Summary
Målet med detta protokoll är att etablera ex vivo Drosophila larval hjärnan kultur optimerad för att övervaka dygnsrytm molekylär rytmer med långsiktiga fluorescens time-lapse imaging. Tillämpningen av denna metod på farmakologiska analyser diskuteras också.
Abstract
Dygnsrytm pacemaker kretsen orkestrerar rytmiska beteendemässiga och fysiologiska utgångar samordnas med miljömässiga ledtrådar, såsom dag/natt cykler. Den molekylära klockan inom varje pacemaker neuron genererar dygnsrytmen i genuttryck, som ligger bakom de rytmiska neuronala funktionerna som är avgörande för driften av kretsen. Utredning av enskilda molekylär oscillatorerna i olika underklasser av pacemaker nervceller och deras interaktion med nervcellernas signalering egenskaper ger en bättre förståelse av dygnsrytm pacemaker kretsen. Här presenterar vi en time-lapse fluorescerande mikroskopi metod utvecklad för att övervaka det molekylära urverket i klocka nervceller av odlade Drosophila larval hjärna. Denna metod tillåter flera dagars inspelning av rytmer av genetiskt kodade fluorescerande dygnsrytm reportrar på encelliga upplösning. Denna inställning kan kombineras med farmakologiska manipulationer för att noga analysera realtid svar av molekylära klockan till olika föreningar. Bortom dygnsrytm erbjuder denna mångsidiga metod i kombination med kraftfulla Drosophila genetiska tekniker möjligheten att studera olika neuronala eller molekylära processer i levande hjärnvävnad.
Introduction
Dygnsrytm klockor hjälpa organismer att anpassa sig till de periodiska miljöförändringar som genereras av 24 h rotation av jorden. De förreglade transkriptionell-translationell feedbackloopar ligger ofta bakom den molekylära maskinen av dygnsrytm klockor över arter1. Dygnsrytm pacemaker kretsen består av klocka-innehållande nervceller integrerar tid-för-dag information förmedlas av miljömässiga ledtrådar, såsom ljus och mörker (LD) och temperatur cykler, att orkestrera rytmer i en uppsjö av dagliga fysiologiska och beteendemässiga processer2,3. Samordning av molekylär rytmer med neuronala ingångar och utgångar är kritiskt viktigt för driften av den dygnsrytm krets men återstår endast delvis förstås.
I Drosophila, kärnan i den molekylära klockan, den KLOCKCYKEL (CLK/CYC) heterodimer aktiverar transkriptionen av period (per) och tidlös (tim). PER och TIM bildar ett komplex och ange kärnan, där de hämmar transkriptionell aktivitet CLK/CYC och därmed sin egen transkription. Post-transcriptional och post-translationella förordningar orsaka förseningar mellan CLK/CYC-medierad transkription och förtryck av PER / TIM, att säkerställa generationen av circa 24-h molekylära svängningarna1,3,4 . Ca 150 nervceller som innehåller dessa molekylära klockor bildar flyger en krets till control dygnsrytm beteende vuxen5. En mycket enklare men fullt funktionella dygnsrytm krets som består av 3 grupper av klocka nervceller - 5 ventrala laterala nervceller (LNvs; 4 PDF-positiva LNvs och en PDF-negativ LNv, se nedan), 2 dorsala Neuron 1s (DN1s) och 2 dorsala Neuron 2s (DN2s) - finns i de larver hjärnan6,7.
Den enkla larval dygnsrytm kretsen erbjuder en utmärkt modell för att studera interaktioner mellan Inter neuronal kommunikation och den molekylära clockwork. Med vårt nyutvecklade fluorescerande reporter PER-TDT, som härmar nivåerna PER protein och dess subcellulär lokalisering, försökte vi karaktärisera dynamiken i det molekylära urverket i olika klocka neuron undergrupper i larval dygnsrytm kretsen 8. dessutom veta den nyckelroll som den neuropeptid pigment-spridning faktorn (PDF) producerad av 4 LNvs reglera dygnsrytmen på neuronal nivå9,10,11, vi ville undersöka direkt effekt av PDF på molekylära klockor. För detta ändamål har vi utvecklat en metod för att övervaka dygnsrytm genuttryck rytmer i larval hjärnan explant över flera dagar av time-lapse konfokalmikroskopi. Protokollet var också anpassad för farmakologiska analyser att testa effekten av PDF- eller andra föreningar på nivån på PER-TDT. Anpassningen består således, av att göra hjärnan explant kulturen tillgänglig för läkemedel ansökan, ökad temporal upplösning och imaging för en kortare period.
