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Reintegro de la búsqueda de drogas en ratones utilizando el paradigma de preferencia condicionada del lugar

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/56983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigación Psicobiología de las Drogodependencias, Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universitat de València

Summary

Este protocolo describe la preferencia de lugar condicionada (CPP) como un modelo de recaída. Este procedimiento permite la medición de la recaída en animales de laboratorio, considerando el impacto de señales ambientales asociada a drogas como ansias y recaída en absteniéndose de adictos es actualmente el foco de los programas de tratamiento de abuso de drogas.

Abstract

El presente Protocolo describe la preferencia de lugar condicionada (CPP) como un modelo de recaída en la adicción a las drogas. En este modelo, animales primero se entrenan para adquirir una preferencia de lugar condicionada en un compartimiento junto a drogas, y después de la prueba post acondicionado, realizan varias sesiones para extinguir la preferencia establecida. El CPP permite la evaluación de los efectos gratificantes condicionadas de señales ambientales relacionados con las drogas. Entonces, el CPP extinguido puede ser reintegrado enérgicamente por la administración no contingente de una dosis de cebado de la droga y por la exposición a estímulos estresantes. Ambos métodos se explicará aquí. Cuando el animal reinicie la respuesta conductual, un reintegro de la recompensa condicionada se considera que han tenido lugar.

Las principales ventajas de este protocolo están que es no invasivo, barato y sencillo con criterios de buena validez. Además, permite el estudio de diferentes manipulaciones ambientales, como el estrés o la dieta, que puede modular la recaída en drogas que buscan comportamientos. Sin embargo, una limitación es que si el investigador pretende explorar la motivación y efectos de refuerzo primarios de la droga, debe ser complementado con procedimientos de autoadministración, que implican respuestas operante de los animales.

Introduction

El paradigma de la preferencia de lugar condicionada (CPP) ofrece una forma simple de evaluar la recompensa condicionada inducida por diversos estímulos1,2y se ha utilizado ampliamente para el estudio de los efectos gratificantes condicionados de drogas adictivas3 . Se basa en acondicionamiento pavloviano, evaluar el valor motivacional de señales ambientales asociada a drogas para mantener el comportamiento adictivo4. En este modelo, señales ambientales adquieren propiedades secundarias apetitivo (efectos gratificantes acondicionados) cuando se combina con un reforzador primario3. Por ejemplo, un lugar inicialmente neutro (como el color de un compartimiento en la jaula CPP) se empareja con los efectos específicos de una droga de abuso durante algunos acondicionado sesiones5, mientras que el otro compartimiento se asocia con la inyección de un vehículo. Después acondicionado, si el animal pasa más tiempo en el compartimiento previamente asociado con la droga, se supone que el CPP ha desarrollado3. El establecimiento de la preferencia se logra cuando el animal da un valor positivo a las señales ambientales vinculadas a la droga, que es el reforzador primario. Por lo tanto, animales realizará respuestas conductuales que buscan droga en respuesta a las claves contextuales6. El modelo CPP permite la evaluación de las propiedades gratificantes de dosis subliminal de la droga, mostrando animales en una condición específica (por ejemplo, haber sufrido previamente de derrota social) sean más vulnerables y sensibles a las dosis que son no eficaz en ingenuos animales7.

El modelo CPP también ha sido utilizado para evaluar extinción/reintegro como modelo animal para el estudio de recidiva3, que es el objetivo del presente Protocolo. Hay tres diferentes fases: adquisición, extinción y restitución (figura 1). En el modelo de reintegración de CPP, animales primero adquieran el CPP para un compartimiento asociado de drogas, y luego realizan varias sesiones de extinción. Definimos la extinción como el momento en que el animal reduce sus respuestas conductuales de la aproximación a un estímulo condicionado de gratificante que ha sido eliminado (por ejemplo, la droga)8. Durante las sesiones de extinción, animales exploran los compartimientos en la ausencia de la droga, por lo que la preferencia adquirida es gradualmente atenuado9. Un tema importante a considerar es que el cambio de comportamiento que exhibe el animal en extinción (la disminución progresiva en el tiempo pasado en el compartimiento asociado de drogas) puede ser debido a nuevos procesos de aprendizaje que compiten con la anterior respuesta aprendida, o debido a una disminución en el estado motivacional interno del tema3. Por último, el restablecimiento de la preferencia de lugar a través de las claves de contexto o de la droga sería nuestro modelo de reintegro1.

Administrar una inyección de cebado de la droga asociada puede restablecer la preferencia, que se considera un reestablecimiento de la aproximación a las claves contextuales. Reintegro de cebado de drogas ocurre debido a la persistente memoria de los efectos placenteros de la droga, que inducido por antojo y motiva a los animales a buscar las señales ambientales relacionadas con la recompensa.

