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Reintegrazione di droga in Cerca nei topi utilizzando il paradigma di Conditioned Place Preference

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/56983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigación Psicobiología de las Drogodependencias, Departamento de Psicobiología, Facultad de Psicología, Universitat de València

Summary

Questo protocollo descrive la preferenza di posto condizionata (CPP) come modello di ricaduta. Questa procedura permette di misurare di ricaduta in animali da laboratorio, considerando l'impatto della droga-collegato di stimoli ambientali come desiderio e ricaduta nelle persone dedite di astensione è attualmente al centro dei programmi di trattamento di abuso di droga.

Abstract

Il presente protocollo descrive la preferenza di posto condizionata (CPP) come modello di ricaduta nella tossicodipendenza. In questo modello, gli animali sono addestrati prima di acquisire una preferenza di posto condizionata in un vano di droga-accoppiato, e dopo il test post-condizionata, eseguono diverse sessioni per estinguere la preferenza stabilita. Il CPP consente la valutazione degli effetti gratificanti condizionati dei suggerimenti relativi alla tutela dell'ambiente da farmaci. Quindi, l'estinto CPP può essere ripristinato robustamente dall'amministrazione non contingente di una dose di innesco della droga e dall'esposizione a stimoli stressanti. Entrambi i metodi verranno spiegati qui. Quando l'animale reinitiates la risposta comportamentale, è considerato una reintegrazione della ricompensa condizionata hanno avuto luogo.

I principali vantaggi di questo protocollo sono che è non invasivo, poco costoso e semplice con criteri di buona validità. Inoltre, permette lo studio di diverse manipolazioni ambientali, come lo stress o la dieta, che possa modulare la ricaduta nella droga che cercano di comportamenti. Tuttavia, una limitazione è che, se il ricercatore si propone di esplorare la motivazione ed effetti di rinforzo primari del farmaco, deve essere completato con le procedure di auto-amministrazione, quanto coinvolgono operante risposte degli animali.

Introduction

Il paradigma di Conditioned Place Preference (CPP) offre un modo semplice per valutare la ricompensa condizionata indotta da stimoli diversi1,2ed è stato usato largamente per studiare gli effetti gratificanti condizionati di droghe d'abuso3 . Si basa sul condizionamento pavloviano, valutando il valore motivazionale della droga-collegato di stimoli ambientali per il mantenimento di comportamenti di dipendenza4. In questo modello, stimoli ambientali acquisiscono proprietà secondaria appetitiva (effetti gratificanti condizionati) quando accoppiato con un rinforzo primario3. Ad esempio, un posto inizialmente neutro (ad esempio il colore di uno scomparto nella gabbia CPP) è accoppiato con gli specifici effetti di una droga di abuso durante alcune condizionata sessioni5, mentre un altro vano è associato con l'iniezione di un veicolo. Seguito, condizionata, se l'animale passa più tempo nel vano precedentemente connesso con la droga, si presume che il CPP ha sviluppato3. L'istituzione della preferenza è raggiunta quando l'animale dà un valore positivo per gli stimoli ambientali legati alla droga, che è il rinforzo primario. Di conseguenza, gli animali si esibiranno risposte comportamentali di droga in Cerca in risposta a tali indizi contestuali6. Il modello CPP consente la valutazione delle proprietà gratificanti di sottosoglia dosi del farmaco, indicando se gli animali in una condizione specifica (ad esempio, dopo aver sofferto in precedenza di sconfitta sociale) sono più vulnerabili e sensibili alle dosi che sono non è efficace nel ingenuo animali7.

Il modello CPP è stato utilizzato anche per valutare l'estinzione/reintegrazione come modello animale per studiare la ricaduta3, che è l'obiettivo del presente protocollo. Ci sono tre diverse fasi: acquisizione, estinzione e reintegrazione (Figura 1). Nel modello di reintegrazione CPP, animali prima acquisiscono il CPP per un raggruppamento di droga-accoppiato, e poi si eseguono diverse sessioni di estinzione. Definiamo estinzione come il momento in cui l'animale riduce le risposte comportamentali di approssimazione ad uno stimolo condizionato gratificante che è stato rimosso (ad esempio, la droga)8. Durante le sessioni di estinzione, animali esplorare i compartimenti in assenza del farmaco, in modo che la preferenza acquisita è gradualmente attenuati9. Una questione importante da considerare è che il cambiamento comportamentale che l'animale si presenta durante l'estinzione (la diminuzione progressiva nel tempo trascorso nel vano di droga-accoppiato) può essere a causa di nuovi processi di apprendimento che competono con la precedente risposta istruita, o dovuto ad una diminuzione nello stato interno motivazionale del soggetto3. Infine, il ristabilimento della preferenza posto attraverso gli indizi di contesto o droga sarebbe il nostro modello di ripristino1.

