Summary
Målet med denne protokol er at etablere ex vivo Drosophila larve hjernen kultur optimeret til at overvåge døgnrytmen Molekylær rytme med langsigtede fluorescens time-lapse billeddannelse. Anvendelsen af denne metode til farmakologisk assays behandles også.
Abstract
Døgnrytmen pacemaker kredsløb orchestrates rytmiske adfærdsmæssige og fysiologiske udgange koordineres med miljømæssige stikord, som dag/nat cyklusser. Den molekylære ur inden for hver pacemaker neuron genererer døgnrytmen i genekspression, der ligger til grund for de rytmiske neuronal funktioner afgørende for driften af banen. Undersøgelse af de individuelle molekylære oscillatorer i forskellige underklasser af pacemaker neuroner og deres interaktion med neuronal signalering egenskaber giver en bedre forståelse af døgnrytmen pacemaker kredsløb. Her præsenterer vi en time-lapse fluorescerende mikroskopi tilgang udviklet til at overvåge den molekylære urværk i ur neuroner i kulturperler Drosophila larve hjernen. Denne metode giver mulighed for multi-dages optagelse af rytmer af genetisk kodet fluorescerende døgnrytmen reportere på én celle opløsning. Denne opsætning kan kombineres med farmakologiske manipulationer nøje analysere real-time svar af den molekylære ur til forskellige forbindelser. Ud over døgnrytmen giver denne multipurpose metode i kombination med kraftfulde Drosophila genetiske teknikker mulighed for at studere forskellige neuronal eller molekylære processer i levende hjernevæv.
Introduction
Døgnrytmen ure hjælpe organismer til at tilpasse sig de periodiske miljøforandringer genereret af 24 h rotation af jorden. Låst transcriptional-translationel feedback-sløjfer almindeligvis ligge til grund for de molekylære maskineri af døgnrytmen ure på tværs af arter1. Døgnrytmen pacemaker kredsløb bestående af ur-holdige neuroner omfatter tid af dagen oplysninger formidles af de miljømæssige stikord, som lys/mørke (LD) og temperatur cyklusser, at orkestrere rytmer i et væld af daglige fysiologiske og adfærdsmæssige processer2,3. Koordinering af Molekylær rytme med neuronal input og output er af afgørende betydning for driften af døgnrytmen kredsløb, men stadig kun delvist forstået.
I Drosophila, kernen i den molekylære ur, TAKTCYKLUS (CLK/CYC) heterodimer aktiveres transskription af periode (per) og tidløse (tim). PER og TIM udgør en kompleks og Indtast atomkernen, hvor de hæmmer transcriptional aktivitet på CLK/CYC og dermed deres egen transskription. Post-Transcriptional og posttranslationelle forordninger forårsage forsinkelser mellem CLK/CYC-medieret transskription og undertrykkelse af PER / TIM, sikre generation af circa 24-h molekylære svingninger1,3,4 . Omkring 150 neuroner indeholdende disse molekylære ure form flyver et kredsløb til kontrollen døgnrytmen opførsel af voksen5. En meget enklere, men fuldt funktionelle døgnrytmen kredsløb bestående af 3 grupper af ur neuroner - 5 ventrale Lateral neuroner (LNvs; 4 PDF-positive LNvs og én PDF-negative LNv, se nedenfor), 2 dorsale Neuron 1s (DN1s) og 2 dorsale Neuron 2s (DN2s) - er til stede i den larve hjernen6,7.
Den simpel larve døgnrytmen kredsløb tilbyder en fremragende model til at studere samspillet mellem Inter neuronal kommunikation og den molekylære urværk. Ved hjælp af vores nyudviklede fluorescerende journalist PER-TDT, som efterligner niveauer af PER protein og dens subcellulært placering, vi har søgt at beskrive dynamikken i den molekylære urværk i forskellige ur neuron undergrupper i larve døgnrytmen kredsløb 8. desuden at vide nøglerolle neuropeptid pigment-spreder faktor (PDF) produceret af 4 LNvs i reguleringen af døgnrytmen på neuronal niveau9,10,11, vi ønskede at undersøge direkte effekt af PDF på de molekylære ure. Med henblik herpå udviklede vi en metode til at overvåge døgnrytmen genekspression rytmer i larve hjernen explant over flere dage af time-lapse Konfokal mikroskopi. Protokollen var også tilpasset farmakologiske assays til at teste effekten af PDF eller andre forbindelser på niveauet af PER-TDT. Således består tilpasning af at gøre hjernen eksplantat kultur tilgængeligt for drug application, øge tidsmæssige opløsning og imaging for en kortere varighed.
