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Behavior

Reintegração de busca de drogas em ratos utilizando o paradigma de preferência lugar condicionado

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/56983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigación Psicobiología de las Drogodependencias, Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universitat de València

Summary

Este protocolo descreve a preferência de lugar condicionado (CPP) como um modelo de recaída. Este procedimento permite a medição de recaída em animais de laboratório, considerando o impacto das drogas associadas Dicas ambientais como desejo e recaída em viciados em ausência é, atualmente, o foco dos programas de tratamento do abuso de drogas.

Abstract

O presente protocolo descreve a preferência de lugar condicionado (CPP) como um modelo de recaída no vício em drogas. Neste modelo, animais primeiro são treinados para adquirir uma preferência de lugar condicionados em um compartimento de droga-emparelhado, e após o teste post-condicionado, eles realizam várias sessões para extinguir a preferência estabelecida. O CPP permite a avaliação dos efeitos condicionados gratificantes de pistas relacionadas ao meio ambiente de drogas. Em seguida, o CPP extinto pode ser robustamente restabelecido pela administração de uma dose de escorva da droga não-contingentes e pela exposição aos estímulos estressantes. Ambos os métodos serão explicados aqui. Quando o animal reinicia a resposta comportamental, é considerado um restabelecimento da recompensa condicionado tiveram lugar.

As principais vantagens do presente protocolo são que é não-invasivo, barato e simples, com critérios de validade boa. Além disso, permite o estudo de diferentes manipulações ambientais, tais como o stress ou a dieta, que pode modular a recaída em comportamentos de busca de drogas. No entanto, uma limitação é que, se o pesquisador pretende explorar a motivação e os efeitos de reforçados primários da droga, deve ser complementado com procedimentos de auto-administração, envolvem respostas operante de animais.

Introduction

O paradigma de preferência de lugar condicionado (CPP) oferece uma maneira simples de avaliar a recompensa condicionada induzida por estímulos diversos1,2e tem sido usado amplamente para estudar os efeitos condicionados gratificantes de drogas que viciam3 . É baseado no condicionamento pavloviano, avaliando o valor motivacional de pistas ambientais associadas a drogas para manter comportamento viciante4. Neste modelo, pistas ambientais adquirem Propriedades repetido secundário (acondicionados recompensadores efeitos) quando emparelhado com um reforçador primário3. Por exemplo, um lugar inicialmente neutro (como a cor de um compartimento na gaiola CPP) é combinado com os efeitos específicos de uma droga de abuso durante algumas sessões5, enquanto outro compartimento está associado com a injeção de um veículo de condicionamento. Após o condicionamento, se o animal passa mais tempo no compartimento anteriormente associado com a droga, presume-se que o CPP desenvolveu3. O estabelecimento da preferência é alcançado quando o animal dá um valor positivo para as pistas ambientais ligadas à droga, que é o reforçador primário. Consequentemente, animais irão executar respostas comportamentais de remédios em resposta a essas pistas contextuais6. O modelo do CPP permite a avaliação das propriedades gratificantes de doses abaixo do limite da droga, mostrando-se os animais em uma condição específica (por exemplo, tendo sofrido de derrota social anteriormente) são mais vulneráveis e sensíveis às doses que são Não é eficaz em ingênuo animais7.

O modelo CPP também tem sido usado para avaliar extinção/reintegração como um modelo animal para estudar a recaída3, qual é o objectivo do presente protocolo. Existem três diferentes fases: aquisição, extinção e reintegração (Figura 1). No modelo de reintegração de CPP, animais primeiro adquirem o CPP para um compartimento de droga-emparelhado, e então eles executam várias sessões de extinção. Definimos a extinção como o momento em que o animal reduz suas respostas comportamentais de aproximação a um estímulo gratificante condicionado que tenha sido removido (por exemplo, a droga)8. Durante as sessões de extinção, animais explorar os compartimentos na ausência da droga, para que a preferência adquirida é gradualmente atenuada9. Uma questão importante a considerar é que a mudança de comportamento que o animal apresenta durante a extinção (a diminuição progressiva do tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado) pode ser devido a novos processos de aprendizagem que competir com a anterior resposta aprendida, ou devido a uma diminuição no estado motivacional interno do sujeito3. Finalmente, o restabelecimento da preferência local através do contexto ou drogas sinais seria o nosso modelo de reintegração1.

Administrar uma injecção de escorva da droga associada pode restabelecer a preferência, que é considerada um restabelecimento da aproximação para as pistas contextuais. Reintegração de drogas escorva ocorre devido à memória persistente dos efeitos prazerosos da droga, que induziu o desejo e motiva os animais a procurar as pistas ambientais relacionadas à recompensa.