Algunas ventajas del modelo de reincorporación de CPP son que el procedimiento es no invasivo (en contraste con administración propia, que requiera cirugía), barato y simple. Además, este modelo tiene una validez de buen criterio, que imita bien a lo que ocurre en los seres humanos10,11, inducción de reintegro con los estímulos que inducen a la recaída, como exposición a las drogas12,13 o estrés14.

Hay otras técnicas como la extinción – modelo de reincorporación de autoadministración intravenosa. Aquí, animales presionar una palanca de autoadministrarse la droga, que permite la evaluación de la respuesta operante el animal, la compulsión y la motivación14,15,16. La principal ventaja de la CPP sobre procedimientos de autoadministración es que reintegro de CPP se considera que refleja la reactivación del valor del incentivo motivacional de los estímulos del contexto junto con la droga, consistente en la reaparición del enfoque comportamiento al contexto17. Por otra parte, estímulos no farmacológicos, como el estrés, también pueden inducir la reincorporación de18,19. Por ejemplo, un estudio de la administración propia había descrito ningún efecto sobre el reintegro de la ingesta de heroína en ratas después de un choque de pie o retención estrés20. Autores discuten que era fracasado porque los estresores fueron probados fuera de la cámara de administración propia en un contexto diferente. En cambio, cuando se utiliza el modelo CPP de reintegro, hubo un claro establecimiento de CPP inducida por morfina después de usar los mismos estresores y aplicado en un contexto diferente a la del CPP y en diferentes momentos (0 y 15 min después de la exposición de estrés)18 .

Varios estudios en la literatura han mostrado formas diferentes de fármacos y reintegro inducida por estrés. Por un lado, se ha divulgado reintegro droga-inducida en ratas y ratones utilizando morfina5,21,22,23, cocaína24,25, anfetamina26, 27, etanol28,29y30de 3, 4-metilenedioximetanfetamina (MDMA). Por otro lado, la exposición al estrés puede ser un factor determinante en la vulnerabilidad al abuso de drogas. El estrés es conocido por aumentar los efectos gratificantes de drogas7,31,32 y su papel en recaída es bien establecido33,34. Por ejemplo, derrota en las interacciones sociales con un coespecíficos reinstala la morfina y la cocaína CPP18,19. Además, animales expuestos a repetir derrota social son más vulnerables a los efectos gratificantes condicionados de subliminal dosis de cocaína y restablecer la preferencia con dosis muy bajas de cocaína7.

Aplicación del modelo de reincorporación de CPP es una manera útil y sensible para evaluar la vulnerabilidad a la recaída en los animales y permite la evaluación de diferentes manipulaciones ambientales sutiles, que son los principales disparadores que amenazan recaída humana, tales como reinstalación de Medicamentoso o estrés.

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Protocol

Todos los procedimientos que implica su cuidado y ratones el cumplimiento de las leyes nacionales, regionales y locales y regulaciones, que están de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de septiembre de 2010 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. El uso de animales y el Comité de atención de la Universidad de Valencia aprobaron el presente Protocolo.

1. materiales y configuración de preferencia de lugar condicionada:

  1. Manejar ratones 3 días antes de la prueba de 1-2 minutos cada uno. La base de la cola debe ser comprendida. El cuerpo debe estar apoyado si es posible. Esto se hace para minimizar el dolor y el malestar al manipular un animal y para evitar que las variables que interfieren, tales como estrés.
    Nota: De ratones machos 1 60 días de edad (adultos jóvenes) con 35-40 g de peso se emplearon en los presentes experimentos. Puede realizar reintegro droga-inducida en ratones de ambos sexos. Sin embargo, sobre reintegro de inducida por el estrés, el paradigma social derrota está diseñado sólo para roedores machos, como hembras no inducen una respuesta agresiva en los ratones residente.
  2. Para el acondicionamiento del lugar, utilice cajas idénticas hechas con dos compartimientos idénticos (30,7 cm largo 31,5 cm ancho × alto 34,5 cm) separados por un área gris central más pequeño (13,8 largo 31,5 cm ancho × 34,5 alto).
    Nota: Los compartimientos tienen piso diferentes texturas y colores de la pared (un piso liso en el compartimiento negro y un suelo áspero en el blanco). Cada compartimiento de la caja CPP contiene cuatro haces de luz infrarrojas y seis en el compartimento central. Esto permite la grabación de los cruces entre compartimentos y la posición del animal.
  3. Situado encima de las luces de la habitación (apagadas o bajadas) cada día. Usar luces rojas (recomendadas), como los animales no lo perciben y se atenúa por el experimentador (aproximadamente 40 lux medido a 1 m sobre el nivel del piso).
  4. Configurar el programa para registrar a 15 min de acondicionamiento pre y post prueba (véase la Tabla de materiales para software) (figura 2)
  5. Preparar la solución de cocaína necesaria para el experimento entero. Disolver el clorhidrato de cocaína en 0.9% NaCl (solución salina) en un volumen de 0,1 mL/10 g de peso corporal. Mezcla de vórtice y conservar a 4 ° C al final del día.
    Nota: Las concentraciones de cocaína pueden variar dependiendo del propósito del estudio. Si el objetivo es evaluar las dosis subliminal de la cocaína, podría usarse una concentración de 1 mg/kg, que es ineficaz en los animales de control, como se ha visto en anteriores estudios24,35. Si una dosis efectiva es el propósito, una concentración de 6 mg/kg puede ser elegido, que es efectiva pero no induce reintegro24, o una concentración de 25 mg/kg, que es eficaz e induce la reinstalación de preferencia19.
  6. Los animales de prueba durante la fase oscura y utilice la misma caja para cada animal en días.
  7. Traer animales todos los días a la sala de pruebas en sus jaulas hogar y dejarlos inalterados durante 15 min como un periodo de habituación a todos los sonidos relacionados con la prueba.