Ex vivo kultur af Drosophila hjerner af forskellige udviklingstrin har været tidligere etablerede12,13,14,15,16,17 ,18. Der henviser til, at disse protokoller er blevet anvendt for imaging forskellige biologiske fænomener, nogle af dem er ikke kompatible med billedbehandling med enkelt-celle opløsning eller understøtter ikke kulturen i mere end adskillige timer. Alternative metoder til at udføre langsigtede live imaging af døgnrytmen neuroner i Drosophila omfatter bioluminescens billeddannelse af Molekylær rytme19,20,21 og fluorescens billeddannelse af calcium indikator med lys ark mikroskopi22,23. Selvom bioluminescens imaging kan opnå højere tidsmæssige opløsning og lys ark mikroskopi kan være fleksibel for i vivo billeddannelse, de er begrænsede på den rumlige opløsning og kræver specialiseret mikroskop systemer.
Metoden beskrevet her er skræddersyet til at visualisere fluorescerende signaler i hele hjernen kultur med enkelt-celle opløsning over flere dage. Denne letkøbt og alsidig metode kunne tilpasses billedet kulturperler voksne flyve hjerner og for farmakologiske forsøg at studere mange forskellige problemer i Drosophila neurobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fremstilling af stamopløsninger Under en kultur hætte
- Forberede 400 mL 1 x Schneider Active Medium (SAM) optimeret til ex vivo kultur af larve hjerner (modificeret fra reference24,25) (tabel 1). Alikvot til 5 mL og flash fryse i flydende kvælstof (LN2), opbevares ved - 80 ° C.
- Forbered 1 x Dissecting saltopløsning (DSS) ved at fortynde 10 x stamopløsning (modificeret fra reference26) (tabel 2).
- Alikvot fibrinogen til 10 mg og opbevares ved 4 ° C til en enkelt brug.
Forsigtig: Vejer fibrinogen under laminar flow, handsker, da det er skadeligt. - Forberede thrombin stamopløsning i SAM (1500 NIH enhed/mg) og alikvot til 10 µL, flash fryse i LN2 og holde ved-80 ° C.
Forsigtig: Brug handsker når du håndterer thrombin, som det er skadeligt. - Alikvot stamopløsning af 100 x Penicillin-Streptomycin. Holde på-20 ° C.
- Skære cirkler af polytetrafluorethylen (PTFE) membran (Se materialer tabel) til den størrelse, der passer inde i en glas bund fad. Skyl dem i 70% EtOH og derefter i autoklaveres dH2O. Sterilize og tør under laminar flow med UV. Holde i en steril petriskål. Engangsbrug.
Bemærk: PTFE er en porøs fleksibel membran, der tillader gasudveksling og forhindrer medium fordamper under langvarig optagelse.
2. time-lapse mikroskopi Setup
Bemærk: Følgende opsætning er for en tandem scanner inverteret Konfokal mikroskop (Se materialer tabel) udstyret med en resonant scanner (8.000 Hz). Systemet indeholder en yderst følsom foto-multiplikator detektor, som sammen med resonant scanneren forhindrer fototoksicitet og photobleaching. Temperatur og luftfugtighed er kontrolleret i et mikroskop miljømæssige kammer (Se Materialer tabel) der dækker det meste af mikroskopet.
- Placer en fase-top fugtigt kammer.
- Tænd temperatur og luftfugtighed controllerne til Reagensglasset mikroskop kammer til 25 ° C og 80% luftfugtighed.
- For at udføre eksperimenter i konstant mørke (DD), dække mikroskop miljømæssige kammer med en uigennemsigtig klud (medmindre mikroskop kammer er lavet af et uigennemsigtigt materiale).
- Hvis bruger en vand-fordybelse mål, placere en vand fordybelse Micro Dispenser på toppen af målet og programmere en protokol med Autoimmersion mål Controller-software til at dispensere vand med en konstant hastighed under time-lapse billeddannelse.
Bemærk: Vand-fordybelse mål sammen med en vand dispenser eller tør mål linse anbefales for langsigtet live imaging, som andre slags fordybelse medium vil tørre ud. - Placer en petriskål indehaveren på scenen, inde i fugtigt kammer.
- Lancere mikroskop software og Vælg tilstanden resonant scanner fra den første dialogboks. Vælg OK for at initialisere fase hvor anmodet. Gå til fanen konfiguration og Hardware konfiguration at tænde de relevante laser linjer.
- Gå til at erhverve fane og XY panel at vælge torettede tilstand og indstille billede erhvervelse parametre.