Ex vivo kulturen i Drosophila hjärnor olika utvecklingsstadier har varit tidigare etablerade12,13,14,15,16,17 ,18. Medan dessa protokoll har använts för imaging olika biologiska fenomen, vissa av dem är inte kompatibla med imaging encelliga upplösning eller stöder inte kulturen i flera timmar. Alternativa metoder att utföra långsiktiga levande avbildning av dygnsrytm nervceller i Drosophila inkluderar Mareld avbildning av molekylär rytmer19,20,21 och fluorescens avbildning av kalcium-indikator med lätta blad mikroskopi22,23. Även om Mareld imaging kan uppnå högre temporal upplösning och lätta blad mikroskopi kan vara anpassningsbar för i vivo imaging, de är begränsade på den rumsliga upplösningen och kräver specialiserade Mikroskop system.
Den metod som beskrivs här är skräddarsydd för att visualisera fluorescerande signaler i hela hjärnan kultur med encelliga upplösning över flera dagar. Denna lättköpt och mångsidig metod kunde anpassas till bild odlade vuxen fluga hjärnor och för farmakologiska experiment för att studera många olika problem i Drosophila neurobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av stamlösningar Under en kultur huv
- Förbereda 400 mL 1 x Schneider Active Medium (SAM) optimerad för ex vivo kultur av larval hjärnor (modifierad från referens24,25) (tabell 1). Alikvot till 5 mL och flash frysa i flytande kväve (LN2), förvaras vid - 80 ° C.
- Bered 1 x Dissecting saltlösning (DSS) genom att späda 10 x stamlösning (modifierad från referens26) (tabell 2).
- Alikvotens fibrinogen till 10 mg och store vid 4 ° C för enskild användning.
Försiktighet: Väga fibrinogen under laminärt flöde, handskar, eftersom det är skadligt. - Förbereda trombin stamlösning i SAM (1500 NIH enhet/mg) och alikvotens till 10 µL, flash frysa i LN2 och hålla vid-80 ° C.
Försiktighet: Använd handskar vid hantering av trombin eftersom det är skadligt. - Alikvotens stamlösning av 100 x Penicillin-Streptomycin. Hålla vid-20 ° C.
- Skär cirklar av polytetrafluoreten (PTFE) membran (se material tabell) till den storlek som passar insidan av en maträtt med glas i botten. Skölj dem i 70% EtOH och sedan i Ånghärdad dH2O. Sterilize och torr under laminärt flöde med UV. Hålla i en steril petriskål. Engångsbruk.
Obs: PTFE är ett poröst flexibelt membran som tillåter gasutbyte och förhindrar medium avdunstning under långsiktig inspelning.
2. time-lapse mikroskopi Setup
Obs: Följande inställningar för tandem scanner inverterad confocal Mikroskop (se material tabell) har en resonant scanner (8.000 Hz). I systemet ingår en mycket känslig foto-multiplikator detektor, som tillsammans med resonant skannern förhindrar fototoxicitet och fotoblekning. Temperatur och luftfuktighet kontrolleras inom en Mikroskop miljökammare (se Material tabell) som täcker de flesta av mikroskopet.
- Placera en stage-top fuktkammare.
- Slå på temperatur och luftfuktighet flygledare temperera Mikroskop kammaren till 25 ° C och 80% luftfuktighet.
- För att utföra experiment i konstant mörker (DD), täck den Mikroskop klimatkammare med en ogenomskinlig duk (utom Mikroskop kammaren är gjord av ett ogenomskinligt material).
- Om du använder en nedsänkning i vatten mål, placera en Vattenautomat nedsänkning Micro ovanpå målet och programmera ett protokoll med programvaran Autoimmersion mål Controller att avstå från vatten vid en konstant hastighet under time-lapse imaging.
Obs: Nedsänkning i vatten mål tillsammans med en Vattenautomat eller torr objektiv rekommenderas för långsiktiga levande imaging, som annan typ av nedsänkning medium skulle torka ut. - Placera en petriskål hållare på scenen, inuti fuktkammare.
- Starta programvaran mikroskopet och välj resonant scanner mode från den första dialogrutan. Välj OK för att initiera scenen när du uppmanas. Gå till fliken konfiguration och maskinvarukonfiguration växla på de relevanta laserlinjerna.
- Gå till skaffa tab och XY panelen att välja dubbelriktad läge och ställa in bild förvärv parametrar.