2. prueba

  1. Adquisición
    Nota: El procedimiento del lugar acondicionado, imparcial en cuanto a la preferencia espontánea inicial, consta de tres etapas: acondicionamiento previo, acondicionamiento y condicionamiento posterior (figura 1).
    1. Acondicionamiento previo (Pre-C) (3 días) (figura 2, figura 3, figura 4)
      Nota: Aquí se evalúa el valor neutro de los compartimientos en el cuadro de CPP. Medir el tiempo empleado en cada compartimiento y después compararlo con el pasó en el mismo compartimiento en la prueba post acondicionado.
      1. Llevar los animales a la sala de ensayo y dejar habituado durante 15 minutos.
      2. Compruebe que las guillotinas se quitan de la jaula.
      3. Configurar la computadora y el programa. Introduzca animales ID y pulse el "Juicio" y "Start" comando (figura 2).
      4. Coloque el ratón suavemente en la cámara intermedia (compartimiento gris) y dejar el cuarto de prueba con mínimo ruido.
      5. Poner todos los animales en sus jaulas hogar y guardar los datos cuando se termine el juicio.
      6. Permiten ratones a ambos compartimientos del aparato durante 15 minutos (900 s) por día durante 3 días consecutivos.
      7. El día 3, anote el tiempo empleado en cada compartimento durante un período de s 900 y guárdelo para la asignación de compartimientos en la siguiente fase (figura 3).
      8. Asignar la mitad de los animales en cada grupo para recibir el medicamento o el vehículo en un compartimiento (por ejemplo, negro) y la otra mitad en el otro compartimiento (por ejemplo, blanco) (figura 4).
        Nota: La distribución final de los animales debe asegurarse de que la mitad de los animales se asignan en el compartimiento inicialmente preferido y la otra mitad del compartimiento no-preferidas. Además, la mitad de los animales recibió la droga en un compartimiento (por ejemplo, el uno negro) y la otra mitad en el otro (en este caso, el uno blanco).
      9. Cuentas de balance en el grupo en ambos compartimientos, así como a través de grupos (prueba de diferencias de grupos con un análisis de varianza (ANOVA)). Como guía aproximada, los valores deben ser alrededor de 360-370 s en la prueba Pre-C (figura 4). Nota: no debe detectarse ninguna diferencia significativa entre el tiempo empleado en los compartimientos emparejado de droga y vehículo junto durante la prueba Pre-C.
      10. Excluir a los animales que presentan una fuerte aversión o preferencia de cualquier compartimiento. Considerar aversión como pasar menos tiempo que el 33% en el compartimiento y considerar la preferencia cuando el animal pasó más de un 67% del tiempo total en eso compartimiento.
    2. Acondicionado (4 días) (figura 5)
      1. Pesan los animales y estos pesos para dosis de cocaína durante el acondicionado.
      2. Preparar las jeringuillas con cocaína o solución salina basada en peso corporal.
      3. Inyectar un ratón a la vez por vía intraperitoneal (ip) e inmediatamente colóquelo suavemente en el compartimiento asignado de negro o blanco de su caja.
      4. Después de un intervalo de 4 h, inyectar la dosis de la droga inmediatamente antes de que el ratón se limita al compartimiento asociado de drogas por 30 min (figura 5).
      5. Alterne este procedimiento cada día, comenzando con la cocaína en los días 1 y 3 y solución salinos los días 2 y 4.
      6. Asegúrese de confinamiento se lleva a cabo en ambos casos por el cierre de la puerta de guillotina que separa los dos compartimientos, haciendo inaccesible la zona central.
        Nota: En esta fase, no hay para configurar el programa de PC.
    3. Acondicionado después (Post-C) (1 día)
      1. Llevar los animales a la sala de ensayo y dejar habituado durante 15 minutos.
      2. Retire la puerta de guillotina separa los dos compartimientos.
      3. Configurar la computadora y el programa. Introduzca animales ID y pulse el comando "start".
      4. Registrar el tiempo empleado por los ratones no tratados en cada compartimento durante un período de observación s 900.
      5. Cuando termine el juicio, recuperar todos los animales en sus jaulas hogar y guardar los datos.
      6. Consideran que la droga ha inducido a preferencia de lugar si el tiempo empleado en el compartimiento asociado de drogas durante el Post-C es significativamente mayor que en la prueba Pre-C. Si ocurre lo contrario, considere una aversión para el compartimiento asociado de drogas.
  2. Extinción
    1. Realizar una sesión semanal de extinción en todos los grupos/animales que desarrollaron una preferencia por el compartimiento asociado de drogas.
    2. Coloque el animal en el aparato (sin guillotinas) durante 15 minutos (igual que las pruebas previas y Post-C) (figura 1).
      Nota: Si la dosis empleada en el CPP es alta (25 mg/kg), realizar 1 sesión de extinción por semana. Si una dosis subliminal es usado (1 mg/kg), luego realizar 2 sesiones de extinción por semana (por ejemplo el lunes y el jueves).