Somministrare un'iniezione di adescamento del farmaco associato, è possibile ripristinare la preferenza, che è considerata un ristabilimento dell'approssimazione per gli indizi contestuali. Reintegrazione di adescamento del farmaco si verifica a causa della memoria persistente degli effetti piacevoli della droga, che ha indotto assetati e motiva gli animali a cercare gli stimoli ambientali legati alla ricompensa.

Alcuni vantaggi del modello reintegrazione CPP sono che la procedura sia non-invasiva (in contrasto con il self-administration, che richiede un intervento chirurgico), poco costoso e semplice. Inoltre, questo modello ha una validità di buon criterio, in quanto imita bene ciò che avviene in esseri umani10,11, inducendo la reintegrazione con gli stimoli che inducono la ricaduta, come ri-esposizione al farmaco12,13 o 14di sforzo.

Ci sono altre tecniche come l'estinzione – modello di reintegrazione di autosomministrazione endovenosa. Qui, gli animali premere una leva per amministrare la droga, che permette la valutazione della risposta dell'operatore dell'animale, compulsività e motivazione14,15,16. Il vantaggio principale del CPP rispetto alle procedure di auto-amministrazione è che la reintegrazione di CPP è considerato per riflettere la riattivazione del valore incentivo-motivazionale degli stimoli contesto accoppiato con la droga, che consiste della ricomparsa dell'approccio comportamento al contesto17. Inoltre, non-droga stimoli, quali stress, possono anche indurre la reintegrazione18,19. Ad esempio, uno studio di autosomministrazione non descritto effetti sul ripristino dell'assunzione dell'eroina in ratti dopo un piede scossa o ritenuta stress20. Autori hanno discusso che era infruttuoso, perché tali fattori di stress sono stati testati all'esterno della camera di autosomministrazione in un contesto diverso. Al contrario, quando si utilizza il modello CPP di reintegrazione, c'era un chiaro ristabilimento del CPP indotta da morfina dopo l'utilizzo di fattori di stress stessi e applicata in un contesto diverso a quello del CPP e in tempi diversi (0 e 15 min dopo lo stress di esposizione)18 .

Diversi studi in letteratura hanno dimostrato modi diversi di droga e reintegrazione indotta da stress. Da un lato, reintegrazione farmaco-indotta è stata segnalata in ratti ed in topi facendo uso di morfina5,21,22,23, cocaina24,25, anfetamina26, 27, etanolo28,29e30di 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA). D'altra parte, l'esposizione allo stress può essere un fattore determinante nella vulnerabilità all'abuso di droga. Lo stress è noto per aumentare gli effetti gratificanti della droga7,31,32 e il loro ruolo nella ricaduta è affermata33,34. Ad esempio, sconfitta nelle interazioni sociali con un conspecifico reintegra morfina e cocaina CPP18,19. Inoltre, gli animali esposti a ripetuta sconfitta sociale sono più vulnerabili agli effetti gratificanti condizionati di sottosoglia dosi di cocaina e ripristinare la preferenza con dosi molto basse di cocaina7.

Applicazione del modello reintegrazione CPP è un modo utile e sensibile per valutare la vulnerabilità alla ricaduta negli animali e permette la valutazione di diverse sottili manipolazioni ambientali, che sono i principali trigger che minacciano la ricaduta umana, come reintegrazione indotta da farmaci o stress.

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Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono topi e la loro cura osservanza di leggi nazionali, regionali e locali e i regolamenti, che sono in conformità con la direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010 sulla protezione degli animali utilizzati a fini fini scientifici. L'uso di animali e Comitato a cura dell'Università di Valencia ha approvato il presente protocollo.

1. materiali e set-up per Conditioned Place Preference:

  1. Gestire topi 3 giorni prima della prova per 1-2 minuti ciascuno. La base della coda dovrebbe essere afferrata. Il corpo dovrebbe essere sostenuto se possibile. Questo viene fatto per ridurre al minimo il dolore e l'angoscia quando si maneggia un animale ed evitare variabili interferenti, come lo stress.
    Nota: Di topo maschio 1 60 giorni di età (giovani adulti) 35-40 g di peso sono stati impiegati negli esperimenti attuali. Reintegrazione di droga-indotta può essere eseguita in topi di entrambi i sessi. Tuttavia, per quanto riguarda la reintegrazione indotta da stress, il paradigma di sconfitta sociale è progettato solo per roditori maschi, come fanno le femmine non inducono una risposta aggressiva nei topi residente.
  2. Per posto condizionata, utilizzare scatole identiche con due scomparti identici (30,7 cm long × 31,5 cm larghezza × 34,5 cm di altezza), separati da una zona grigia centrale più piccola (13,8 long × 31,5 centimetri di larghezza × 34,5 alta).
    Nota: Comparti hanno pavimento diverse texture e colori parete (un pavimento liscio nel vano di nero e un pavimento grezzo in quello bianco). Ogni vano della finestra di CPP contiene quattro fasci di luce infrarosse e sei nello scomparto centrale. Questo permette la registrazione degli incroci tra compartimenti e la posizione dell'animale.
  3. Impostare fino le luci della camera (off o abbassate) ogni giorno. Utilizzare luci rosse (consigliati), come gli animali non ve ne accorgete e si è attenuato per lo sperimentatore (circa 40 lux misurati a 1 m sopra il livello del pavimento).
  4. Impostare il programma per registrare 15 min per il condizionamento pre- e post-test (vedere la Tabella materiali per software) (Figura 2)
  5. Preparare la soluzione di cocaina richiesta per l'intero esperimento. Sciogliere il cloridrato di cocaina in 0,9% NaCl (soluzione fisiologica) in un volume di peso corporeo 0,1 mL/10 g. Miscela di vortice e conservare a 4 ° C alla fine della giornata.
    Nota: Concentrazioni di cocaina possono variare a seconda delle finalità dello studio. Se l'obiettivo è di valutare le dosi sottosoglia di cocaina, una concentrazione di 1 mg/kg potrebbe essere utilizzata, che è inefficace negli animali di controllo, come si è visto in precedenti studi24,35. Se una dose efficace è lo scopo, una concentrazione di 6 mg/kg può essere scelta, che è efficace, ma non induce la reintegrazione24, o una concentrazione di 25 mg/kg, che è efficace e induce la reintegrazione del preferenza19.
  6. Testare gli animali durante la loro fase scura e utilizzare la stessa casella per ogni animale in giorni.
  7. Portare animali ogni giorno per la sala di collaudo nelle loro gabbie casa e lasciarli indisturbati per 15 min come un periodo di assuefazione per tutti i rumori relative ai test.

