skive forberedelse, selvom dette kan løses ved hjælp af albino dyr med en gennemsigtig ÅV. En anden begrænsning er at retinal ganglion celler og slutningen fødder af Müller celler kan blive skjult fra visning af filtrerpapir; som en alternativ forberedelse kan nethinder være flad monteret med fotoreceptor side ned på filtrerpapir og derefter skåret for at give et klarere overblik over den inderste nethinden. Det er også vigtigt at bemærke, at lange vandrette fremskrivninger af nogle celler, som bredt felt amacrine celler, kan adskilles under dissektion eller udskæring. En endelig begrænsning er, at mange fluorescerende farvestoffer akkumulerer nonspecifically i fotoreceptor ydre segmenter, så for denne del af nethinden er det tilrådeligt at bruge genetisk kodet biosensorer snarere end indikator farvestoffer.
Givet den brede vifte af tilgængelige fluorescerende celle reporter farvestoffer23,24 for væv og genetisk kodet fluorescerende biosensorer anvendt med succes i zebrafisk2,3,4, 5, denne skive forberedelse kunne bruges til at studere mange biologiske processer i flere retinal celletyper (se eksempler i figur 3, , figur 4). Imaging frisk retinal skiver ved hjælp af levende celle super-resolution mikroskopi kunne også give spændende nye indsigter til retinal funktion og sundhed på en subcellulært niveau. Yderligere, kan denne metode tilpasses til ex vivo billeddannelse af musen retinal skiver25. Mens vellykket forberedelse af frisk retinal skiver kræver praksis, er det et kraftfuldt værktøj, der er nyttige for et bredt udsnit af celle-specifikke biologiske spørgsmål i en moden nethinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takke Ralph Nelson og Daniel Possin tankevækkende vejledning samtidig udvikle denne protokol, og Eva Ma, Ashley George og Gail Stanton for generation af stabil transgene zebrafisk linjer. Arbejdet var støttet af NSF GRFP 2013158531 til M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. og M.G. og EY026020 til J.H. og S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