    3. Considerar la preferencia extinguida cuando los datos de la prueba de extinción no muestran diferencias significativas con respecto a la prueba de Pre-C, pero muestran diferencias con respecto a la prueba de Post-C.
    4. Repita la prueba de 24 h más tarde para confirmar la extinción.
  3. Reintegro de CPP
    1. Reintegro de cebado-inducida
      1. Evaluar los efectos de una dosis de cebado de cocaína 24 h después de extinción ha sido confirmada.
        Nota: Dosis de cebado son mitad de la dosis anterior que ha recibido el animal durante el acondicionado. El mismo protocolo como en C Pre y Post-C pruebas somete a la prueba de reintegro, salvo que los animales reciban la dosis de cocaína en un no-contingente lugar 15 min antes del examen. Puede mejorarse la eficacia de cebado de drogas en la inducción de reintegro después de extinción/reintegro repetida experiencias de23, aunque el orden de las dosis no parece jugar un papel en los resultados obtenidos36.
      2. Llevar los animales a otra habitación de la sala de ensayo (lugar no contingentes) (figura 6).
      3. Inyectar con la mitad de la dosis anterior de la cocaína (por ejemplo, si los animales se acondicionaron con 25 mg/kg de cocaína, una dosis de cebado sería 12.5 mg/kg).
      4. Traer de vuelta a su vivero durante 15 minutos.
      5. Tenerlas en el cuarto de prueba y colocar los animales en el aparato inmediatamente (sin las puertas de guillotina separa los compartimientos) durante 15 minutos (igual que el pre- y Post-C pruebas).
      6. Considerar la diferencia en segundos entre el tiempo empleado en el compartimiento asociado de drogas durante la última sesión de extinción y la prueba de restablecimiento como una medida del grado de restablecimiento de la preferencia inducida por la droga.
      7. Repita el procedimiento de reintegro de extinción cada vez con la disminución de dosis hasta que se confirma para ser ineficaz.
        Nota: Un control de la inyección de solución salina puede utilizarse para controlar la capacidad de cebado de la cocaína (y no de la inyección de sí mismo) para inducir el reintegro.
    2. Reintegro inducida por estrés
      1. Evaluar los efectos de un reintegro de estrés 24 h después de extinción ha sido confirmada
        Nota: Pruebas de reposición son las mismas que las llevadas a cabo en el Post-C (deambulación libre durante 15 minutos), salvo que los animales son probados 15 min después de la derrota social en un agónico encuentro (figura 6)
      2. Llevar los animales a otra habitación de la sala de CPP.
      3. Coloque el ratón experimental con un agresivo sexo oponente comparable de igual edad y peso corporal en la jaula de plástico (figura 6).
        Nota: El agónico encuentro consiste en una prueba de 10 minutos en una jaula plástica transparente neutro (23x13.5x13cm) con un resultado de derrota para el ratón experimental. Para preparar al oponente agresivo, primero aislar diversos animales que coinciden en edad y peso corporal como los ratones experimentales durante 3 semanas. Entrenarlos para adquirir la experiencia de lucha y prueba de ellos para tener altos niveles de comportamiento agresivo territorial. Para obtener sus congéneres agresivos, ratones deben ser aislados por al menos 3 semanas y entonces entrenados en agresivo y atacar a comportamientos. Entrenan a los animales en un medio neutro, frente a ellos en pares. Dejamos que muerden los tiempos oponente 2 o 3 y sacarlos de la jaula, siempre terminando el entrenamiento antes de que uno de los dos ratones demuestra sumisión, para que la experiencia del encuentro refuerza el comportamiento agresivo. Después de sufrir la agresión (amenaza y ataque de coespecíficos agresivos), ratones experimentales presente evitar/huir y comportamiento defensivo/sumiso. El criterio es adoptar una postura concreta de la derrota, caracterizada por una posición sumisa, cojera patas delanteras, cabeza inclinada hacia arriba y orejas (figura 6) retractó. Según Burke et al., 2016, consideramos que el encuentro social se termina antes si el intruso muestra una sumisa postura supina para > 8 s o si ocurrieron 13 mordeduras de ataque. Otra opción a los animales de la pantalla sin riesgo de lesión significativa podría ser el animal en una caja de acoplamiento con un agujero, no lo suficientemente grande como para cualquier animal pasar el ritmo.  Agresión podría detectarse sin someter animales para dirigir el comportamiento agresivo.  Si un animal sostiene una lesión con una herida de 1cm de diámetro o exposición directa del músculo, se excluyeron del estudio y deben ser sacrificado.
      4. Después de 10 minutos de encuentro agonístico, tomar los ratones en el cuarto de prueba y colocar los animales en el aparato CPP inmediato (sin las puertas de guillotina separa los compartimientos) durante 15 minutos (igual que el pre- y Post-C pruebas).