Algumas vantagens do modelo de reintegração de CPP são de que o procedimento não-invasivo (em contraste com a automedicação, que requer cirurgia), barato e simples. Além disso, este modelo tem uma validade de critério de bom, como ele imita bem o que ocorre em seres humanos10,11, induzindo a reintegração com estímulos que induzem a recaída, tais como re-exposição à droga12,13 ou estresse14.

Existem outras técnicas, como a extinção – modelo de reintegração de auto-administração intravenosa. Aqui, os animais pressionar uma alavanca para auto-administrar a droga, o que permite a avaliação da resposta operante do animal, compulsivity e motivação14,15,16. A principal vantagem do CPP sobre procedimentos de auto-administração é que a reintegração do CPP é considerada para refletir a reativação do valor incentivo motivacional dos estímulos contexto emparelhado com a droga, consistindo o reaparecimento da abordagem comportamento para o contexto de17. Além disso, estímulos não-farmacológicos, tais como estresse, também podem induzir a reintegração18,19. Por exemplo, um estudo de auto-administração descrito sem efeitos na reintegração do consumo de heroína em ratos depois de um choque de pé ou retenção stress20. Autores discutiram que era mal sucedida porque esses estressores foram testadas fora da câmara de auto-administração em um contexto diferente. Em contraste, quando usando o modelo CPP de reintegração, havia um claro re-establishment da CPP induzida pela morfina depois de usar as mesmas estressores e aplicado em um contexto diferente do CPP e em momentos diferentes (0 e 15 min depois da exposição de estresse)18 .

Vários estudos na literatura têm demonstrado maneiras diferentes de drogas e reintegração induzida por estresse. Por um lado, a reintegração induzida por drogas tem sido relatada em ratos e camundongos usando morfina5,21,22,23, cocaína24,25, anfetamina26, 27, etanol28,29e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA)30. Por outro lado, a exposição ao estresse pode ser um factor determinante na vulnerabilidade ao abuso de drogas. Stress é conhecida por aumentar os efeitos gratificantes de drogas7,31,32 e seu papel na recaída é bem estabelecida33,34. Por exemplo, a derrota em interações sociais com um conspecific reabilita morfina e cocaína CPP18,19. Além disso, animais expostos a repetida derrota social são mais vulneráveis aos efeitos condicionados gratificantes de doses abaixo do limite de cocaína e restabelecer a preferência com muito baixas doses de cocaína,7.

Aplicação do modelo de reintegração de CPP é uma maneira útil e sensível para avaliar a vulnerabilidade para a recaída em animais e permite a avaliação de diferentes manipulações ambientais sutis, que são os principais gatilhos que ameaçam recaída humana, tais como reintegração ou estresse-induzido.

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Protocol

Todos os procedimentos envolvendo ratos e seus cuidados cumprido com as leis nacionais, regionais e locais e regulamentos, que estão em conformidade com a Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos. O Comité conta da Universidade de Valência e uso Animal aprovaram o presente protocolo.

1. materiais e set-up para a preferência de lugar condicionado:

  1. Lidar com ratos 3 dias antes do teste de 1-2 min cada. A base da cauda deve ser aproveitada. O corpo deve ser apoiado, se possível. Isso é feito para minimizar a dor e a angústia ao lidar com um animal e para evitar variáveis interferentes, tais como o stress.
    Nota: De camundongos machos 1 60 dias de idade (jovens adultos) pesando 35-40 g foram empregados nas experiências de presente. Reintegração induzida por drogas pode ser realizada em camundongos de ambos os sexos. No entanto, sobre reintegração induzida por estresse, o paradigma social derrota projetado somente para roedores do sexo masculinos, como fazem as fêmeas não induzir uma resposta agressiva nos ratos residentes.
  2. Para o condicionamento de lugar, use caixas iguais, feitas com dois compartimentos idênticos (30,7 cm comprimento 31,5 cm largura × × 34,5 cm de altura), separados por uma zona cinzenta central menor (13,8 longo 31,5 cm largura × × alta de 34,5).
    Nota: Compartimentos têm piso diferentes texturas e cores de parede (um piso liso no compartimento preto e um chão áspero em branco). Cada compartimento da caixa CPP contém quatro feixes de luz infravermelhas e seis no compartimento central. Isto permite a gravação das travessias entre compartimentos e a posição do animal.
  3. Definir se as luzes da sala (desligadas ou abaixadas) cada dia. Use luzes vermelhas (recomendadas), como os animais não percebê-lo e ele é atenuado para o experimentador (aproximadamente 40 lux medido a 1 m acima do nível do piso).
  4. Configurar o programa para registrar 15 min para o condicionamento de pré e pós-teste (veja a Tabela de materiais para software) (Figura 2)
  5. Prepare a solução de cocaína necessária para todo o experimento. Dissolver o hidrocloreto de cocaína em 0,9% NaCl (soro fisiológico) em um volume de 0,1 mL/10 g de massa corporal. Mistura de vórtice e loja a 4 ° C, no final do dia.
    Nota: Concentrações de cocaína podem variar dependendo da finalidade do estudo. Se o objetivo é avaliar as doses abaixo do limite de cocaína, uma concentração de 1 mg/kg pode ser usada, que é ineficaz em animais de controle, como visto em anteriores estudos24,35. Se uma dose eficaz é o objectivo, uma concentração de 6 mg/kg pode ser escolhido, que é eficaz, mas não induz a reintegração24, ou por uma concentração de 25 mg/kg, que é eficaz e induz a reintegração da preferência19.
  6. Teste os animais durante a fase escura e usar a mesma caixa para cada animal em dias.
  7. Trazer animais todos os dias para a sala de testes nas jaulas em casa e deixá-los sem ser perturbado por 15 min como um período de habituação para todos os barulhos relacionados ao teste.