Obs: Den beskrivna imaging setup som presenteras här (figur 2, figur 3 och film 1) är optimerad för att observera dygnsrytm uttryck för specifika fluorescerande reportrar. Följande parametrar valdes för att bäst passa våra specifikationer: 40 X vatten nedsänkning mål, 8 X line genomsnittet med 512 × 512 bildupplösning. För multicolor imaging, sekventiell bild förvärv krävs när utsläpp våglängden för en fluorophore och excitation våglängden av ett annat överlappar (här, våglängder av gula fluorescerande Protein (YFP) utsläpp och tomat excitation överlappning). Välja sekventiell läge ”mellan stack” eftersom det är den snabbaste och förflyttning av klocka nervceller är försumbar under förvärv av en Z-stack. Mikroskopi inställningar bör anpassas efter syftet med varje experiment.
3. inställning av Larval hjärnan Explant kultur
Obs: Hela proceduren från dissektion till inbäddning av hjärnan bladsticklingar tar ~ 30 min.
-
Beredning av reagens under en kultur huv.
- Tina en alikvot av trombin och förvara i rumstemperatur tills det inbäddning steget (steg 3.3). Engångsbruk.
- Tina snabbt en alikvot av SAM vid 37 ° C och hålla på is för enskild användning.
- Lägg till SAM till en 10 mg alikvot av fibrinogen till 10 mg/mL, svep försiktigt och inkubera vid 37 ° C i minst 30 min och under inbäddning steget (steg 3.3). Engångsbruk.
Obs: Inte Inkubera den fibrinogen lösning mer än 2 h som det börjar att polymerisera. - Tina en alikvot av 100 x lager Penicillin-Streptomycin. Förbereda 2,5 mL av SAM som innehåller 1 x Penicillin-Streptomycin (SAM/antibiotika). Förvara i rumstemperatur.
Obs: Butik de resterande 100 x lager Penicillin-Streptomycin vid 4 ° C upp till 1 månad. - Förbereda en alikvot av 500 µL från de återstående SAM. Hålla på is.
- För långsiktiga imaging, lättbetong och autoklaverad vakuum smörj den plast delen av botten av glas botten skålen (figur 1A) och sterilisera under laminärt flöde med UV.
-
Dissektion av den centrala nervsystemet och ventrala nerv sladden.
- Rengöra tången och 2 x tre-väl glas dissektion rätter med 70% EtOH. Häll 400 µL av DSS i 4 brunnar och 400 µL av SAM i en brunn. Hålla på is.
- Gröp ur flyga medium innehållande larver och plocka icke-vandrande 3rd instar larver (L3) med pincett. Skölj dem successivt i 2 DSS-fyllda brunnar. Hålla dem i 3rd DSS-fyllda väl på isen som anesthetizes larver.
Obs: L3 varar cirka 2 dagar vid 25 ° C. Att observera hjärnan i fysiologiskt relevanta tidsramen valde vi att använda icke-vandrande L3 larver. Andra undergrupper av klocka nervceller, såsom l-LNvs och DN3s, börjar bildas på vandrande L3 scenen men de är inte nödvändigtvis cykling ännu (inga data anges). Därför, även om det är möjligt att bilden cykling klocka nervceller i detta skede (inga data anges), det är viktigt att noga skilja redan funktionella larval klocka nervceller från att utveckla de för dataanalys. Icke-vandrande L3 visas cirka 4 till 4,5 dagar efter äggläggning vid 25 ° C. För att använda detta protokoll för att studera dygnsrytm, synkronisera (dra in) utveckla larverna i 12 h/12 h LD cykler vid 25 ° C för 3 dagar före insamling L3 larver. - Dissekera larval hjärnor med fin pincett i 4th DSS-fyllda brunnen, som inte har använts för sköljning larver, använder de inifrån-ut metod27.
- Kort, skär larven i två, försiktigt Nyp mun krokarna med ett par pincett och rulla upp inifrån och ut i kroppen väggen med den andra par pincett, därmed utsätta hjärnan. Gratis hjärnan genom att skära ut alla luftstrupen och nerver att bifogar det till resten av kroppen.
- Sug ut hjärnan i ca 3 µL av DSS med 20 µL pipett (pre sköljda med DSS) och fördela i SAM-fyllda brunnen. Upprepa proceduren för upp till 7 hjärnor.
Obs: Dissektion bör utföras på en kall yta att hålla larverna sövda och hjärnan kyld. Till exempel placera dissektion skålen på en kylblocket ansluten till en pump att cirkulera is-kylt vatten. Den dissektion förfarande tar ~ 30 s per hjärna. Det är viktigt att hålla ögat/antennal imaginal skivorna bifogas hjärnor och ventrala nerv sladden intakt. Riva av dessa delar kommer att skada hjärnan och minska kvaliteten på kulturen. Också, undvika att utsätta hjärnor i luften. Innan aspirera första hjärnan, pipett upp och ner DSS som innehåller delar av dissekerade larverna, eftersom det förhindrar hjärnor fastnar på väggen i spetsen.