2. test

  1. Acquisizione
    Nota: La procedura di condizionamento posto, imparziali in termini di preferenza spontanea iniziale, costituito da tre fasi: pre-condizionamento, condizionata e post-condizionata (Figura 1).
    1. Pre-condizionamento (Pre-C) (3 giorni) (nella figura 2, Figura 3, Figura 4)
      Nota: Qui, viene valutato il valore neutro dei compartimenti nella finestra di CPP. Misurare il tempo trascorso in ogni vano e poi confrontarlo con quello trascorso nello stesso contenitore del test post-condizionata.
      1. Portare gli animali per la camera di prova e lasciarli abituati per 15 min.
      2. Verifica che le ghigliottine vengono rimossi dalla gabbia.
      3. Impostare il computer e il programma. Inserisci animal ID e premere il comando di "Prova" e "Start" (Figura 2).
      4. Posizionare il mouse delicatamente in camera di mezzo (vano grigio) e lasciare la sala di collaudo con minimo rumore.
      5. Riportare tutti gli animali in gabbie usate per casa e salvare i dati quando il processo è finito.
      6. Consentire di topi per accedere a entrambi i compartimenti dell'apparato per 15 min (900 s) al giorno per 3 giorni consecutivi.
      7. Il giorno 3, annotare il tempo trascorso in ogni vano per un periodo di s 900 e salvarlo per l'assegnazione degli scompartimenti nella fase successiva (Figura 3).
      8. Assegnare la metà degli animali in ogni gruppo per ricevere il farmaco o il veicolo in uno scomparto (ad es., nero) e l'altra metà nel vano di (ad es., bianco) (Figura 4).
        Nota: La distribuzione finale degli animali deve garantire che la metà degli animali sono assegnata a vano inizialmente preferito e l'altra metà al vano non preferite. Inoltre, la metà degli animali hanno ricevuto il farmaco in uno scomparto (ad esempio, quello nero) e l'altra metà in altro (in questo caso, quello bianco).
      9. Punteggi di equilibrio nel gruppo all'interno di entrambi i comparti, così come tra i gruppi (le differenze del gruppo test con un'analisi della varianza (ANOVA)). Come guida approssimativa, i valori dovrebbero essere circa 360-370 s nel test Pre-C (Figura 4). Nota: nessuna differenza significativa dovrebbe essere rilevata tra il tempo trascorso negli scompartimenti abbinate in droga e abbinato al veicolo durante la prova di Pre-C.
      10. Escludere gli animali che presentano una forte avversione o la preferenza per ogni vano. Considera avversione come spendere meno tempo al 33% nel vano e considerare la preferenza quando l'animale ha trascorso oltre il 67% del tempo totale nel compartimento.
    2. Condizionata (4 giorni) (Figura 5)
      1. Pesare gli animali e usare questi pesi per dosi di cocaina durante condizionata.
      2. Preparare siringhe con cocaina o salino basato sul peso corporeo.
      3. Iniettare un mouse contemporaneamente intraperitonealmente (ip) e inserire subito delicatamente nel vano assegnato di bianco o nero della loro casella.
      4. Dopo un intervallo di 4 h, iniettare la dose di farmaco immediatamente prima che il mouse è limitato al comparto droga-accoppiato per 30 min (Figura 5).
      5. Si alternano questa procedura ogni giorno, iniziando con la cocaina nei giorni 1 e 3 e saline nei giorni 2 e 4.
      6. Verificare che il confinamento è effettuato in entrambi i casi chiudendo la porta a ghigliottina che separa i due compartimenti, per rendere inaccessibile la zona centrale.
        Nota: In questa fase, non c'è nessun bisogno di impostare il programma di PC.
    3. Post-condizionata (Post-C) (1 giorno)
      1. Portare gli animali per la camera di prova e lasciarli abituati per 15 min.
      2. Rimuovere la porta a ghigliottina che separa i due compartimenti.
      3. Impostare il computer e il programma. Inserisci animal ID e premere il comando "start".
      4. Registrare il tempo trascorso dai topi non trattati in ogni compartimento durante un periodo di osservazione di s 900.
      5. Quando il processo è finito, riportare tutti gli animali in gabbie usate per casa e salvare i dati.
      6. Considera che la droga ha indotto la preferenza di posto se il tempo trascorso nel vano di droga-accoppiato durante il Post-C è significativamente maggiore nel test Pre-C. Se si verifica il contrario, considera un'avversione per il vano di droga-accoppiato.
  2. Estinzione
    1. Condurre una sessione settimanale di estinzione in tutti i gruppi/animali che ha sviluppato una preferenza per il vano di droga-accoppiato.
    2. Metti l'animale nell'apparato (senza ghigliottine) per 15 min (stesso come i test di pre- e Post-C) (Figura 1).
      Nota: Se la dose impiegata CPP è alto (25 mg/kg), eseguire 1 sessione di estinzione per settimana. Se una dose di sottosoglia è usato (1 mg/kg), quindi eseguire 2 estinzione sessioni a settimana (ad esempio lunedì e giovedì).