Bemærk: Den beskrevne imaging setup præsenteres her (figur 2, figur 3 og Movie 1) er optimeret til at observere døgnrytmen udtryk for specifikke fluorescerende journalister. Følgende parametre blev valgt at bedst passer til vores specifikationer: 40 X vand fordybelse mål, 8 X line gennemsnit med 512 × 512 billedopløsning. For multicolor imaging, sekventielle billede erhvervelse er påkrævet, når emissionen bølgelængden af en fluorophore og excitation bølgelængden af en anden overlapning (her, bølgelængder af gul fluorescerende proteiner (YFP) emission og tomat excitation overlapning). Vælg den sekventielle mode "i mellem stack", da det er den hurtigste og flytning af ur neuroner er ubetydelig under erhvervelse af en Z-stak. Mikroskopi indstillinger skal tilpasses til formålet med hvert forsøg.
3. opsætning af larve hjernen eksplantat kultur
Bemærk: Hele proceduren fra dissektion til indlejring af hjernen explants tager ~ 30 min.
-
Forberedelse af reagenser under en kultur hætte.
- Tø en alikvot af Trombin og holde ved stuetemperatur indtil den indlejring trin (trin 3.3). Engangsbrug.
- Tø hurtigt en alikvot af SAM ved 37 ° C og holde på isen til en enkelt brug.
- Tilføje SAM til 10 mg alikvot af fibrinogen til 10 mg/mL, svirp forsigtigt og inkuberes ved 37 ° C i mindst 30 min. og under indlejring trin (trin 3.3). Engangsbrug.
Bemærk: Ikke Inkuber fibrinogen løsning mere end 2 timer som det begynder at polymerisere. - Tø en alikvot af 100 x stock Penicillin-Streptomycin. Forberede 2,5 mL af SAM indeholdende 1 x Penicillin-Streptomycin (SAM/antibiotika). Holde ved stuetemperatur.
Bemærk: Butikken de resterende 100 x stock Penicillin-Streptomycin ved 4 ° C op til 1 måned. - Forberede en alikvot af 500 µL fra de resterende SAM. Holde på is.
- For langsigtet imaging, anvende autoklaveres vakuum fedt på plastdel på bunden af bunden glasfad (figur 1A) og sterilisere under laminar flow med UV.
-
Dissektion af centralnervesystemet og ventral nerve ledningen.
- Ren pincet og 2 x 3-godt glas dissektion retter med 70% EtOH. Hæld 400 µL af DSS i 4 brønde og 400 µL af SAM i en brønd. Holde på is.
- Øse ud flyve medium indeholdende larver og vælge ikke-vandrer 3rd instar larver (L3) med pincet. Skyl dem successivt i 2 DSS-fyldt brønde. Holde dem i den 3rd DSS-fyldt godt på is, der anesthetizes larver.
Bemærk: L3 varer ca 2 dage ved 25 ° C. At observere hjernen i fysiologisk relevante tidsramme valgte vi at bruge ikke-vandrer L3 larver. Andre undergrupper af ur neuroner, som l-LNvs og DN3s, begynder at blive dannet på vandrer L3 fase, men de er ikke nødvendigvis cykling endnu (data ikke vist). Derfor, selv om det er muligt at billedet cykling ur neuroner på dette stadium (data ikke vist), det er vigtigt at skelne omhyggeligt allerede funktionel larve ur neuroner fra at udvikle dem til dataanalyse. Non-vandrer L3 vises ca 4 til 4.5 dage efter æglægning på 25 ° C. Hvis du vil bruge denne protokol til at studere døgnrytmen, synkronisere (entrain) udvikler larverne i 12 h/12 h LD cyklusser ved 25 ° C i 3 dage før indsamling L3 larver. - Dissekere larve hjerner med fine pincet i 4th DSS-fyldte godt, som ikke er blevet anvendt til skylning larver, ved hjælp af inside-out metode27.
- Kort, skære larve i to, forsigtigt knibe munden kroge med et par pincet og roll op indefra og ud kroppen væggen ved hjælp af de andre par pincet, dermed udsætte hjernen. Gratis hjernen ved at skære alle luftrøret og nerver, der tillægger resten af kroppen.
- Opsug hjernen i ca 3 µL af DSS med 20 µL pipette (pre skylles med DSS) og dispensere i den SAM-fyldt godt. Gentag proceduren for op til 7 hjerner.
Bemærk: Dissektion bør udføres på en kold overflade til at holde larverne bedøvede og hjernen kølet. For eksempel, placere dissektion parabol på en afkøling blok tilsluttet en pumpe til at cirkulere is-kølet vand. Dissektion procedure tager ~ 30 s pr. hjerne. Det er vigtigt at holde øje/antennal fantasiens diske tilsluttet hjerner og ventrale nerve ledningen intakt. Rive ned af disse dele vil skade hjernen og reducere kvaliteten af kulturen. Også, undgå at udsætte hjerner til luften. Før sugning første hjernen, pipetteres op og ned med DSS, der indeholder dele af dissekerede larverne, da det forhindrer hjerner klistrer til væggen i spidsen.