-
Inbäddning av hjärnan bladsticklingar i en 3D matrix och montering (~ 20 min).
- Dränka en dissekerade hjärna i fibrinogen arbetslösning (fibrinogen slutlig koncentration ~3.3 mg/mL, 10,5 µL per hjärnan) enligt följande:
- Aspirera 3,5 µL av SAM/antibiotika (med samma tips används i avsnitt 3.2.3). Aspirera en dissekerade hjärna från dissektion i samma pipettspetsen utan dispensering SAM/antibiotika mediet i spetsen.
- Avstå från hjärnan och mediet på locket till en steril petriskål. Lägga till en annan 3,5 µL av SAM/antibiotika och 3,5 µL varma fibrinogen/SAM 10 mg/mL lösning på rullgardinsmenyn som innehåller hjärnan. Blanda försiktigt lösningen runt hjärnan genom pipettering med en 20 µL pipettspetsen.
Obs: Med hjälp av en pipett i stället för tången i det här steget undviker betonar hjärnan. - Ta 2 µL fibrinogen arbetslösning från rullgardinsmenyn och tillämpa den på täckglaset av glas botten skålen som en liten cirkel. Tillsätt 0,8 µL av trombin och blanda mycket snabbt med en pipettspetsen. Fibrinogen omvandlas till fibrin och börjar att polymerisera.
- Ta hjärnan som sitter i den fibrinogen arbetar stopplösningen (steg 3.3.1) mellan ett par pincett och placera den på matrisen när en vit matris av fibrin är synliga. Orientera i hjärnans främre sidan ner (för imaging klocka nervceller). Driva det så nära som möjligt till skyddsglaset. Fibrin clot består av lager av fibrin. Plocka ett lager och vik den ovanpå hjärnan med små och mjuka rörelser utan att ta loss matrisen.
- Upprepa 2-3 gånger från olika delar av koagel att stabilisera hjärnan.
Obs: När du hanterar hjärnan med pincett, vara noga med att inte torka den eller införa det en fysisk stress.
- Upprepa 2-3 gånger från olika delar av koagel att stabilisera hjärnan.
- Tillsätt 20 µL av SAM/antibiotika ovanpå inbäddade hjärnan som ska stoppas av trombin.
- Upprepa proceduren för att montera återstående hjärnor. Det är möjligt att bädda in upp till 5 till 6 hjärnor på en maträtt med glas i botten.
- För långsiktiga levande imaging, tillsätt 600 µL av SAM/antibiotika i den inre väl (glaset en del). Placera ett färdigskurna PTFE membran ovanpå medium och hålla det till vakuum fettet tillämpas på den plastiska delen av botten (3.1.5) (figur 1A).
- För farmakologiska analyser, fyll skålen med 2 mL av SAM/antibiotika (figur 1B).
Obs: Det är mycket viktigt att undvika avdunstning av medium, som osmolalitet av medlet är avgörande för lönsamheten för nervceller. För långsiktiga imaging experiment, är det därför nödvändigt att försegla kultur skålen med PTFE membran. Medan för kortsiktiga experiment, tätning membran inte krävs så länge skålen fylls med 2 mL medium och övervakas i en fuktig kammare.
4. time-lapse bild förvärv
- Placera glas botten skålen på hållaren petriskål inuti den scenen-top fuktkammare.
- Gå till z-stacken panel i fliken förvärva och ställa in z-avsnitt stegen från Mikroskop mjukvaran (µm 2 × ~ 40 i de experiment som visas i figur 2 och figur 3, och filmen 1). Ange början av en z-stack på planet längst bort från täckglaset och slutet vid ytan av hjärnan explant, nära täckglaset. Men hjärnan rörelser är försumbar, lägga till extra z-avsnitt i början och slutet av z-stacken.
- Gå till Markera & hitta panel och set-up multi-position bild förvärv. Med ett 40 X-objektiv, kan 1 hjärnhalvan fångas inom ett synfält
- Gå till förvärv läge panelen och välj xyzt (z-stack time-lapse). Gå till tid förvärv panel och ange parametrarna önskad tid intervall och frekvens.