2. teste

  1. Aquisição
    Nota: O procedimento de condicionamento de lugar, imparcial em termos de preferência espontânea inicial, consiste em três fases: pré-condicionamento, condicionamento e pós-condicionado (Figura 1).
    1. Pré-condicionamento (Pre-C) (3 dias) (Figura 2, Figura 3, Figura 4)
      Nota: Aqui, o valor neutro dos compartimentos na caixa CPP é avaliado. Medida que o tempo gasto em cada compartimento e depois compará-lo com o que gastou no mesmo compartimento no teste pós-condicionado.
      1. Trazer os animais para a sala de teste e deixá-los habituados por 15 min.
      2. Verifique guilhotinas são removidos da gaiola.
      3. Configure o computador e o programa. Insira o animal IDs e pressione o comando "Experimental" e "Start" (Figura 2).
      4. Coloque o mouse suavemente na câmara média (compartimento cinza) e deixar a sala de testes com o mínimo de ruído.
      5. Trazer todos os animais em jaulas em casa e salvar os dados, quando o julgamento for concluído.
      6. Permitir que os ratos acessar ambos os compartimentos do aparelho por 15 min (900 s) por dia em 3 dias consecutivos.
      7. No dia 3, anote o tempo gasto em cada compartimento durante um período de s 900 e guarde-o para a atribuição dos compartimentos na fase seguinte (Figura 3).
      8. Atribua a metade dos animais em cada grupo para receber a droga ou o veículo em um compartimento (por exemplo, preto) e a outra metade no outro compartimento (por exemplo, branco) (Figura 4).
        Nota: A distribuição final dos animais deve garantir que metade dos animais são atribuídos para o compartimento inicialmente preferencial e a outra metade para o compartimento não-preferenciais. Além disso, metade dos animais recebeu a droga em um compartimento (por exemplo, aquele preto) e a outra metade no outro (no caso, o branquinho).
      9. Golo de equilíbrio no grupo dentro ambos os compartimentos, bem como em grupos (diferenças de grupo de teste com análise de variância (ANOVA)). Como orientação aproximada, os valores devem ser em torno de 360-370 s no teste de pré-C (Figura 4). Nota: não houve diferença significativa deve ser detectada entre o tempo gasto em compartimentos do droga-emparelhado e veículo-emparelhado durante o teste de pré-C.
      10. Exclua os animais que apresentem uma forte aversão ou preferência para qualquer compartimento. Considere aversão como gastando menos tempo do que 33% no compartimento e considerar a preferência quando o animal passou mais de 67% do tempo total naquele compartimento.
    2. (4 dias) de condicionamento (Figura 5)
      1. Pesar os animais e usar estes pesos para doses de cocaína durante o condicionamento.
      2. Prepare as seringas com cocaína ou soro fisiológico com base no peso corporal.
      3. Injetar um rato em um momento intraperitonealmente (ip) e imediatamente, coloque-a suavemente no compartimento preto ou branco atribuído de sua caixa.
      4. Após um intervalo de 4h, injete a dose da droga, imediatamente antes que o mouse está confinado ao compartimento da droga-emparelhado por 30 min (Figura 5).
      5. Este procedimento alternativo cada dia, começando com cocaína nos dias 1 e 3 e salinos nos dias 2 e 4.
      6. Verifique que o confinamento é realizado em ambos os casos, fechando a porta de guilhotina que separa os dois compartimentos, tornando a área central inacessíveis.
        Nota: Nesta fase, não há nenhuma necessidade de configurar o programa do PC.
    3. Pós-condicionado (Post-C) (1 dia)
      1. Trazer os animais para a sala de teste e deixá-los habituados por 15 min.
      2. Remova a porta de guilhotina, separando os dois compartimentos.
      3. Configure o computador e o programa. Insira o animal IDs e pressione o comando "start".
      4. Registrar o tempo gasto pelos ratos não tratados em cada compartimento durante um período de observação de s 900.
      5. Quando o julgamento for concluído, trazer todos os animais em jaulas em casa e salvar os dados.
      6. Considere que a droga tem induzido preferência de lugar se o tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado durante o Post-C é significativamente maior do que no teste de pré-C. Se ocorre o contrário, considere uma aversão para o compartimento de droga-emparelhado.
  2. Extinção
    1. Realizar uma sessão semanal de extinção em todos os grupos/animais que desenvolveu uma preferência para o compartimento de droga-emparelhado.
    2. Coloque o animal no aparelho (sem guilhotinas) por 15 min (mesmo que os testes pré e Post-C) (Figura 1).
      Nota: Se a dose empregada no CPP é alto (25 mg/kg), executar 1 sessão de extinção por semana. Se uma dose abaixo do limite é usado (1 mg/kg), em seguida, execute 2 extinção sessões por semana (por exemplo, segunda-feira e quinta-feira).