-
Indlejring af hjernen explants i en 3D matrix og montering (~ 20 min).
- Nedsænkes en dissekeret hjernen i fibrinogen brugsopløsning (fibrinogen slutkoncentration ~3.3 mg/mL, 10.5 µL pr. hjerne) som følger:
- Opsug 3,5 µL af SAM/antibiotika (med samme spidsen anvendes i afsnit 3.2.3). Opsug en dissekeret hjernen fra dissektion godt ind i samme pipette spidsen uden udlevering SAM/antibiotika medium i spidsen.
- Give afkald på hjernen og medium på låget af en steril petriskål. Tilføje en anden 3,5 µL af SAM/antibiotika og 3,5 µL af varm fibrinogen/SAM 10 mg/mL opløsning på drop indeholdende hjernen. Bland løsning omkring hjernen forsigtigt af pipettering med 20 µL pipette spids.
Bemærk: Ved hjælp af en pipette i stedet for pincet i dette trin undgår at stresse hjernen. - Tag 2 µL af fibrinogen brugsopløsning på rullelisten og anvende det på coverslip af glas bund parabol som en lille cirkel. Tilføj 0,8 µL af thrombin og bland hurtigt med en pipette spids. Fibrinogen omdannes til fibrin og begynder at polymerisere.
- Tage hjernen, der sidder i fibrinogen arbejder løsning (trin 3.3.1) mellem et par pincet og Placer det på matrix, når en hvid matrix af fibrin er synlige. Orientere hjernen forreste side ned (for imaging ur neuroner). Skubbe det så tæt som muligt til at dække glas. Fibrin blodprop består af lag af fibrin. Vælge ét lag og fold det på toppen af hjernen med små og blide bevægelser uden afmontering af matrix.
- Gentag 2 til 3 gange fra forskellige dele af blodprop til at stabilisere hjernen.
Bemærk: Når du håndterer hjernen med pincet, være omhyggelig med ikke at tørre det eller pålægge det en fysisk stress.
- Gentag 2 til 3 gange fra forskellige dele af blodprop til at stabilisere hjernen.
- Tilføj 20 µL af SAM/antibiotika oven på indkapslet hjernen til at stoppe handlingen af thrombin.
- Gentag proceduren for at montere de resterende hjerner. Det er muligt at indlejre op til 5 til 6 hjerner på et glas bund fad.
- For langsigtet live imaging, skal du tilføje 600 µL af SAM/antibiotika i de indre godt (glasset del). Placer en pre-cut PTFE membran oven på mellemlang og holde det til vakuum fedt anvendt på plastdel i bunden (3.1.5) (figur 1A).
- Farmakologiske assays, fyld fadet med 2 mL af SAM/antibiotika (figur 1B).
Bemærk: Det er meget vigtigt at undgå fordampning af mediet, som osmolalitet af mediet er afgørende for levedygtigheden af neuroner. For langsigtet imaging eksperimenter, er det derfor nødvendigt at forsegle kultur fadet med PTFE membran. Der henviser til kortsigtede forsøg, forsegling membran ikke kræves så længe fadet er fyldt med 2 mL af medium og overvåges i et befugtet kammer.
4. time-lapse billede erhvervelse
- Placer glas bund fad på petriskål indehaveren inde i fase-top fugtigt kammer.
- Gå til z-stakken panel under fanen erhverve og z-afsnittet trin fra mikroskop software (2 µm × ~ 40 i eksperimenter vist i figur 2 og figur 3og Movie 1). Indstille begyndelsen af en z-stack på flyet længst borte fra coverslip og ende på overfladen af hjernen eksplantat, tæt på coverslip. Selvom hjernen bevægelser er ubetydelig, tilføje ekstra z-sektioner i begyndelsen og slutningen af z-stakken.
- Gå til Mark & Find panel og set-up multi-position billede erhvervelse. Med en 40 X mål, kan 1 hjernen halvkugle blive fanget i en synsfelt
- Gå til erhvervelse mode panelet og vælge xyzt (z-stakken time-lapse). Gå til tid erhvervelse panelet og angive de foretrukne tidsparametre interval og frekvens.