Obs: Förvärva time-lapse bilder med önskad frekvens. Observera att långsiktiga levande imaging (24-72 h) med tidsintervall kortare än 2 h förflutit tenderar att resulterar i färre cykling nervceller, förmodligen eftersom det minskar lönsamheten för nervceller. Datavolymen expanderar som andelen bild förvärv ökar, vilket gör dataanalys och lagring mer utmanande.
5. farmakologisk behandling av hjärnan bladsticklingar med kortsiktiga Live Imaging
Obs: Följande procedur är i huvudsak densamma som för långsiktiga imaging men kräver inte ett PTFE-membran. Undvik att utsätta hjärnor för att blått ljus när kemiskt läggs till kulturen genom placeras mikroskopet i det mörka rummen med rött ljus.
- Gå till tid förvärv panel och Ställ in önskat tidsintervall och antal scan att erhålla baslinje data innan läkemedlet ansökan. Starta skanning.
- Efter baslinjen sökningen är klar, lyft genomsökningen huvudet av mikroskopet systemet. Ta bort locket på scenen-top luftfuktighet handkontrollen och mycket försiktigt bort locket på glas botten skålen utan att flytta den.
- Ta bort lämplig mängd odlingsmedium om nödvändigt. Tillsätt den experimentella lösningen på medellång och noggrant och mycket försiktigt, blanda med en steril Pasteur-pipett utan att röra de hjärnan bladsticklingar.
Obs: För bad tillämpning av PDF, använda 2 µM PDF stamlösning (i 10% DMSO). - Ersätta locken på glas botten skålen och den fuktig kammaren och scan huvudet. Om du använder, flytta den svart ogenomskinlig duk i mikroskopet kammaren.
- Kontrollera om hjärnor är på sina ursprungliga positioner i levande skanningsläge. Justera vid behov.
- Gå till tid förvärv panel och Ställ in önskat tidsintervall och antal scan. Starta skanning.
Obs: Här vi testat time-lapse bilder förvärvade varje timme för upp till 10 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi de representativa resultat av långsiktiga inspelningen av en dygnsrytm fluorescerande reporter i ex vivo larval hjärnan kultur och levande imaging resultaten av PDF bad program på reporter uttryck.
Icke-vandrande L3 larver uttrycker molekylära klockan reporter PER-TDT och UAS-mCD8::YFP drivs av en klocka neuron drivrutin Clk (856)-gal4 (figur 1 c) var fångas upp i LD. Brains var dissekeras och ställa in för långsiktiga kultur under senaste ljus fas av LD cykeln precis innan den mörka fasen (figur 1A och 2B). Time-lapse imaging utfördes i DD och hjärnan bladsticklingar var avbildas varje 2 h för 64 h. En SUM-stack som innehåller neuron sevärdheter skapades och genomsnittlig fluorescensintensiteten hos området motsvarar neuron mättes efter bakgrunden subtraktion8. För att avgöra rhythmicity av reporter uttryck, var både maximal entropi spektral analys (MESA) och manuell inspektion används8. Två DN2s som visar dygnsrytm med en period av ~ 26 h i PER-TDT nivåer som presenteras här (figur 2A, 2 C, och filmen 1).
Med i huvudsak samma kultur setup (figur 1B), studerades effekten av neuropeptid PDF på uttrycket av PER-TDT. Hjärnan hos icke-vandrande larver av samma genotyp som beskrivs ovan var dissekeras antingen vid ZT1 (Zeitgeiber tid 1, 1 h efter lampor på i LD) eller ZT13 (1 h efter släckt). Skålarna innehållande larver var omedelbart kylas på is efter tas ur inkubatorn. På ZT13, var skålarna också insvept i aluminiumfolie att undvika blå-ljus exponering. Hjärnan dissektion utfördes på is och dissekerade hjärnor hölls på is. Hjärnor tas vid ZT13 var täckt med aluminiumfolie när så är möjligt. Således, även om detta förfarande utfördes i labbet lit med naturligt ljus, effekten av ljusexponering på makromolekylära syntes och metabolism var minsta. Hjärnor skannades två gånger med 1 h-intervall för att få originalplansdata. PDF eller fordon (DMSO) lades till odlingsmediet och time-lapse bilder förvärvades varje 1 h för efterföljande 6 h. PER-TDT uttryck profil visade en tid-för-dag-beroende ökning fluorescensintensiteten vid PDF-tillägg vid ZT13 i LNvs och DN1s, och att en mindre utsträckning på DN2s (figur 3)8.
Dessa resultat indikerar att bildteknik och metoden kultur beskrivs här aktiverade inspelningen av PER-TDT rytmer med encelliga upplösning utan märkbar fototoxicitet, fotoblekning eller fokus drift.