    3. Considere a preferência extinguida quando dados de teste a extinção não mostram diferenças em relação ao teste pré-C, mas eles mostram diferenças em relação ao teste Post-C.
    4. Repita o teste 24h mais tarde para confirmar a extinção.
  3. Restabelecimento do CPP
    1. Reintegração de escorva-induzido
      1. Avalie os efeitos de uma dose de escorva de cocaína 24h após extinção tenha sido confirmada.
        Nota: Doses de Priming são metade da dose anterior que o animal tenha recebido durante o condicionamento. O teste de reintegração sofre o mesmo protocolo como Pre-C e testes Post-C, exceto que os animais recebem a dose de cocaína em um contingente de não colocar 15 min antes do teste. A eficácia de escorva de drogas na indução de reintegração pode ser reforçada após extinção/reintegração repetida experiências23, embora a ordem das doses não parece desempenhar um papel nos resultados obtidos36.
      2. Trazer os animais para um quarto diferente da sala de testes (não-contingentes lugar) (Figura 6).
      3. Injetá-las com metade da dose anterior de cocaína (por exemplo, se os animais foram condicionados com 25 mg/kg de cocaína, uma dose de escorva seria 12,5 mg/kg).
      4. Trazê-los de volta para seu viveiro durante 15 min.
      5. Levá-los para a sala de testes e colocar os animais no aparelho imediatamente (sem as portas de guilhotina separando os compartimentos) por 15 min (mesmo que o pré e Post-C testes).
      6. Considere a diferença em segundos entre o tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado durante a última sessão de extinção e o teste de reintegração como uma medida do grau de restabelecimento da preferência induzida pela droga.
      7. Repita o procedimento de extinção-reintegração cada vez com a diminuição de doses até que ele é confirmado para ser ineficaz.
        Nota: Um controle de injeção de solução salina pode ser usado para controlar a capacidade de escorva de cocaína (e não de injeção em si) para induzir a reintegração.
    2. Reintegração induzida por estresse
      1. Avaliar os efeitos de uma reintegração de estresse induzido por 24 h após extinção foi confirmada
        Nota: Testes de reintegração são os mesmos que os realizados em Post-C (livre deambulação por 15 min), exceto que os animais são testados 15 min após a derrota social em uma agonística encontro (Figura 6)
      2. Leve os animais para um quarto diferente da sala de CPP.
      3. Coloque o mouse experimental com um sexo agressivo oponente correspondido de igual idade e peso corporal na gaiola plástica (Figura 6).
        Nota: O encontro agonístico consiste em um teste de 10 min em uma gaiola plástica transparente (23x13.5x13cm) neutro com um resultado de derrota para o mouse experimental. Para preparar o adversário agressivo, primeiro Isole animais diferentes que correspondem na idade e peso corporal, como os ratos experimentais por 3 semanas. Treiná-los para adquirir experiência de combate e testá-los para ter altos níveis de agressividade territorial. Para obter coespecíficos agressivos, ratos devem ser isolados pelo menos 3 semanas e em seguida, treinou em agressivo e comportamentos de ataque. Os animais são treinados em um ambiente neutro, enfrentando-os em pares. Deixamo-los morder as vezes adversário 2 ou 3 e tirar-lhes a gaiola, sempre terminando o treinamento antes de um dos dois ratos mostra submissão, para que a experiência do encontro reforça o comportamento agressivo. Após sofrer agressão (ameaça e ataque do conspecific agressivo), ratos experimentais devem apresentar evasão/fugir e comportamento defensivo/submisso. O critério é adotar uma postura específica da derrota, caracterizada por uma posição ereta e submissa, mancar dianteiras, cabeça angular ascendente e retraído orelhas (Figura 6). De acordo com Burke et al, 2016, consideramos que o encontro social é encerrado antes, se o intruso exibe uma postura submissa supina para > 8 s ou se 13 mordidas de ataque ocorreram. Outra opção para animais de tela sem risco de lesão significativa poderia ser ao ritmo do animal em um gabinete de malha com um buraco, não é grande o suficiente para qualquer animal passar.  Agressão pode ser detectado sem submeter animais para direcionar o comportamento agressivo.  Se um animal sustenta uma lesão com um ferimento de 1cm de diâmetro e/ou exposição direta do músculo, ele é excluído do estudo e deve ser sacrificado.
      4. Após 10 min de encontro agonístico, levar os ratos em sala de testes e colocar os animais no aparato de CPP imediatamente (sem as portas de guilhotina separando os compartimentos) por 15 min (mesmo que o pré e Post-C testes).