Bemærk: Erhverve time-lapse billeder med ønskede frekvens. Bemærk at langsigtede live imaging (24-72 h) med bortfalder tidsinterval kortere end 2 h har tendens til at resulterer i færre cykling neuroner, sandsynligvis fordi det mindsker levedygtigheden af neuroner. Datadiskenheden udvider som satsen for image erhvervelse stiger, hvilket gør dataanalyse og opbevaring mere udfordrende.
5. farmakologiske behandling af hjernen Explants med kortsigtede Live Imaging
Bemærk: Den følgende procedure er stort set den samme som for langsigtet imaging men kræver ikke en PTFE membran. For at undgå at udsætte hjerner til blå lys, når kemiske føjes til kultur, bør mikroskopet placeres i det mørke rum med rødt lys.
- Gå til tid erhvervelse panel og sæt det ønskede tidsinterval og antal scanning for at opnå de grundlæggende data fra før drug application. Start scanning.
- Efter oprindeligt scanningen er fuldført, lift scanningen hovedet af mikroskop system. Fjern låget på scenen-top fugtighed controller og meget forsigtigt fjerne låget af bunden glasfad uden at flytte den.
- Fjerne den passende mængde af næringssubstratet, hvis nødvendigt. Tilføj den eksperimentelle løsning på mellemlang, og omhyggeligt og meget forsigtigt blandes med en steril pipette overføres Pasteur uden at røre de hjerne explants.
Bemærk: For bad anvendelse af PDF, bruge 2 µM PDF stamopløsning (i 10% DMSO). - Erstatte låg nederst glasskål og fugtigt kammer og scanningen hovedet. Hvis du bruger, flytte den sorte uigennemsigtig klud omkring mikroskop kammer.
- Kontrollere hvis hjerner er på deres originale positioner i live scanningstilstand. Juster om nødvendigt.
- Gå til tid erhvervelse panel og sæt det ønskede tidsinterval og antal scanning. Start scanning.
Bemærk: Her vi testede time-lapse billeder erhvervet hver time i op til 10 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her, viser vi de repræsentative resultater af den langsigtede optagelse af døgnrytmen fluorescerende reporter i ex vivo larve hjernen kultur og live imaging resultaterne af PDF bad ansøgning på reporter udtryk.
Non-vandrer L3 larver at udtrykke den molekylære ur journalist PER-TDT og UAS-mCD8::YFP drevet af en ur neuron driver Clk (856)-gal4 (figur 1 c) var indblandede i LD. Brains var dissekeret og sat op til langtidskulturer i løbet af sidst lys fase af LD cyklus bare forudgående den mørke fase (figur 1A og 2B). Time-lapse imaging blev udført i DD og hjernen explants var afbildet hver 2 h til 64 h. En SUM-stak indeholdende neuron af interesse blev oprettet og gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af området svarende til neuron blev målt efter baggrund subtraktion8. Bestem rhythmicity ytringsfriheden reporter ved blev maksimal entropi spektrale analyse (MESA) og manuel kontrol brugt8. To DN2s, der viser døgnrytmen med en periode af ~ 26 h i PER-TDT niveauer er præsenteret her (figur 2A, 2 C, og filmen 1).
Bruger stort set de samme kultur setup (figur 1B), blev effekten af neuropeptid PDF på udtryk for PER-TDT studeret. Hjerner af ikke-vandrer larverne af den samme genotype som beskrevet ovenfor blev dissekeret enten på ZT1 (Zeitgeiber tid 1, 1 h efter lys på i LD) eller ZT13 (1 h efter lys slukket). Hætteglas indeholdende larver var straks nedkøles på is efter taget ud af varmeskabet. På ZT13, blev hætteglassene også pakket ind i aluminiumsfolie at undgå blåt-lys eksponering. Hjernen dissektion blev udført på is og dissekeret hjerner blev holdt på is. Hjerner taget på ZT13 var dækket med aluminiumsfolie når det er muligt. Således, selv om denne procedure blev udført i laboratoriet tændt med naturligt lys, effekten af lys eksponering på makromolekylære syntese og stofskifte var minimale. Hjernen blev scannet to gange med 1 h interval til at få de grundlæggende data. PDF eller køretøj (DMSO) blev føjet til substratet og time-lapse billeder blev erhvervet hver 1 h for efterfølgende 6 h. PER-TDT udtryk profil viste en tid af dagen afhængige stigning i fluorescens intensitet på PDF tilsætning på ZT13 i LNvs og DN1s, og at en mindre grad på DN2s (figur 3)8.
Disse resultater viser, at den Billeddannende teknik og kultur metoden her aktiveret optagelse af PER-TDT rytmer på én celle opløsning uden mærkbar fototoksicitet, photobleaching eller fokus drift.