Obs: Bilderna analyseras och bearbetas med Fiji28. 10 X iterativ deconvolution utfördes med AutoQuant och Imaris. Mindre drivor i time-lapse bilder korrigerades med rätt 3D drift plugin imagej.
Figur 1: anatomi av klocka nervceller i L3 larval hjärnan och hjärnans explant kultur setup. (A och (B) Scheman över inställningen för hjärnan kultur för långsiktiga imaging (A) och för farmakologiska analyser med kortsiktiga imaging (B). (A) tillämpades vakuum fett (gul) på den plastiska delen av glas botten skålen att fästa PTFE membran. (C) en representativ bild av en LD-följer L3 larval hjärna på ZT2. Uttrycket av molekylära klockan reporter PER-TDT (magenta) är synlig i klocka nervceller, som är märkt av UAS-mCD8::YFP(green) drivs av Clk (856)-gal4. Det finns 3 grupper av differentierade klocka nervceller i L3: 5 LNvs (inklusive den 5: e LNv, som inte uttrycker PDF), 2 DN1s och 2 DN2s, indikeras av vita pilspetsar. Notera uttrycket av PER-TDT i kärnor av klocka nervceller. YFP-negativ PER-TDT-positiva celler är glia och andra undergruppen av klocka nervceller som fortfarande utvecklas. Skalstapeln = 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat av långsiktiga live avbildning av larval klocka neuroner. (A) förstorad vy av DN2s från den långsiktiga time-lapse avbildning av en odlade hjärna. Hjärnan bladsticklingar utarbetades från LD-följer L3 larverna dissekeras på ZT11. Bilder togs varje 2 h från CT17 (dygnsrytm tid 17, 5 h efter subjektiva släckt i DD) för 64 h i DD. sammanslagna bilder av PER-TDT (magenta) och UAS-mCD8::YFP drivs av Clk (856)-gal4 (grön) är till vänster på varje panel och PER-TDT nivåer representeras Heatmap med blå lutning är till höger. Skalstapeln = 10 µm. För endast representation bearbetades bilder med 3D korrigering avdrift och en 10 X iterativ deconvolution. (B) tidpunkten för experimentet. (C) graf som representerar den relativa fluorescensintensiteten normaliseras vid t = 0 av två DN2s (blå och röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat för live-imaging för farmakologiska experiment. LD-följer larval hjärnor var dissekeras och monterad på ZT1 eller ZT13 och PDF (2 µM) eller DMSO tillämpades på ZT2 eller ZT14. PER-TDT uttryck i hjärnan bladsticklingar övervakades varje timme av time-lapse mikroskopi. Genomsnittlig fluorescens intensitet ± SEM normaliserade värde i början av imaging (motsvarande ZT1 eller ZT13) visas. Röda pilarna visar tidpunkten för PDF eller fordonet ansökan (ZT2 eller ZT14). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 och *** p < 0,0001 av tvåvägs ANOVA med Sidaks korrigering för multipla jämförelser. Minst 32 LNvs, 18 DN1s och 16 DN2s analyserades för varje datapunkt. Denna siffra har ändrats från referens8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: långsiktiga levande avbildning av larval DN2 klocka neuroner. Time-lapse film av odlade larval hjärnan dissekeras på ZT11 och avbildas i DD. förstorad utsikt över DN2s i en enda halvklotet uttrycker PER-TDT och UAS-mCD8::YFP drivs av Clk (856)-gal4 visas. Bilder förvärvades varje 2 h för 64 h. PER-TDT (magenta) och YFP (grön) är till vänster och PER-TDT nivåer representeras som en heatmap (blå toning) är till höger. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
| Steg | Reagenser | Koncentration |
| 1. Blanda reagenserna. | KH2PO4 | 4.18 mM |
| CaCl2 | 1,05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0,7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0,7 mg/ml | |
| Glukos | 2 mg/ml | |
| Trehalos | 2 mg/ml | |
| Α-Ketoglutaric acid | 0,35 mg/ml | |
| Fumarsyra | 60 μg/ml | |
| Äppelsyra | 0,6 mg/ml | |
| Bärnstenssyra | 60 μg/ml | |
| Jästextrakt | 2 mg/ml | |
| ICKE Värmeinaktiverade FCS | 20% | |
| dH2O, lättbetong och autoklaverad | ||
| 2. sterilisera med 0,22 μm filter. | ||
| 3. Inkubera i en inkubator för cellodling vid 25 ° C i mörker för 72 h. inkubator har sakna bakterie- eller svampinfektioner kontaminering. | ||
| 4. Tillsätt reagenserna. | Insulin | 2 μg/ml |
| BIS-Tris pH 6.8, sterilisera med 0,22 μm filter | 5 mM | |
| 5. Justera pH till 6,8-6.9. | NaOH (10 N) | ~ 8 droppar |
| 6. sterilisera med 0,22 μm filter. | ||
| 7. alikvot till 5 ml Flash frysa i LN2 Store vid-80 ° C. Använd inom 60 dagar. | ||
| Obs: För stora volymer, sterilisera med filter topp flaska av vakuum, annars använda en spruta filter. Öppna alikvoter i en kultur huva. Engångsbruk. | ||
Tabell 1: förberedelse av SAM medium (1 x) för Drosophila hjärnan kultur. Medium till kultur hjärna explant. Alla åtgärder ska utföras i en kultur huva med undantag för inkubering av mediet.