3. estadístico análisis

Nota: Tamaño de la muestra Ideal debe tener un mínimo de 15 animales por grupo.

  1. Analizar el tiempo medio pasado en el compartimiento asociado de drogas del grupo por medio de un ANOVA mixto con uno entre la variable tratamiento, con dos niveles (grupo Control, Grupo Experimental, ejemplo de dos grupos es en la figura 7 c) y en un plazo variable, días, con 2 niveles (C Pre y Post-C).
    Nota: En el grupo control, animales reciben la droga pero no tienen manipulaciones ambientales. Por otra parte, en el grupo experimental los animales están expuestos a diferentes condiciones ambientales. Comparar el tiempo pasado en el compartimiento asociado de drogas en el día Post-C con respecto al Pre-C prueba a ver si hay diferencias significativas en la sensibilidad a la droga.
  2. Además, realizar análisis post-hoc de Bonferroni para comprobar cualquiera de los puntos importantes.
  3. Analizar los datos relacionados con la extinción y restablecimiento de valores en los grupos que preferencia desarrollado mediante pruebas de t de Student´s para continuar con el procedimiento de reintegro de extinción durante el curso del experimento, pero en el momento final, analizarlas con un ANOVA con un plazo variable (días) con el número de niveles dependiendo de cada grupo.
    Nota: Cuando se incrementa el número de comparaciones, el número de los que será importante por casualidad también aumentó. Como tal, para evitar falsos positivos (errores de tipo 1) que 'corregir' el valor de p para la prueba más conservador con la corrección de Bonferroni de varias pruebas de t. Sin embargo, para el examen de reincorporación, la comparación debe hacerse entre el reintegro y la última prueba de extinción. Por lo tanto, no es necesario para la corrección.

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Representative Results

En primer lugar, resultados representativos de la reincorporación de inducida por el estrés y el cebado se muestran en la figura 7 con adultos ratones machos OF1.

Los datos en la figura 7a-b que representa el tiempo pasaron en el compartment(s) vinculado a drogas en el pre y Post-C prueba se analizaron con una medidas repetidas ANOVA con día variable dentro de temas (comparando Pre- y Post-C). Los resultados mostraron un efecto significativo de los variable días [F(1,34) = 51.179; p < 0.001], como todos los animales desarrollaron una preferencia en el día Post-C en comparación con el Pre-C. Todos los animales se acondicionaron con 25 mg/kg de cocaína y se logró la extinción, un grupo recibió una dosis de cebado de 12,5 mg/kg de cocaína para probar el reintegro (Figura 7a) y el otro fue sometido a una interacción social en el que el experimental animal fue derrotado por un oponente agresivo (figura 7b). 15 minutos después de los dos eventos, los animales fueron probados en su correspondiente caja CPP.

El reintegro de cebado-inducida (Figura 7a) fue sometido a posterior disminuyendo dosis de cebado (mitad anterior uno) hasta una dosis de cebado está confirmado para ser ineficaz. Las dosis fueron: cocaína 1,56 mg/kg, 12.5, 6.25 y 3.125. La prueba de t de Student´s reveló un efecto significativo sobre el reintegro de la cocaína de 12,5 mg/kg con respecto a la sesión de extinción (estadística t (t) = 20.589, grados de libertad (DF) = 17; p < 0,001) y las dosis subsecuentes (6,25 mg/kg: t = 18.356; 3,125 mg/kg: t = 14.260; 1,56 mg/kg: t = 16.934 d.f. = 17; p < 0.001). Cebado con 0,78 mg/kg no indujo el reintegro.