    3. Prendere in considerazione la preferenza estinta quando i dati della prova di estinzione non mostrano differenze per quanto riguarda il test di Pre-C, ma mostrano differenze per quanto riguarda il test Post-C.
    4. Ripetere il test 24 ore più tardi al fine di confermare l'estinzione.
  3. Reintegrazione di CPP
    1. Reintegrazione indotta da innesco
      1. Valutare gli effetti di una dose di adescamento di cocaina 24 h dopo l'estinzione è stata confermata.
        Nota: Le dosi di adescamento sono metà della dose precedente che l'animale ha ricevuto durante condizionata. Il test di reintegrazione subisce lo stesso protocollo come Pre-C e C-Post test, tranne per il fatto che gli animali devono ricevere la dose di cocaina in un non contingente posto 15 min prima della prova. L'efficacia di adescamento di droga nell'induzione della reintegrazione può essere migliorata dopo ripetute estinzione/reintegrazione esperienze23, anche se l'ordine delle dosi sembra non per giocare un ruolo nei risultati ottenuti36.
      2. Portare gli animali in un'altra camera dalla sala di collaudo (non contingente posto) (Figura 6).
      3. Iniettare loro con metà della dose precedente di cocaina (ad esempio, se gli animali sono stati condizionati con 25 mg/kg di cocaina, una dose di adescamento sarebbe 12,5 mg/kg).
      4. Riportarli al loro vivaio per 15 min.
      5. Portarli in sala prove e sistemare gli animali nell'apparato immediatamente (senza le porte a ghigliottina che separa gli scompartimenti) per 15 min (come il pre- e Post-C test).
      6. Considera la differenza in secondi tra il tempo trascorso nel vano di droga-accoppiato durante l'ultima sessione di estinzione e il test di ripristino come misura del grado di reintegrazione della preferenza indotta dalla droga.
      7. Ripetere la procedura di estinzione-reintegrazione ogni volta con diminuendo le dosi fino a quando è confermato di essere inefficace.
        Nota: Un controllo di iniezione salina può essere utilizzato per controllare la capacità di innesco di cocaina (e non di iniezione stesso) per indurre la reintegrazione.
    2. Reintegrazione indotta da stress
      1. Valutare gli effetti di una reintegrazione indotta da stress 24 h dopo l'estinzione è stata confermata
        Nota: Test di reintegrazione sono gli stessi di quelli effettuati in Post-C (deambulazione libera per 15 min), tranne per il fatto che gli animali vengono esaminati 15 min dopo la sconfitta sociale in un agonistico incontro (Figura 6)
      2. Prendere gli animali in una camera diversa dalla camera CPP.
      3. Posizionare il mouse sperimentale con un sesso avversario aggressivo abbinato di pari età e peso corporeo nella gabbia plastica (Figura 6).
        Nota: L'incontro agonistico consiste di una prova di 10 min in una gabbia in plastica trasparente neutra (23x13.5x13cm) con un risultato di sconfitta per il mouse sperimentale. Per preparare l'avversario aggressivo, in primo luogo isolare gli animali diversi che corrispondono a età e peso corporeo come topi sperimentali per 3 settimane. Addestrarli ad acquisire esperienza di combattimento e testarli per avere alti livelli di aggressività territoriale. Per ottenere aggressivi conspecifici, topi devono essere isolati per almeno 3 settimane e poi addestrati in aggressivo e attaccare i comportamenti. Gli animali sono addestrati in un ambiente neutro, di fronte a loro a coppie. Li lasciamo mordere i tempi avversario 2 o 3 e farli fuori dalla gabbia, sempre terminare l'allenamento prima che uno dei due topi presenta presentazione, affinché l'esperienza dell'incontro rafforza il comportamento aggressivo. Dopo aver subito aggressioni (minaccia e attacco dai conspecifici aggressivo), topi sperimentali dovrebbero presentare evitamento/fuggire e comportamento difensivo/sottomesso. Il criterio è quello di adottare una postura specifica della sconfitta, caratterizzata da una posizione eretta e sottomessa, limp zampe anteriori, testa inclinata verso l'alto e retratto orecchie (Figura 6). Secondo Burke et al., 2016, consideriamo che l'incontro sociale è terminata all'inizio se l'intruso viene visualizzato una postura supina sottomissione per > 8 s o se 13 punture di attacco si è verificato. Un'altra opzione per gli animali di schermo senza rischio di ferita significativa potrebbe essere di ritmo l'animale in un recinto di rete metallica con un foro, non abbastanza grande per entrambi animale passare.  Aggressione potrebbe essere rilevata senza sottoporre gli animali a dirigere il comportamento aggressivo.  Se un animale subisce una ferita con una ferita di 1cm di diametro e/o l'esposizione diretta del muscolo, è escluso dallo studio e dovrebbe essere euthanized.
      4. Dopo 10 min di incontro agonistico, prendere i topi in sala prove e sistemare gli animali nell'apparato CPP immediatamente (senza le porte a ghigliottina che separa gli scompartimenti) per 15 min (come il pre- e Post-C test).