| Steg | Reagenser | Koncentration |
| 1. Blanda reagenserna. | HEPES-KOH, pH 7,4 | 99 mM |
| NaCl | 1,37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1,7 mM | |
| KH2PO4 | 2,2 mM | |
| Glukos | 33 mM | |
| Sackaros | 438 mM | |
| Ånghärdad dH2O | ||
| 2. sterilisera med 0,45 μm filter. | ||
| 3. förvaras vid 4 ° C till 6 månader. | ||
| Obs: För experimentell användning: späd till 1 X med Ånghärdad dH2O och sterilisera med 0,45 μm filter topp flaska med vakuum eller med filter spruta. Hålla vid 4° C. Öppna i en kultur huva, flera användningsområden. | ||
Tabell 2: beredning av DSS (10 x). Koksaltlösning att dissekera Drosophila hjärnor. Laga i en kultur huva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs vi metoden för långsiktiga time-lapse fluorescensmikroskopi av odlade larval hjärnor. Framgången för denna typ av experiment beror på flera faktorer, såsom kultur, hälsa metod för immobilisering av hjärnan explant, fluorescensintensiteten och signal-brus-förhållande av reporter, tidsmässiga och rumsliga upplösningen, och tillgängligheten till explant. Dessa faktorer kan vara ömsesidigt uteslutande. Exempelvis öka time-lapse frekvens påverkar hälsan hos kulturen och immobilisering av den hjärnan explant kan hindra gasutbyte. Sålunda, att hitta en medelväg (ingen ordlek avsedd) för fenomen som studeras är nyckeln till en framgångsrik protokoll. Den metod som beskrivs här är optimerad för att övervaka uttrycket av fluorescerande dygnsrytm reportrar i omfattningen av timmar till dagar. Det gäller även att studera andra ämnen i Drosophila neurobiologi så länge kritiska processer oförändrad och utförs med omsorg.
I detta protokoll är hjärnan bladsticklingar orörlig i en fibrin propp, vilket skapar en 3D matrix. Även om andra metoder för immobilisering finns, såsom poly-lysin eller laminin beläggning av skyddsglaset, dessa bromsa utvecklingen av larval hjärnor29 och således kan äventyra deras fysiologiska robusthet. Genom sin natur ger fibrin en utmärkt matrix som är lös nog att låta näringsämnen att nå den hjärnan explant och klibbigt nog för att hjärnan ska vara nära täckglaset utan squash det16. På grund av dessa fördelar, fibrin clot metod har varit anställd i olika protokoll för cellodling och hjärnan explant kultur14,17,29,30,31,32 ,33,34. Vi rekommenderar att du använder en fibrin 3D matrix för larval hjärnan kultur även för relativt kortsiktiga experiment som varar mer än några timmar. Larval hjärnan kultur utan 3D matrix ger oregelbundna resultat (inga data anges), förmodligen på grund av fysiska stöd som krävs för att utveckla hjärnor.
Det är viktigt att noggrant följa morfologi av explant och cellerna i vävnaden före och under time-lapse imaging för att upptäcka eventuella tecken på ångest. I de experiment som presenteras här, uttryck för den membran-bundna mCD8::YFP visade intakt morfologi av nervceller och PER-TDT upptäcktes i cytoplasman och kärnan som förväntat, att den hjärnan explant fortfarande livskraftiga och friska under hela varaktigheten av imaging. Dygnsrytm rhythmicity studerades för upp till 72 h men vi observerade att hjärnan bladsticklingar kan vara odlade i upp till 5 dagar utan försämras integriteten hos nervceller och hjärnan (inga data anges). Om neuriter blir dotty eller cell kroppen av de nervceller som brast, dessa är generellt tecken på fototoxicitet och enkelt förhindras genom att anpassa Mikroskop inställningar med detta. Till exempel, försök att minska lasereffekt samtidigt öka storleken pinhole, smart vinst och fönstret för upptäckt. Men i allmänhet är fluorescensintensiteten hos reportern den begränsande faktorn för att få bilder av bra signal-brus-förhållande utan högintensiva laserbestrålning. Utformningen av reportern, val av fluorophore och kopia antalet reportern är därför de första sakerna att tänka på när felsökning av livskraft. (I experimentet presenteras här, 4 kopior av per-tdt reporter användes.)