3. análise estatística

Nota: O tamanho de amostra Ideal deve ser um mínimo de 15 animais por grupo.

  1. Analisar o tempo médio gasto no compartimento do droga-emparelhado do grupo através de uma ANOVA mista com um entre variável, tratamento, com dois níveis (grupo controle, Grupo Experimental, a exemplo dos dois grupos está na Figura 7C) e um dentro variável – dias, com 2 níveis (Pre-C e Post-C).
    Nota: No grupo controle, animais recebem a droga mas tem sem manipulações ambientais. Por outro lado, no grupo experimental, os animais estão expostos a diferentes condições ambientais. Compare o tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado no dia Post-C com respeito a Pre-C teste para ver se existem diferenças significativas de sensibilidade à droga.
  2. Além disso, realize análises post-hoc de Bonferroni para verificar qualquer um dos escores significativos.
  3. Analisar dados relacionados a valores de extinção e reintegração dos grupos que preferência desenvolvida por meio de testes t Student´s para continuar com o processo de extinção-reintegração no decorrer do experimento, mas no momento final, analisá-los com uma ANOVA com um dentro variável (dias) com o número de níveis, dependendo de cada grupo.
    Nota: Quando o número de comparações é aumentado, o número daqueles que será significativo por acaso também aumentou. Como tal, para evitar falsos positivos (erros de tipo 1) nós 'corrigir' o p-valor, tornando o teste mais conservadores com a correção de Bonferroni para vários t-testes. No entanto, para o teste de reintegração, a comparação deve ser feita entre o teste de reintegração e o último teste de extinção. Portanto, não há nenhuma necessidade de correção.

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Representative Results

Em primeiro lugar, resultados representativos da reintegração de escorva - e induzida por estresse são mostrados na Figura 7 usando ratos machos adultos de OF1.

Os dados na Figura 7a-b , que representa o tempo gasto no compartimento de droga-emparelhado no pré e Post-C teste foram analisados com um medidas repetidas ANOVA com um dias variável dentro de temas (comparando C-pré e Post-C). Os resultados mostraram um efeito significativo dos dias variáveis [F(1,34) = 51.179; p < 0,001], como todos os animais desenvolveram uma preferência durante o dia de Post-C em comparação com o Pre-C. Todos os animais foram condicionados com 25 mg/kg de cocaína e quando a extinção foi alcançada, um grupo recebeu uma dose de escorva de 12,5 mg/kg de cocaína para testar o restabelecimento (Figura 7a) e o outro foi submetido a uma interação social em que o experimental animal foi derrotado por um adversário agressivo (Figura 7b). 15 min após os dois eventos, os animais foram testados em sua respectiva caixa de CPP.

O restabelecimento de escorva-induzido (Figura 7a) foi submetido para subsequentes diminuir doses de escorva (metade o um anterior) até uma dose de escorva é confirmado para ser ineficaz. As doses foram: 12.5, 6.25, 3.125 e 1,56 mg/kg de cocaína. O Student´s t-teste revelou um efeito significativo sobre a reintegração de cocaína de 12,5 mg/kg em relação a sessão de extinção (estatística t (t) = 20.589, graus de liberdade (DF) = 17; p < 0,001) e doses subsequentes (6,25 mg/kg: t = 18.356; 3,125 mg/kg: t = 14.260; 1,56 mg/kg: t = 16.934 DF = 17; p < 0,001). Escorva com 0,78 mg/kg não induz a reintegração.