3. elaborazione statistica

Nota: Dimensione del campione ideale dovrebbe essere un minimo di 15 animali per gruppo.

  1. Analizzare il tempo medio trascorso nel vano di droga-accoppiato del gruppo per mezzo di una ANOVA mista con uno tra variabile, trattamento, con due livelli (gruppo di controllo, gruppo sperimentale, esempio dei due gruppi è in Figura 7 c) e uno all'interno variabile – giorni, con 2 livelli (Pre-C e Post-C).
    Nota: Nel gruppo di controllo, gli animali ricevono la droga ma non hanno nessuna manipolazione ambientale. D'altra parte, nel gruppo sperimentale animali sono esposti a diverse condizioni ambientali. Confrontare il tempo trascorso nel vano di droga-accoppiato il giorno Post-C rispetto al Pre-C prova per vedere se ci sono differenze significative nella sensibilità al farmaco.
  2. Inoltre, eseguire analisi post-hoc di Bonferroni per controllare uno dei punteggi significativi.
  3. Analizzare i dati relazionati ai valori di estinzione e la reintegrazione nei gruppi che preferenza sviluppato mediante dello studente t-test per continuare con la procedura di estinzione-reintegrazione nel corso dell'esperimento, ma al momento finale, analizzarli con un'ANOVA con all'interno variabile (giorni) con il numero di livelli a seconda di ciascun gruppo.
    Nota: Quando è aumentato il numero di confronti, il numero di quelli che saranno significativi per caso anche aumentato. Come tale, per evitare falsi positivi (errori di tipo 1) abbiamo 'corretti' il valore di p, rendendo in tal modo il test più conservatore con la correzione di Bonferroni per t-test multipli. Tuttavia, per la prova di reintegrazione, il confronto occorre tra il test di reintegrazione e l'ultimo test di estinzione. Pertanto, non esiste alcuna necessità di correzione.

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Representative Results

In primo luogo, risultati rappresentativi dalla reintegrazione indotta da stress e adescamento sono mostrati nella Figura 7 utilizzando topi del maschio adulto OF1.

I dati nella Figura 7a-b che rappresenta il tempo trascorso nella droga-accoppiato comparti in pre- e Post-C prova sono stati analizzati con un misure ripetute ANOVA con giorni variabile entro-oggetti (confronto Pre- e Post-C). I risultati hanno mostrato un effetto significativo dei giorni variabili [F(1,34) = 51.179; p < 0.001], come tutti gli animali hanno sviluppato una preferenza nel corso della giornata Post-C rispetto al Pre-C. Tutti gli animali erano condizionati con 25 mg/kg di cocaina e quando è stato raggiunto l'estinzione, un gruppo ha ricevuto una dose di adescamento di 12,5 mg/kg di cocaina per testare il ripristino (Figura 7a) e l'altro è stato sottoposto a un'interazione sociale in cui la sperimentale animale è stato sconfitto da un avversario aggressivo (Figura 7b). 15 min dopo i due eventi, gli animali sono stati testati nella loro casella CPP corrispondente.