Bemærk: Billeder blev analyseret og behandlet ved hjælp af Fiji28. 10 X iterativ deconvolution blev udført med AutoQuant og Imaris. Mindre vildfarelser i time-lapse billeder blev rettet med rigtige 3D drift plugin for ImageJ.
Figur 1: anatomi af ur neuroner i L3 larve hjernen og hjernens eksplantat kultur setup. (A og B) Skemaer af hjernen kultur setup for langsigtet imaging (A) og farmakologiske assays med kortsigtede imaging (B). (A), blev vakuum fedt (gul) anvendt på den plast del af bunden glasfad vedhæfte PTFE membran. (C) et repræsentativt billede af en LD-medrives L3 larve hjerne på ZT2. Udtryk for den molekylære ur journalist PER-TDT (magenta) er synlige i ur neuroner, der er mærket af UAS-mCD8::YFP(green) drevet af Clk (856)-gal4. Der er 3 grupper af differentierede ur neuroner i L3: 5 LNvs (herunder de 5 LNv, som ikke udtrykker PDF), 2 DN1s og 2 DN2s, anført af hvide pilehoveder. Bemærk udtryk for PER-TDT i kerner af ur neuroner. YFP-negative PER-TDT-positive celler er glia og andre undergruppe af ur neuroner, der er under stadig udvikling. Skalalinjen = 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative resultater af langsigtede live imaging larve ur neuroner. (A) forstørret visning af DN2s fra den langsigtede time-lapse imaging af en kulturperler hjerne. Hjernen explants blev udarbejdet fra LD-medrives L3 larverne dissekeret på ZT11. Billeder blev taget hver 2 h fra CT17 (døgnrytmen. tid 17, 5 h efter subjektive lys slukket i DD) for 64 h i DD. sammenflettet billeder af PER-TDT (magenta) og UAS-mCD8::YFP drevet af Clk (856)-gal4 (grøn) er på venstre side af hvert panel og PER-TDT niveauer repræsenteret som heatmap med blå gradient er til højre. Skalalinjen = 10 µm. For repræsentation kun, blev billeder behandlet med 3D korrektion drift og en 10 X iterativ deconvolution. (B) tidspunktet for eksperimentet. (C) graf der repræsenterer relative fluorescens-intensiteten normaliseret til t = 0 i to DN2s (blå og rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative resultater live Imaging for farmakologiske forsøg. LD-medrives larve hjerner blev dissekeret og monteret på ZT1 eller ZT13 og PDF (2 µM) eller DMSO blev anvendt på ZT2 eller ZT14. PER-TDT udtryk i hjernen explants blev overvåget hver time af time-lapse mikroskopi. Gennemsnitlig fluorescens intensitet ± SEM normaliseret til værdien ved starten af imaging (svarende til ZT1 eller ZT13) er vist. Røde pile indikerer PDF eller køretøjet ansøgningstidspunktet (ZT2 eller ZT14). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 og *** p < 0,0001 af to-vejs ANOVA med Sidaks korrektion for flere sammenligninger. Et minimum af 32 LNvs, 18 DN1s og 16 DN2s blev analyseret for hvert datapunkt. Dette tal er blevet ændret fra reference8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: langsigtet live imaging larve DN2 ur neuroner. Time-lapse film af kulturperler larve hjernen dissekeret på ZT11 og afbildet i DD. Magnified udsigt over DN2s i en enkelt halvkugle udtrykker PER-TDT og UAS-mCD8::YFP drevet af Clk (856)-gal4 er vist. Billeder blev erhvervet hver 2 h til 64 h. PER-TDT (magenta) og YFP (grøn) er til venstre og PER-TDT niveauer repræsenteret som et heatmap (blå gradient) er til højre. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
| Trin | Reagenser | Koncentration |
| 1. Bland reagenser. | KH2PO4 | 4.18 mM |
| CaCl2 | 1,05 mM | |
| MgSO4.7H2O | 0,7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0,7 mg/ml | |
| Glukose | 2 mg/ml | |
| Trehalose | 2 mg/ml | |
| Α-Ketoglutaric syre | 0,35 mg/ml | |
| Fumarsyre | 60 μg/ml | |
| Æblesyre | 0,6 mg/ml | |
| Ravsyre syre | 60 μg/ml | |
| Gærekstrakt | 2 mg/ml | |
| IKKE varme-inaktiverede FCS | 20% | |
| dH2O, autoklaveres | ||
| 2. sterilisere med 0,22 μm filter. | ||
| 3. der inkuberes i en inkubator for cellekultur ved 25 ° C i mørke for 72 h. inkubator har at være blottet for bakterie- eller svampeinfektion forurening. | ||
| 4. Tilføj reagenser. | Insulin | 2 μg/ml |
| BIS-Tris pH 6,8, sterilisere med 0,22 μm filter | 5 mM | |
| 5. Juster pH 6,8-6.9. | NaOH (10 N) | ~ 8 dråber |
| 6. sterilisere med 0,22 μm filter. | ||
| 7. prøve til 5 ml Flash fryse i LN2 butik ved-80 ° C. Brug inden for 60 dage. | ||
| Bemærk: For store mængder, sterilisere med filter top flaske af vakuum, ellers brug en sprøjte filter. Åben delprøver i en kultur hætte. Engangsbrug. | ||
Tabel 1: forberedelse af SAM medium (1 x) til Drosophila hjernen kultur. Medium til kultur hjerne eksplantat. Alle trin skal udføres i en kultur hætte undtagen inkubation af mediet.