A respeito da reintegração induzida por estresse (ver Figura 7b), sendo exposto a um animal agressivo e derrotou 15 min antes do teste leva a restabelecer a preferência anteriormente extinta (t = 26.810; DF = 15; p < 0,001)19 .

Outras manipulações ambientais, tais como sofrendo derrota social repetida antes do procedimento CPP, modificar os gratificantes efeitos de doses abaixo do limite de cocaína (Figura 7C). A misturado ANOVA com o entre a variável "stress" e o dentro da variável "dias" foi realizados e houve um efeito significativo da interação estresse x dias [F(1,29) = 4.144; p < 0.05]. Únicos animais socialmente derrotados exibiram a preferência para o compartimento de droga-emparelhado com uma dose abaixo do limite de cocaína, que foi mostrada para ser ineficaz em animais padrão7. Além disso, após a extinção da preferência, animais socialmente derrotados restabeleceu sua preferência com escorva de cocaína apenas 0,5 mg/kg (t = 25.484 DF = 17; p < 0,001).

Em segundo lugar, como um resultado negativo, podemos ver como o restabelecimento pode ser impedido por uma interação social positiva com um conspecific não agressivo (figura 8a). Portanto, é importante avaliar se os animais são derrotados ou não depois de um social encontram37.

Outro exemplo de resultados negativos que impedem o restabelecimento pode ser manipulações nutricionais, tais como uma ingestão de gordura dieta palatável. Em primeiro lugar, a análise ANOVA revelou um efeito dos dias variáveis [F(1,26) = 21.527; p <.0.001], como ambos os grupos desenvolveram preferência para o compartimento de Droga-pareado (p < 0,01) (Figura 8b). Depois da extinção, nossos resultados mostram que animais mudados para a dieta de alto teor de gordura após o teste Post-C diminuiu sua sensibilidade ao restabelecimento induzida por drogas escorva, como eles não restabelecer a preferência com a cocaína de 6,25 mg/kg dose38.