La reintegrazione di adescamento-indotta (Figura 7a) è stato sottoposto a successivi diminuendo le dosi di adescamento (metà quello precedente) fino ad una dose di adescamento è confermato di essere inefficace. Le dosi erano: 12,5, 6.25, 3.125 e 1,56 mg/kg di cocaina. Il t-test dello studente ha rivelato un effetto significativo sulla reintegrazione di cocaina di 12,5 mg/kg rispetto alla sessione di estinzione (statistica t (t) = 20.589, gradi di libertà (d.f.) = 17; p < 0,001) e dosi successive (6,25 mg/kg: t = 18.356; 3,125 mg/kg: t = 14.260; 1,56 mg/kg: t = 16.934 d.f. = 17; p < 0.001). Innesco con 0,78 mg/kg non hanno indotto la reintegrazione.

Per quanto riguarda la reintegrazione indotta da stress (Vedi Figura 7b), essendo esposto a un animale aggressivo e sconfitto 15 min prima che i cavetti per reintegrare la preferenza precedentemente estinta (t = 26.810; d.f. = 15; p < 0.001)19 .

Altre manipolazioni ambientali, quali la sofferenza ripetuta sconfitta sociale prima della procedura CPP, modificare gli effetti gratificanti di sottosoglia dosi di cocaina (Figura 7C). A misto ANOVA con il tra variabile "stress" e all'interno variabile "giorni" è stato realizzato, e c'era un effetto significativo dell'interazione Stress x giorni [F(1,29) = 4.144; p < 0,05]. Solo gli animali socialmente sconfitti hanno esibito preferenza per il vano di droga-accoppiato con una dose sottosoglia di cocaina, che ha dimostrata di essere inefficace in animali standard7. Inoltre, dopo l'estinzione della preferenza, animali socialmente sconfitti reintegrarono la loro preferenza con innesco di cocaina solo 0,5 mg/kg (t = 25.484 d.f. = 17; p < 0.001).

In secondo luogo, come un risultato negativo, possiamo vedere come la reintegrazione può essere prevenuta da una positiva interazione sociale con un conspecifico non aggressivi (Figura 8a). Pertanto, è importante valutare se gli animali sono sconfitti o non dopo un sociale incontrano37.

Un altro esempio di risultati negativi che impediscono la reintegrazione può essere manipolazioni nutrizionali, come un apporto di grassi dieta gradevole al palato. In primo luogo, l'analisi ANOVA ha rivelato un effetto dei giorni variabili [F(1,26) = 21.527; p <.0.001], in quanto entrambi i gruppi ha sviluppato la preferenza per il vano di droga-accoppiati (p < 0.01) (figura 8b). Dopo l'estinzione, i nostri risultati indicano che gli animali inseriti la dieta ad alta percentuale di grassi dopo il test Post-C è diminuito la loro sensibilità alla reintegrazione indotta droga-adescamento, ma che non ha fatto ripristinare la preferenza con una cocaina di 6,25 mg/kg dose38.