| Trin | Reagenser | Koncentration |
| 1. Bland reagenser. | HEPES-KOH, pH 7,4 | 99 mM |
| NaCl | 1,37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1,7 mM | |
| KH2PO4 | 2,2 mM | |
| Glukose | 33 mM | |
| Saccharose | 438 mM | |
| autoklaveres dH2O | ||
| 2. sterilisere med 0,45 μm filter. | ||
| 3. opbevares ved 4 ° C til 6 måneder. | ||
| Bemærk: For eksperimenterende brug: fortyndes til 1 X med autoklaveres dH2O og sterilisere med 0,45 μm filter top flaske af vakuum eller med filter sprøjte. Holde ved 4° C. Åben i en kultur hætte, flere anvendelsesmuligheder. | ||
Tabel 2: forberedelse af DSS (10 x). Saltopløsning til at dissekere Drosophila hjerner. Forberede i en kultur hætte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi metoden for langsigtede fluorescens time-lapse mikroskopi af kulturperler larve hjerner. Succes af denne slags eksperimenter, afhænger af flere faktorer, såsom kultur, sundhed metode for immobilisering af hjerne eksplantat, fluorescens intensitet og signal / støj forholdet mellem reporter, tidsmæssige og rumlige opløsning, og tilgængelighed til eksplantat. Disse faktorer kan være gensidigt udelukker hinanden. For eksempel, stigende time-lapse hyppighed påvirker sundheden for kulturen, og immobilisering af hjernen eksplantat kunne vanskeliggøre luftskiftet. Således, at finde en gylden middelvej (ingen bestemt ordspil) for fænomener under undersøgelse er nøglen til en vellykket protokol. Metoden beskrevet her er optimeret til at overvåge udtryk for fluorescerende døgnrytmen journalister i omfanget af timer til dage. Det er også relevant at studere andre fag i Drosophila neurobiologi som kritiske processer er uændret og udført med omhu.
I denne protokol, er hjernen explants immobiliseret i en fibrin blodprop, der skaber en 3D matrix. Selv om andre metoder for immobilisering findes, såsom poly-lysin eller laminin belægning af dækslet glas, disse sinke udviklingen af larve hjerner29 og kan dermed kompromittere deres fysiologiske robusthed. I sagens natur giver fibrin en fremragende matrix, der er løse nok til at give næringsstoffer til at nå hjernen eksplantat og klistret nok til hjernen til at være tæt på at dække glas uden kvaser det16. På grund af disse fordele, fibrin blodprop metode har været ansat i forskellige protokoller for cellekultur og hjernen explant kultur14,17,29,30,31,32 ,33,34. Vi anbefaler at bruge en fibrin 3D matrix for larver hjernen kultur selv for relativt kortsigtede eksperimenter, der vare mere end et par timer. Larve hjernen kultur uden 3D matrix giver uregelmæssig resultater (data ikke vist), sandsynligvis på grund af manglende fysiske support, der kræves for at udvikle hjerner.
Det er vigtigt at omhyggeligt observere morfologi af eksplantat og celler i vævet før og under time-lapse imaging for at opdage eventuelle tegn på angst. I forsøgene præsenteres her, udtryk for membran-bundet mCD8::YFP viste intakt morfologi af neuroner og PER-TDT blev opdaget i cytoplasmaet og kernen som forventet, der angiver, at hjernen eksplantat forblev rentable og sunde i hele varighed af billedbehandling. Døgnrytmen rhythmicity blev studeret i op til 72 timer, men vi observerede, at hjernen explants kan være kulturperler i op til 5 dage uden forværrede integriteten af neuroner og hjerne (data ikke vist). Hvis neurites bliver bims eller cellen kroppen af neuroner brast, disse er generelt tegn for fototoksicitet og nemt forhindret ved at tilpasse mikroskop indstillinger i overensstemmelse hermed. For eksempel prøve at reducere laser power samtidig øge pinhole størrelse, smart gevinst og vinduet påvisningsgrænsen. Men generelt, fluorescens intensiteten af journalisten er den begrænsende faktor for at opnå billeder af god signal-støj-forholdet uden høj intensitet laser belysningsstyrke. Design af reporter, valg af fluorophore og kopiere nummer af journalisten er derfor, de første ting at overveje, når fejlfinding af problemer med levedygtighed. (I eksperimentet præsenteres her, 4 kopier af per tdt reporter var bruges.)