Figure 1
Figura 1: procedimento Experimental da preferência local condicionado. Consiste em três fases: pré-condicionamento, condicionamento e pós-condicionado. Há 4 dias de condicionamento em que o procedimento é alternado a cada dia, começando com cocaína nos dias 1 e 3 e com veículo nos dias 2 e 4. Em seguida, extinção e reintegração sessões são realizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: sessões de uso de Software para testes de pré-C e C-Post, onde o tempo gasto em cada compartimento e é registado o número de entradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: dados após o teste de pré-C e C-Post Aqui, grave os dados obtidos durante o teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: atribuição imparcial dos animais para os compartimentos para a próxima fase de condicionamento. Pegar os dados do último dia de teste de pré-C em compartimentos do brancos e pretos. Metade dos animais é atribuídos para receber a droga ou veículo em compartimento (preto ou branco) e a outra metade no outro compartimento. Exclua os animais que apresentem forte aversão ou preferência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: trabalho Final de veículo e cocaína emparelhado sessões. Esta figura mostra a alternância da ordem de emparelhamentos. Nos dias 1 e 3, um animal (por exemplo, 1.1) primeiro é exposto ao compartimento de cocaína-emparelhado (aquele branco) e, depois de quatro horas, é exposto ao compartimento do veículo-emparelhado (aquele preto). Nos dias 2 e 4, a ordem dos pares é invertida, e o animal é exposto primeiro veículo-emparelhado (preto) no compartimento e, depois de quatro horas, para o compartimento de cocaína-emparelhado (branco). Como esse procedimento é imparcial e sessões simultâneas, contrabalançadas condicionado podem ser conduzidas com dois animais usando ambos os compartimentos da caixa do mesmo (por exemplo, animais 1.1 e 2.4, 3.1 e 1.3), que nos permite reduzir o tempo dedicado para a procedimento experimental. Observe que esses pares de animais seguem a ordem inversa de emparelhamentos através da fase de condicionamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: dois modelos de reintegração. (um) induzida por Priming reintegração e (b) induzida por estresse reintegração. (um) os animais recebem uma injeção de drogas em um quarto não-contingente e são trazidos para o viveiro; 15 min mais tarde que eles são testados na caixa do CPP. (b) os animais são derrotados em um encontro agonístico em um quarto não-contingente durante 10 minutos e, depois, eles são testados na caixa do CPP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: resultados positivos representativos. Escorva (um) e reintegração induzida por estresse (b) depois de 25 mg/kg de cocaína CPP. (c) efeitos da derrota social sobre os efeitos gratificantes de doses abaixo do limite de cocaína (1 mg/kg). Barras representam o tempo médio (± SEM) em segundos gastos no compartimento do droga-emparelhado durante pré-condicionamento (branco), pós-condicionado (preto), a última sessão de extinção (cinza claro) e reintegração (cinza escuro). O teste de reintegração foi avaliado 15 min após uma dose de escorva de metade da dose anterior recebida. * p < 0,05; * * p < 0,01; p < 0,001 diferença significativa vs Pre-C (ANOVA com um dentro-temas variáveis dias (comparando C-pré e Post-C) ou sessão de extinção anterior (teste t de Student). Estes números foram modificados de 7,19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: resultados negativos representativos. Efeitos da proteção ambientais manipulações sobre os efeitos gratificantes de cocaína. teste de (um) efeitos de uma interação social positiva antes da reintegração. (b) os efeitos de uma dieta de alto teor de gordura durante o período de extinção toda e reintegração. O grupo de controle foi alimentado com uma dieta padrão (13% de kcal de gordura, 67% kcal de carboidratos e 20% kcal de proteína; 2,9 total kcal/g) e o grupo da dieta hiperlipídica (45% kcal de gordura, 36% kcal de carboidratos e 19% kcal de proteína; 4.6 total kcal/g). Barras representam o tempo médio (± SEM) em segundos gastos no compartimento do droga-emparelhado durante pré-condicionamento (branco), pós-condicionado (preto), a última sessão de extinção (cinza claro) e reintegração (cinza escuro). O teste de reintegração foi avaliado 15 min após uma dose de escorva de metade da dose recebida anterior. * p < 0,05; * * p < 0,01; diferença significativa vs Pre-C (ANOVA com um dentro-temas variáveis dias (comparando C-pré e Post-C) ou sessão de extinção anterior (teste t de Student). Estes números foram modificados de 37,38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O ponto-chave de pesquisa de dependência de drogas é o desenvolvimento de tratamentos que diminuem o desejo e, consequentemente, reduzir a vulnerabilidade para uma recaída. Graças ao modelo de reintegração do paradigma CPP, é possível estudar a influência de diferentes fatores ambientais e processuais que modulam a recaída, o que constitui uma prioridade de pesquisa futura. Existem alguns pontos importantes a considerar, como o paradigma do CPP é um teste altamente sensível a fatores ambientais.

Modificações e solução de problemas: A versão do CPP do modelo reintegração deve ser modificada dependendo da droga de interesse. Existem diversos fatores que podem influenciar a magnitude de preferência condicionada, tais como a duração e o número de sessões de condicionamento. O número de associações geralmente varia de um a seis, com quatro sendo o mais comum. A duração dos testes de condicionamento é estabelecida de acordo com as características da droga e sua farmacocinética.

Estudos CPP geralmente envolvem muitas provações, portanto é útil usar protocolos que reduzem o tempo necessário. Uma maneira de conseguir isso é reduzir o número de ensaios e a outra forma é realizar duas sessões de condicionamento por dia, como é mostrado no presente protocolo. Neste caso, é necessário assegurar que os efeitos da droga da sessão anterior não arrastar para esta segunda sessão39, é por isso que o intervalo de quatro horas entre a cocaína - sessão de veículo foi escolhido. Por exemplo, o timing do emparelhamento no caso de cocaína durante a fase de condicionamento deve ser a cada 24 h por 4 dias com uma duração de emparelhamento de 30 min. Pelo contrário, o curso do tempo do processo de condicionamento de etanol deve ser a cada 48h, um total de 8 dias, 1 sessão por dia, de condicionamento e finalmente alternando veículo e EtOH, tendo um total de 4 pares de EtOH. Emparelhamento de etanol deve ter uma curta duração, tais como 5 min, como mais tempo poderia produzir Estados aversive. Intervalo de doses eficazes de 1-2 g/kg e doses abaixo do limite são 0,75 g/kg40. Escorva induzido por reintegração deve ser metade da dose anterior que recebeu, e o aparelho deve ser o mesmo.

No entanto, escolhendo fazer 1 ou 2 sessões por dia pode afetar os resultados, em especiais drogas de abuso. Por exemplo, no caso induzida pela MDMA CPL com o protocolo de duas sessões, a preferência condicionada no pós-condicionamento não é observada, Considerando que isso pode ser obtido através da realização de uma única Associação cada dia30, então MDMA também deve ser administrado todos os 48 h, mas a duração da sessão de condicionamento deve ser 30 min.