Figure 1
Figura 1: procedura sperimentale alla preferenza di posto condizionata. Si compone di tre fasi: pre-condizionamento, condizionata e post-condizionata. Ci sono 4 giorni condizionata in cui la procedura è alternata ogni giorno, cominciando con la cocaina nei giorni 1 e 3 e con veicolo nei giorni 2 e 4. Quindi, vengono eseguite le sessioni di estinzione e la reintegrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: sessioni di utilizzo del Software per i test Pre- e Post-C dove tempo trascorso in ogni scomparto e viene registrato il numero di voci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: dati dopo i test Pre- e Post-C. Qui, registrare i dati acquisiti durante la prova. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: assegnazione imparziale degli animali ai compartimenti per la successiva fase di condizionamento. Prendere i dati dell'ultimo giorno di test Pre-C negli scompartimenti bianchi e neri. Metà degli animali sono assegnati a ricevere il farmaco o veicolo in uno scomparto (nero o bianco) e l'altra metà nel vano di altri. Escludere gli animali che mostrano la forte avversione o preferenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: assegnazione finale del veicolo e cocaina accoppiato sessioni. Questa figura mostra alternanza nell'ordine di abbinamenti. Nei giorni 1 e 3, un animale (ad es., 1.1) è in primo luogo esposto al vano cocaina-accoppiato (quello bianco) e, dopo quattro ore, è esposto al vano veicolo-accoppiato (quello nero). Nei giorni 2 e 4, è invertito l'ordine degli abbinamenti e l'animale è in primo luogo esposto al veicolo-accoppiato vano (nero) e, dopo quattro ore, al vano (bianco) di cocaina-accoppiato. Come questa procedura sia imparziale e sessioni di condizionamento controbilanciato, simultanea possono essere condotta con due animali utilizzando entrambi i compartimenti della casella stessa (ad es., animali 1.1 e 2.4, 3.1 e 1.3), che permette di ridurre il tempo dedicato alla procedura sperimentale. Si noti che queste coppie di animali seguano l'ordine inverso di abbinamenti attraverso la fase di condizionamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: due modelli di reintegrazione. (un) reintegrazione indotta da innesco e reintegrazione indotta da stress (b). (un) animali ricevano un'iniezione di droga in una stanza non contingente e sono portati a Vivario; 15 minuti più tardi che sono testati nella finestra di CPP. (b) gli animali sono sconfitti in un incontro agonistico in una stanza non contingente per 10 min e, in seguito, essi sono testati nella finestra di CPP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: risultati positivi rappresentativi. Adescamento (un) e reintegrazione indotta da stress (b) dopo 25 mg/kg cocaina CPP. (c) gli effetti della sconfitta sociale sugli effetti gratificanti di sottosoglia dosi di cocaina (1 mg/kg). Barre rappresentano il tempo medio (± SEM) in secondi trascorso nel vano di droga-accoppiato durante il pre-condizionamento (bianco), post-condizionata (nero), ultima sessione di estinzione (grigio chiaro) e reintegrazione (grigio scuro). Il test di ripristino è stato valutato 15 min dopo una dose di adescamento di metà della dose precedente ricevuta. * p < 0,05; * * p < 0.01; p < 0,001 differenza significativa vs Pre-C (ANOVA con un entro-oggetti giorni variabile (confronto Pre- e Post-C) o la precedente sessione di estinzione (test t di Student). Queste cifre sono state modificate da 7,19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: risultati negativi rappresentativi. Effetti delle manipolazioni ambientali protettive sugli effetti gratificanti di cocaina. (un) gli effetti di un'interazione sociale positiva prima il ripristino di prova. (b) gli effetti di una dieta ad alta percentuale di grassi durante il periodo di estinzione tutta e la reintegrazione. Il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard (13% di kcal da grasso, 67% kcal da carboidrati e 20% kcal da proteine; 2,9 totale kcal/g) e il gruppo di dieta ad alta percentuale di grassi (45% kcal da grasso, 36% kcal da carboidrati e 19% kcal da proteine; 4,6 totale kcal/g). Barre rappresentano il tempo medio (± SEM) in secondi trascorso nel vano di droga-accoppiato durante il pre-condizionamento (bianco), post-condizionata (nero), ultima sessione di estinzione (grigio chiaro) e reintegrazione (grigio scuro). Il test di ripristino è stato valutato 15 min dopo una dose di adescamento di metà della dose precedente ricevuta. * p < 0,05; * * p < 0.01; differenza significativa vs Pre-C (ANOVA con un entro-oggetti giorni variabile (confronto Pre- e Post-C) o la precedente sessione di estinzione (test t di Student). Queste cifre sono state modificate da 37,38. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il punto chiave della ricerca di dipendenza droga è lo sviluppo di trattamenti che diminuiscono il desiderio e, di conseguenza, ridurre la vulnerabilità alla ricaduta. Grazie al modello di reintegrazione del paradigma CPP, è possibile studiare l'influenza di diversi fattori ambientali e procedurali che modulano la ricaduta, che è una priorità della ricerca futura. Ci sono alcuni punti importanti da considerare, come il paradigma CPP è un test che è altamente sensibile ai fattori ambientali.

Modifiche e la risoluzione dei problemi: La versione CPP del modello reintegrazione deve essere modificata secondo la droga di interesse. Ci sono diversi fattori che possono influenzare la grandezza di preferenza condizionato, come durata e numero di sessioni di condizionamento. Il numero di associazioni varia solitamente da uno a sei, con quattro è il più comune. La durata delle prove condizionata è stabilita secondo le caratteristiche del farmaco e la sua farmacocinetica.

CPP studi coinvolgono solitamente molte prove, quindi è utile utilizzare protocolli che riducono il tempo necessario. Un modo per raggiungere questo obiettivo è di ridurre il numero di prove e un altro modo è quello di eseguire due sessioni di condizionamento al giorno, come è illustrato nel presente protocollo. In questo caso, è necessario garantire che gli effetti della droga dalla sessione precedente non trascinare questa seconda sessione39, motivo per cui l'intervallo di quattro ore tra la cocaina - sessione di veicolo è stato scelto. Ad esempio, i tempi dell'accoppiamento nel caso di cocaina durante la fase di condizionamento dovrebbero essere ogni 24 h per 4 giorni con un'accoppiamento durata di 30 min. Al contrario, il corso di tempo della procedura condizionata di etanolo dovrebbe essere ogni 48 h, un totale di 8 giorni, 1 sessione al giorno, di condizionamento e infine alternando veicolo ed EtOH, avendo un totale di 4 accoppiamenti di EtOH. Abbinamento di etanolo dovrebbe avere una durata breve, ad esempio 5 minuti, come più tempo potrebbe produrre stati che ha avversione. Le dosi efficaci vanno da 1-2 g/kg e dosi sottosoglia sono 0,75 g/kg40. Reintegrazione di adescamento-indotto dovrebbe essere metà della dose precedente ricevuta, e l'apparato deve essere lo stesso.

Tuttavia, scegliendo di fare 1 o 2 sedute al giorno possa influenzare i risultati in alcune speciali sostanze d'abuso. Ad esempio, nel caso di MDMA-indotto CPL con il protocollo di due sessioni, la preferenza condizionata in post-condizionata non viene rispettata, considerando che questo può essere ottenuto eseguendo un'unica associazione ogni giorno30, quindi MDMA dovrebbe essere somministrato anche ogni 48h, ma la durata della sessione condizionata dovrebbe essere 30 min.