Andra tecken på en komprometterad hjärnan kultur inkluderar explosion av ett halvklot under time-lapse imaging och förflyttning av vätska ur den hjärnan explant. Detta beror sannolikt på mikro-punkteringar orsakade under dissektion av hjärnan. Ta bort imaginal skivorna bifogas larval hjärnan är den viktigaste källan till punkteringar, alltså avråder vi från den.
Fördelen med fluorescens dygnsrytm levande imaging över Mareld imaging är dess hög rumslig upplösning. Dessutom underlättar hur lätt med cellulära markörer tillsammans med rytm reportern analysen av cell-typ specificitet. Däremot har Mareld superior temporal upplösning och utmärkt signal-brus-förhållande19,20,21. Totala dock antalet cykling neuroner per hjärnan avbildas av Mareld inte överlägsen jämfört med antalet erhålls med vår metod8,19,21. I de flesta fall synkroniseras rytmer av fluorescerande reportrar identifieras med vår metod inom samma kluster av klocka nervceller (se figur 2 c), som visas med Mareld19. Fas skillnader mellan klockan neuron kluster observerades både fluorescens och Mareld dygnsrytm imaging8,19,21. Därför både metoder är lika giltiga att observera dygnsrytmen i odlade hjärnor, och valet mellan Blomningstid och Mareld bör göras enligt syftet med studien.
Den viktigaste tekniska svårigheten med denna metod är i inbäddning steg. Eftersom protokollet kräver snabb-scanning confocal imaging med ett inverterat Mikroskop och ljusspridande i hjärnvävnad minskar fluorescens upptäckt särskilt när imaging djupt i vävnaden, hjärnan bladsticklingar ska monteras så nära som möjligt att skyddsglaset. Reproducerbarheten av imaging resultaten beror dessutom på konsekvensen av z-placerar av nervceller av intressen. Det är därför viktigt att orientera och montera hjärnor alltid på samma sätt, som kräver övning. Till bild neuronala kluster ligger i anatomiskt distinkta positioner, det kan krävas att köra separata experiment med olika hjärnan explant orientering. I området i närheten finns det alternativa metoder för djup-vävnad levande avbildning som inte kräver odla vävnad, såsom av 2-foton mikroskopi och lätta blad mikroskopi. Den senare har framgångsrikt använts till bild dygnsrytm kalcium dynamics i levande Drosophila hjärnor22,23. Dock lätta blad mikroskopi har lägre rumslig upplösning än konfokalmikroskopi och därmed dess tillämpning av imaging encelliga upplösningen är fortfarande en utmaning.
Sammanfattningsvis kombinerar detta protokoll ett enkelt kultur system av larval hjärnan bladsticklingar under förhållanden som stöder time-lapse bild förvärv av fluorescerande reportrar under dagarna och kvantitativ analys av biologiska rytmer. Det finns vissa begränsningar som diskuterats ovan, kan metodiken anpassas bilden olika reportrar i larver och vuxna Drosophila hjärnor och ytterligare ändras för att öka känslighet och rumslig upplösning. Till exempel axonal prognoser ligger djupt i hjärnan eller vesikulär transport kan upptäckas genom att kombinera vår hjärna explant kultur teknik med två-foton mikroskopi35. Som sagt, det är fortfarande möjligt att utföra live-imaging av organeller som mitokondrier i vuxna hjärnan explants använder detta protokoll (inga data anges). Vi presenterade också variationen av detta protokoll för bad tillämpningen av experimentella lösning i farmakologiska analyser. Man kunde förlänga detta protokoll för att utföra ”puls-chase” experiment genom att manuellt ersätta odlingssubstratet att tvätta ut drogen eller använda en perfusion kammare18,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Michael Rosbash för sitt mentorskap och stöd under den inledande fasen av utvecklingen av denna metod. Detta arbete finansierades av JST PRESTO programmet, schweiziska National Science Foundation (31003A_149893 och 31003A_169548), European Research Council (ERC-StG-311194), Novartis stiftelse för medicinsk-biomedicinsk forskning (13A39) och universitetet i Genève .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