Existem dois principais métodos de extinção que poderia ser executada após o estabelecimento do CPP, ou injeções diárias de veículo confinar o animal em ambos os anteriormente a droga e o veículo condicionado compartimentos41,42, 43, ou pela repetição do teste CPP, deixar os animais explorar os três compartimentos sem a guilhotina até preferência já não é observada a7,18,30,38. No presente protocolo, utilizamos o último, porque é um tipo de extinção espontânea sem qualquer manipulação farmacológica ou comportamental relacionada ao condicionamento (mais parecido com aquele ocorrendo em humanos viciados), mas ambos os métodos são aceitáveis e válido, como a literatura mostrou-se durante anos.

As limitações da técnica: A limitação mais importante do paradigma do CPP e o modelo de reintegração é que eles são muito sensíveis a qualquer mudança ambiental. Portanto, as condições do quarto e viveiro devem ficar estável e constante durante todo o processo. Deve ter especial cuidado para aspectos como vivendo no mesmo quarto com os companheiros do sexo oposto, gaiolas com artefatos como rodas que fazem um ruído constante e específico, ou condições de luz. Além de controlar estas variáveis, o papel do pesquisador é também crítico, como eles podem induzir a um aumento nos níveis de stress dos animais e interferir com os resultados.

Significado no que diz respeito a métodos existentes: Em relação a outros métodos, na versão do modelo de reintegração, CPP, o pesquisador é quem administra a droga para o animal, em contraste com os paradigmas de auto-administração que avaliam a motivação animal´s de tomar a droga. É importante que nós levamos isso em conta. Isto significa que não estamos avaliando motivação através de uma resposta operante, nem os efeitos de reforçados primários da droga. Como mencionado, o CPP é um modelo útil para avaliar o papel crítico que pistas ambientais desempenham na recaída em transtornos de abuso de substância, que na verdade são os principais fatores que modulam a recaída em seres humanos.

Aplicações de futuro: Futuras aplicações do modelo de reintegração de CPP devem ser orientadas para a incubação chamada de desejo, que consiste de um aumento progressivo na reatividade sugestão após a abstinência de drogas, imitando o desejo em seres humanos. Hoje em dia, pouco se sabe sobre isto no paradigma da CPP. Há alguns anos, apenas um estudo sugeriu que o CPP também poderia medir esse período de incubação44. Mais recentemente, apurou-se ou não pistas ambientais emparelhadas com morfina no CPP poderiam aumentar a resposta comportamental durante o período de retirada45. Este estudo constatou que o número de entradas para os compartimentos de CPP foram aumentando ao longo do tempo, refletindo a incubação de desejo e sugerindo que as memórias de recompensa e a ânsia da droga poderiam ser distinguidos no paradigma da CPP.

Passos críticos: existem vários passos críticos no protocolo. A fim de afirmar que os animais restabeleceu sua preferência, dados de extinção devem refletir uma verdadeira extinção da preferência, sendo confirmada antes do teste de reintegração. Dados de teste a extinção não devem mostrar diferenças em relação ao teste pré-C, mas em relação ao teste Post-C.

Em relação a versão de reintegração social induzida por estresse, deve confirmamos que o animal foi realmente derrotado, desde que um encontro social positivo que não termina em derrota mostra efeitos protectores, bloqueando a reinstauração do lugar preferência de cocaína. Se os animais experimentais não foram derrotados, eles serão excluídos do estudo. Recomendamos gravar e avaliar o encontro agonístico, medir a latência do comportamento agressivo ou comportamento de submissão, o número de ataques e o tempo gasto em cada um desses comportamentos. Consideramos que o animal experimental é derrotado, quando ele recebe um mínimo de 2 ataques (mordidas) e mostra sinais de submissão (conforme ilustrado na Figura 6). Em todos os casos, o encontro dura 10 min.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Ministério da saúde, serviços sociais e igualdade. Delegação do governo para o plano nacional sobre drogas, projetos de pesquisa sobre drogas dependências, 2014I007; Ministério da economia e competitividade (MINECO), Instituto de saúde Carlos III, rede de viciante transtornos (RTA) RD12 / 0028/0005 e RD16 / 17/07/00 e da União Europeia, FEDER fundos "una manera de hacer Europa" e PSI2014-51847-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MONPRE 2Z software CIBERTEC S.A., Spain N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area. CIBERTEC S.A., Spain N/A The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain Charles River, Barcelona Spain N/A Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014 Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415 45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g

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