Ci sono due metodi principali di estinzione che potrebbe essere eseguito dopo l'istituzione del CPP, sia le iniezioni quotidiane di veicolo confinare l'animale nel veicolo sia tradotto droga condizionata scomparti41,42, 43, o ripetendo il test CPP, lasciando gli animali a esplorare i tre compartimenti senza la ghigliottina fino a preferenza non è osservata non più di7,18,30,38. Nel presente protocollo, abbiamo impiegato quest'ultimo, perché è un tipo di estinzione spontanea senza alcuna manipolazione farmacologica o comportamentale legate alla condizionamento (più simile a quello che accade in tossicodipendenti umane), ma entrambi i metodi sono accettabili e valido, come la letteratura ha dimostrato per anni.

Limiti della tecnica: Il limite più importante del paradigma CPP e il modello di reintegrazione è che sono molto sensibili a qualsiasi cambiamento ambientale. Pertanto, condizioni di camera e terraristica dovrebbero rimanere stabile e costante durante l'intera procedura. Dovrebbe prestare particolare attenzione ad aspetti come vivere nella stessa stanza con i compagni del sesso opposto, gabbie con artefatti come le ruote che fanno un rumore costante e specifico, o condizioni di luce. Oltre a controllare queste variabili, il ruolo del ricercatore è anche critico, in quanto possono indurre un aumento nei livelli di sforzo degli animali e interferire con i risultati.

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti: Per quanto riguarda altri metodi, nella versione CPP del modello reintegrazione, il ricercatore è colui che amministra la droga per l'animale, in contrasto con paradigmi di autosomministrazione che valutare la motivazione umano per prendere la droga. È importante che questo prendiamo in considerazione. Questo significa che non stiamo valutando motivazione attraverso una risposta dell'operatore né gli effetti di rinforzanti primari della droga. Come abbiamo accennato, CPP è un modello utile per valutare il ruolo critico che stimoli ambientali giocano sulla ricaduta nei disordini di abuso di sostanze, che sono in realtà i principali fattori che modulano la ricaduta in esseri umani.

Applicazioni future: Future applicazioni del modello reintegrazione CPP devono essere orientate all'incubazione cosiddetto di brama, che consiste di un aumento progressivo nella reattività cue dopo astinenza di droghe, che imita il desiderio in esseri umani. Al giorno d'oggi, piccolo è conosciuto circa questo nel paradigma CPP. A pochi anni fa, solo uno studio ha suggerito che la CPP potrebbe anche misurare questo periodo di incubazione44. Più recentemente, si è valutato o meno stimoli ambientali accoppiati a morfina in CPP potrebbero aumentare la risposta comportamentale oltre il periodo di recesso45. Questo studio ha trovato che il numero di voci per i compartimenti di CPP stavano aumentando nel tempo, riflettendo l'incubazione di assetati e suggerendo che ricompensa ricordi e desiderio di droga potrebbe essere distinta nel paradigma CPP.

Fasi critiche: ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Al fine di affermare che gli animali reintegrato la loro preferenza, dati di estinzione devono riflettere una vera e propria estinzione di preferenza, essere confermata prima della prova di reintegrazione. I dati del test di estinzione non dovrebbero mostrare differenze per quanto riguarda il test di Pre-C, ma per quanto riguarda il test Post-C.

Per quanto riguarda la versione di reintegrazione sociale indotta da stress, noi dovremmo hanno confermato che l'animale è stato effettivamente sconfitto, poiché un incontro sociale positivo che non si esaurisce nella sconfitta Mostra effetti protettivi, la reintegrazione del posto di blocco preferenza di cocaina. Se gli animali da laboratorio non sono stati sconfitti, saranno esclusi dallo studio. Si consiglia di rilevare e valutare l'incontro agonistico, misurare la latenza di comportamento aggressivo o comportamento di sottomissione, il numero di attacchi e il tempo trascorso in ciascuna di tali comportamenti. Consideriamo che l'animale da laboratorio è sconfitto quando riceve un minimo di 2 attacchi (morsi) e Mostra i segni di presentazione (come illustrato nella Figura 6). In tutti i casi, l'incontro dura 10 min.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Ministero della salute, servizi sociali e l'uguaglianza. Delegazione del governo per il piano nazionale sulle droghe, progetti di ricerca sulle dipendenze di droga, 2014I007; Ministero dell'economia e competitività (MINECO), Istituto di salute Carlos III, rete di Addictive disordini (RTA) RD12 / 0028/0005 e RD16 / 17/07/00 e Unione europea, FEDER fondi "una manera de hacer Europa" e PSI2014-51847-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MONPRE 2Z software CIBERTEC S.A., Spain N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area. CIBERTEC S.A., Spain N/A The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain Charles River, Barcelona Spain N/A Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014 Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415 45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g

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