Andre tegn på en kompromitteret hjernen kultur omfatter brast af en halvkugle under time-lapse imaging og bevægelse af væske ud af hjernen eksplantat. Dette er sandsynligvis på grund af mikro-punktering forårsaget under dissektion af hjernen. At fjerne de imaginære diske knyttet til larve hjernen er den vigtigste kilde til punkteringer, således advarer vi imod det.
Fordelen ved fluorescens døgnrytmen live imaging over bioluminescens imaging er dens høje rumlige opløsning. Derudover letter brugervenlighed ved hjælp af cellulære markører sammen med rytme reporter analysen af celletype specificitet. Derimod har bioluminescens overlegen tidsmæssige opløsning og fremragende signal / støj-forhold19,20,21. Samlet er antal cykling neuroner pr. hjerne afbildet af bioluminescens imidlertid ikke overlegen i forhold til opnået med vores metode8,19,21. I de fleste tilfælde er rytmer af fluorescerende journalister fundet med vores metode synkroniseret inden for den samme klynge af ur neuroner (Se figur 2 c), som vist med bioluminescens19. Fase forskelle mellem ur neuron klynger blev observeret i både fluorescens og bioluminescens døgnrytmen imaging8,19,21. Derfor, begge metoder er lige så gyldige i observere døgnrytmen i kulturperler hjerner og valget mellem fluorescens og bioluminescens bør træffes ifølge Formålet med undersøgelsen.
Den største tekniske vanskelighed ved denne metode er i trinnet indlejring. Fordi protokollen kræver hurtig scanning Konfokal imaging med en inverteret mikroskop, og lysspredning i hjernevæv reducerer fluorescens påvisning, især når imaging dybt i vævet, hjernen explants skal monteres så tæt som muligt at dække glas. Derudover afhænger de billeddiagnostiske reproducerbarhed sammenhængen i z-positioner af neuroner interesser. Derfor er det vigtigt at orientere og montere hjerner altid på samme måde, som kræver praksis. Til billede neuronal klynger placeret i anatomisk adskilte positioner, det kan være nødvendigt at køre separat eksperimenter med forskellige hjernen eksplantat orientering. Der er alternative metoder til dyb væv live imaging, der ikke kræver dyrkning væv, såsom to-foton mikroskopi og lys ark mikroskopi. Sidstnævnte har held været anvendt til billede døgnrytmen calcium dynamikken i live Drosophila hjerner22,23. Dog lys ark mikroskopi har lavere rumlige opløsning end Konfokal mikroskopi og dermed sin ansøgning til billedbehandling med enkelt-celle opløsning er fortsat en udfordring.
I Resumé kombinerer denne protokol en simpel kultur system af larve hjernen explants under betingelser, der understøtter time-lapse billede erhvervelse af fluorescerende journalister over dage og kvantitativ analyse af biologiske rytmer. Selv om der er visse begrænsninger som beskrevet ovenfor, kan metoden tilpasses billede forskellige journalister i larve og voksen Drosophila hjerner og yderligere ændret for at øge følsomheden og rumlige opløsning. For eksempel cytoskeletale fremskrivninger ligger dybt i hjernen eller vesikulær transport må kunne påvises ved at kombinere vores hjerne eksplantat kultur teknik med to-foton mikroskopi35. At er sagde, det er stadig muligt at udføre live-imaging af organeller som mitokondrier i adult brain explants bruger denne protokol (data ikke vist). Vi præsenterede også variation af denne protokol for bad anvendelsen af eksperimentel løsning i farmakologiske assays. Man kunne udvide denne protokol for at udføre "pulse-chase" eksperimenter af manuelt erstatter næringssubstratet udviske stoffet eller ved hjælp af en perfusion afdeling18,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Michael Rosbash for hans mentorarbejde og støtte i den indledende fase af udviklingen af denne metode. Dette arbejde blev finansieret af JST PRESTO programmet, den schweiziske National Science Foundation (31003A_149893 og 31003A_169548), det Europæiske Forskningsråd (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for medicinsk-biomedicinsk forskning (13A39) og universitetet i Genève .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