Con respecto a la reincorporación de inducida por el estrés (ver figura 7b), están expuesto a un animal agresivo y derrotó 15 min antes de la prueba conduce al restablecer la preferencia previamente extinguida (t = 26.810; d.f. = 15; p < 0.001)19 .

Otras manipulaciones ambientales, tales como sufrir repetida derrota social antes del procedimiento CPP, modifican los efectos gratificantes de subliminal dosis de cocaína (figura 7 c). A mixtos de ANOVA con el entre variable "estrés" y dentro de la variable "días" se llevó a cabo, y hubo un efecto significativo de la interacción tensión x días [F(1,29) = 4.144; p < 0.05]. Animales socialmente derrotados exhiben preferencia por el compartimiento de drogas junto con una dosis subliminal de cocaína, que ha demostrado ser ineficaz en animales estándar7. Además, después de la extinción de la preferencia, animales socialmente derrotados reintegrado su preferencia con único cargado de cocaína de 0.5 mg/kg (t = 25.484 d.f. = 17; p < 0.001).

En segundo lugar, como un resultado negativo, podemos ver cómo reintegro puede prevenirse mediante una interacción social positiva con una no agresiva coespecíficos (figura 8a). Por lo tanto, es importante evaluar si los animales son derrotados o no después de un social encuentran37.

Otro ejemplo de resultados negativos que impiden reinstalación puede ser manipulaciones nutricionales, como la ingesta de una dieta palatable de alto contenido de grasa. En primer lugar, el análisis de ANOVA reveló un efecto de los variable días [F(1,26) = 21.527; p <.0.001], ya que ambos grupos desarrollaron preferencia por el compartimiento asociado de drogas (p < 0,01) (figura 8b). Después de la extinción, nuestros resultados demuestran que animales cambiados a la dieta alta en grasas después de la prueba Post-C disminuido su sensibilidad a reintegro inducido droga-cebado, como no restablecer la preferencia con una cocaína de 6,25 mg/kg dosis38.

Figure 1
Figura 1: procedimiento Experimental de la preferencia de lugar condicionada. Consta de tres etapas: acondicionamiento previo, acondicionamiento y posterior condicionamiento. Hay 4 días de acondicionamiento en la que el procedimiento se alterna cada día, comenzando con la cocaína en los días 1 y 3 y con el vehículo en los días 2 y 4. Luego, se realizan sesiones de extinción y restablecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: sesiones de uso de Software para las pruebas de Pre- y Post-C donde el tiempo en cada compartimiento y se registra el número de entradas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: datos después de la prueba Pre- y Post-C Aquí, registrar los datos obtenidos durante la prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: asignación imparcial de los animales en los compartimientos para la siguiente fase de condicionamiento. Tomar los datos de la última jornada de la prueba Pre-C en los compartimientos del blancos y negros. Mitad de los animales es asignada a recibir el medicamento o vehículo en un compartimiento (negro o blanco) y la otra mitad en el otro compartimento. Excluir a los animales que muestran fuerte aversión o preferencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Final asignación de vehículos y cocaína emparejado sesiones. Esta figura muestra alternancia del orden de los emparejamientos. En los días 1 y 3, un animal (por ejemplo, 1.1) es la primera exposición del compartimiento de cocaína emparejado (uno blanco) y, después de cuatro horas, se expone al compartimiento del vehículo vinculado (uno negro). En los días 2 y 4, se invierte el orden de emparejamientos, y el animal se expone primero al vehículo vinculado compartimiento (negro) y, después de cuatro horas, en el compartimento (blanco) cocaína junto. Como este procedimiento es imparcial y pueden llevarse a cabo sesiones de acondicionado contrapesada, simultánea con dos animales usando ambos compartimientos de la caja del mismo (p. ej., animales 1.1 y 2.4, 3.1 y 1.3), que nos permite reducir el tiempo dedicado a la procedimiento experimental. Tenga en cuenta que estos pares de animales sigan el orden inverso de emparejamientos a través de la fase de condicionamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: dos modelos de reintegro. (a) reintegro de cebado-inducida y reintegro inducida por estrés (b). (a) animales reciben una inyección de la droga en una habitación no contingentes y son llevados al vivero; 15 min más tarde se prueban en el cuadro de CPP. (b) animales se derrotaron en un agónico encuentro en una habitación no contingentes durante 10 minutos y, luego, se prueban en el cuadro de CPP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: resultados positivos representante. Cebado (una) y reposición inducida por estrés (b) después de 25 mg/kg cocaína CPP. (c) efectos de la derrota social sobre los efectos gratificantes de subliminal dosis de cocaína (1 mg/kg). Las barras representan la media (± SEM) de tiempo en segundos que pasó en el compartimiento asociado de drogas durante el acondicionamiento previo (blanco), acondicionado posterior (negro), la última sesión de extinción (gris claro) y reintegro (gris oscuro). La prueba de reintegro fue evaluada 15 min después de una dosis de cebado de la mitad de la dosis anterior recibida. * p < 0.05; ** p < 0.01; p < 0,001 diferencia significativa vs Pre-C (ANOVA con un en-temas días variable (comparación Pre- y Post-C) o la sesión de extinción anterior (prueba de t de Student). Estas cifras se han modificado de 7,19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: resultados negativos representante. Efectos de la protección ambientales manipulaciones en los efectos gratificantes de la cocaína. (a) efectos de una interacción social positiva antes de la reinstalación de prueba. (b) efectos de una dieta alta en grasas durante el periodo de extinción todo y reintegro. El grupo de control fue alimentado con una dieta estándar (13% de kcal de grasa, 67% kcal de carbohidratos y 20% kcal de proteína; total 2,9 kcal/g) y el grupo de dieta alta en grasa (45% kcal de grasa, 36% kcal de hidratos de carbono y 19% kcal de proteína; 4,6 total kcal/g). Las barras representan la media (± SEM) de tiempo en segundos que pasó en el compartimiento asociado de drogas durante el acondicionamiento previo (blanco), acondicionado posterior (negro), la última sesión de extinción (gris claro) y reintegro (gris oscuro). La prueba de reintegro fue evaluada 15 min después de una dosis de cebado de la mitad de la dosis recibida anterior. * p < 0.05; ** p < 0.01; diferencia significativa vs Pre-C (ANOVA con un en-temas días variable (comparación Pre- y Post-C) o la sesión de extinción anterior (prueba de t de Student). Estas cifras se han modificado de 37,38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El punto clave de la investigación de la adicción a la droga es el desarrollo de tratamientos que disminuyen el deseo y, en consecuencia, reducir la vulnerabilidad a la recaída. Gracias al modelo de reposición del paradigma CPP, es posible estudiar la influencia de diversos factores ambientales y de procedimientos que modulan la recaída, que es una prioridad de investigación futura. Hay algunos puntos importantes a considerar, como el paradigma de la CPP es una prueba que es altamente sensible a factores ambientales.

Modificaciones y resolución de problemas: La versión CPP del modelo reintegro debería modificarse dependiendo de la droga de interés. Hay diversos factores que influyen en la magnitud de la preferencia condicionada, como la duración y el número de sesiones de acondicionamiento. El número de asociaciones generalmente oscila de uno a seis, con cuatro es el más común. La duración de las pruebas de acondicionamiento se establece según las características del fármaco y su farmacocinética.

CPP estudios generalmente implican muchos ensayos, por lo que es útil usar protocolos que reducen el tiempo requerido. Una forma de lograrlo es reducir el número de ensayos y otra forma es realizar dos sesiones de condicionamiento al día, como se muestra en el presente Protocolo. En este caso, es necesario asegurarse de que los efectos de la droga de la sesión anterior no Arrastre esta segunda sesión39, razón por la cual el intervalo de cuatro horas entre la cocaína - sesión de vehículo fue elegido. Por ejemplo, el momento de la vinculación en el caso de la cocaína durante la fase de condicionamiento debe ser cada 24 h durante 4 días con una duración de sincronización de 30 minutos. Por el contrario, el curso del tiempo el procedimiento de acondicionamiento de etanol debe ser cada 48 h, un total de 8 días, 1 sesión por día, de acondicionamiento y alternando vehículo y EtOH, teniendo finalmente un total de 4 parejas de EtOH. Emparejamiento de etanol debe tener una duración corta, como 5 min, como más tiempo podría producir Estados aversivos. Las dosis eficaces oscilan entre 1-2 g/kg y dosis subliminal son 0.75 g/kg40. Reintegro de cebado-inducida debe ser mitad de la dosis anterior recibida, y el aparato debe ser el mismo.

Sin embargo, elegir hacer 1 o 2 sesiones al día puede afectar los resultados en algunas drogas especiales. Por ejemplo, en el caso del CPL de MDMA-inducido con el protocolo de dos sesiones, la preferencia condicionada en el acondicionamiento posterior no se observa, mientras que esto puede obtenerse mediante la realización de una sola Asociación cada día30, por lo que también debe ser administrada MDMA cada 48 h, pero la duración de la sesión de acondicionamiento debe ser 30 minutos.

Hay dos métodos principales de extinción que podría funcionar después del establecimiento del CPP, ya sea inyecciones diarias del vehículo el confinamiento de los animales en el vehículo y droga previamente acondicionado compartimientos41,42, 43, o mediante la repetición de la prueba CPP, dejando que los animales a explorar los tres compartimientos sin la guillotina hasta preferencia ya no se observa7,18,30,38. En el presente Protocolo, empleamos este último, porque es un tipo de extinción espontánea sin ninguna manipulación farmacológica o de comportamiento relacionados con a acondicionado (más similar al que ocurre en humanos adictos), pero ambos métodos son aceptables y válidos, como la literatura ha demostrado durante años.

Limitaciones de la técnica: La limitación más importante del paradigma de la CPP y el modelo de reintegración es que son muy sensibles a cualquier cambio ambiental. Por lo tanto, las condiciones de habitación y vivero deben permanecer estable y constante durante todo el procedimiento. Debe tenerse especial cuidado en aspectos tales como vivir en la misma habitación con compañeros del sexo opuesto, jaulas con artefactos como las ruedas que hacen un ruido específico y constante, o las condiciones de luz. Además de controlar estas variables, el papel del investigador es también crítico, ya que pueden inducir un aumento en los niveles de estrés de los animales y alterar los resultados.

Significado con respecto a los métodos existentes: Con respecto a otros métodos, en la versión CPP de la modelo de reintegro, el investigador es el que administra el medicamento a los animales, a diferencia de los paradigmas de administración propia que evaluar la motivación de animal´s tomar el medicamento. Es importante que tomemos esto en cuenta. Esto significa que no estamos evaluando la motivación a través de una respuesta operante ni los efectos de refuerzo primarios de la droga. Como mencionamos, el CPP es un modelo útil para evaluar el papel fundamental que jugar en señales ambientales en recaída en los trastornos de abuso de sustancias, que de hecho son los principales factores que modulan la recaída en seres humanos.

Aplicaciones de futuro: Futuras aplicaciones del modelo CPP reintegro deberán estar orientadas a la incubación llamada de deseo, que consiste en un aumento progresivo en la reactividad localización después de la abstinencia de drogas, mímico el deseo en los seres humanos. En la actualidad, poco se sabe acerca de esto en el paradigma del CPP. Hace unos pocos años, sólo un estudio sugirió que el CPP también podría medir este período de incubación44. Más recientemente, se evaluó o no señales ambientales junto a la morfina en el CPP podrían aumentar la respuesta conductual durante el período de retiro45. Este estudio encontró que el número de entradas en los compartimientos de CPP fueron aumentando con el tiempo, reflejando la incubación de antojo y sugiriendo que recuerdos de recompensa y ansia de droga podían distinguirse en el paradigma del CPP.

Pasos críticos: hay varios pasos críticos en el protocolo. Para afirmar que animales reintegrados sus preferencias, datos de extinción deben reflejar una verdadera extinción de la preferencia, siendo confirmada antes la prueba de reposición. Datos de la prueba de extinción no deben presentar diferencias con respecto a la prueba de Pre-C pero con respecto a la prueba de Post-C.

Con respecto a la versión de reintegro social provocada por el estrés, nos deberíamos han confirmado que el animal ha sido realmente derrotado, puesto que un encuentro social positivo que no termina en la derrota demuestra efectos protectores bloqueando el reintegro del lugar preferencia de cocaína. Si los animales experimentales no han sido derrotados, se excluirán del estudio. Le recomendamos registrar y evaluar el encuentro agonístico, medición de la latencia de la conducta agresiva o comportamiento de sumisión, el número de ataques y el tiempo empleado en cada uno de esos comportamientos. Consideramos que el animal experimental es derrotado cuando se recibe un mínimo de 2 ataques (picaduras) y muestra signos de sumisión (como se ilustra en la figura 6). En todos los casos, el encuentro dura 10 minutos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Ministerio de sanidad, servicios sociales e igualdad. Delegación del gobierno para el Plan Nacional sobre drogas, proyectos de investigación en Toxicomanías, 2014I007; Ministerio de economía y competitividad (MINECO), Instituto de Salud Carlos III, red de adictivos (RTA) los trastornos RD12 / 0028/0005 y RD16 / 17/07/00 y la Unión Europea, FEDER fondos "una manera de hacer Europa" y PSI2014-51847-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MONPRE 2Z software CIBERTEC S.A., Spain N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area. CIBERTEC S.A., Spain N/A The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain Charles River, Barcelona Spain N/A Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014 Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415 45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g

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Comportamiento número 136 acondicionado lugar preferencia cocaína reintegro estrés ratones drogas en la búsqueda
Reintegro de la búsqueda de drogas en ratones utilizando el paradigma de preferencia condicionada del lugar
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