Summary
O objetivo do presente protocolo é estabelecer ex vivo da drosófila cultura larval cérebro otimizada para monitorar circadianos ritmos moleculares com imagem de lapso de tempo a longo prazo da fluorescência. A aplicação deste método de ensaios farmacológicos também é discutida.
Abstract
O circuito de marcapasso circadian orquestra rítmicas saídas comportamentais e fisiológicas coordenadas com dicas ambientais, tais como ciclos de dia/noite. O relógio molecular dentro de cada neurônio de marcapasso gera ritmos circadianos na expressão gênica, subjacentes as rítmicas neuronais funções essenciais para o funcionamento do circuito. Investigação das propriedades dos osciladores moleculares individuais em diferentes subclasses de neurônios de marcapasso e sua interação com a sinalização neuronal resulta em um melhor entendimento do circuito circadian pacemaker. Aqui, apresentamos uma abordagem de lapso de tempo microscopia fluorescente desenvolvida para monitorar a mecânica molecular nos neurônios do relógio do culto cérebro larval de Drosophila . Este método permite a gravação de multi-dia de ritmos de repórteres circadianos fluorescentes geneticamente codificados em resolução de célula única. Esta configuração pode ser combinada com manipulações farmacológicas para analisar atentamente uma resposta em tempo real do relógio molecular para vários compostos. Além dos ritmos circadianos, esse método multiuso em combinação com poderosas técnicas de genética de Drosophila oferece a possibilidade de estudar diversos processos neuronais ou moleculares no tecido cerebral ao vivo.
Introduction
Pulsos de disparo circadianos ajudam os organismos para se adaptar às mudanças ambientais periódicas geradas pela rotação da Terra 24 h. Os loops de feedback transcriptional-translacional entrecruzado comumente fundamentam a maquinaria molecular de relógios circadianos em espécie1. O circuito de marcapasso circadian composto de relógio contendo neurônios integra informações de tempo do dia, transmitidas pelas pistas ambientais, tais como ciclos de temperatura, para orquestrar os ritmos de uma infinidade de diários e claro/escuro (LD) fisiológica e processos comportamentais2,3. A coordenação de ritmos moleculares com neuronais entradas e saídas é criticamente importante para o funcionamento do circuito circadian mas permanece apenas parcialmente compreendido.
Em Drosophila, o cerne do relógio molecular, o heterodímero/ciclo de relógio (CLK/CYC) ativa a transcrição do período (por) e atemporal (tim). PER e TIM formam um complexo e entram no núcleo, onde eles inibem a atividade transcricional de CLK/CYC e, consequentemente, sua própria transcrição. Regulamentos pós-transcricional e borne-translational causam atrasos entre transcrição CLK/CYC-mediada e repressão por PER / TIM, garantindo a geração de cerca de 24-h oscilações moleculares1,3,4 . Cerca de 150 neurônios contendo estes pulsos de disparo molecular forma um circuito de controle circadiano comportamento de adulto voa5. Um muito mais simples, mas totalmente funciona circadian circuito constituído por 3 grupos de neurônios do relógio - 5 neurônios Lateral ventral (LNvs; 4 LNvs PDF-positivo e um negativo PDF LNv, veja abaixo), 2 Dorsal neurônio 1s (DN1s) e 2 Dorsal neurônio 2s (DN2s) - está presente em larval cérebro de6,7.
O simples circuito circadian larval oferece um excelente modelo para estudar as interações entre comunicação inter neuronal e o relógio molecular. Usando nosso repórter fluorescente recentemente desenvolvido por-TDT, que imita os níveis de por proteínas e sua localização subcellular, procurámos caracterizar a dinâmica da mecânica molecular em subgrupos de neurônio relógio diferente no circuito circadian larval 8. Além disso, sabendo que o papel fundamental do fator de dispersão de pigmento de neuropeptide (PDF) produzido pelo 4 LNvs na regulação dos ritmos circadianos no nível neuronal9,10,11, queríamos examinar diretamente o efeito do PDF sobre os relógios moleculares. Para este fim, nós desenvolvemos um método para monitorar a expressão do gene circadian ritmos no cérebro larval explant durante vários dias pela microscopia confocal lapso de tempo. O protocolo também foi adaptado para ensaios farmacológicos testar o efeito de PDF ou outros compostos no nível de PER-TDT. Assim, a adaptação consiste em tornar a cérebro explante cultura acessível a aplicação da droga, aumentando a resolução temporal e de imagem para uma duração mais curta.
Ex vivo cultura da drosófila cérebros dos diferentes estádios de desenvolvimento têm sido estabelecida anteriormente12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando que estes protocolos têm sido utilizados para imagens de vários fenômenos biológicos, alguns deles não são compatíveis com a imagem em resolução de célula única ou não apoiar a cultura por mais de algumas horas. Métodos alternativos para realizar a longo prazo de imagem ao vivo de neurônios circadianos em Drosophila incluem imagens de bioluminescência de ritmos molecular19,20,21 e imagem latente de fluorescência de indicador de cálcio com microscopia de luz folha22,23. Embora imagens de bioluminescência podem alcançar maior resolução temporal e microscopia de luz folha pode ser adaptável para a imagem latente na vivo , eles são limitados a resolução espacial e exigem sistemas especializados de microscópio.
O método descrito aqui é adaptado para visualizar sinais fluorescentes na cultura de todo o cérebro em célula única resolução ao longo de vários dias. Este método fácil e versátil pode ser adaptado aos cérebros de mosca adulta imagem cultivada e para experimentos farmacológicos estudar muitos problemas diferentes em neurobiologia da drosófila .
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Protocol
1. preparação das soluções estoque sob uma capa de cultura
- Preparar 400 mL de 1x Schneider ativo médio (SAM) otimizado para cultura ex vivo dos cérebros larvas (modificado da referência24,25) (tabela 1). Alíquota de 5 mL e flash congelamento em nitrogênio líquido (LN2), loja a - 80 ° C.
- Preparar 1 x Dissecting solução salina (DSS) por 10 diluição de solução-mãe (modificado da referência26) (tabela 2).
- Fibrinogênio alíquota para 10 mg e loja a 4 ° C, para uma única utilização.
Cuidado: Pesar fibrinogênio sob fluxo laminar, luvas, como é prejudicial. - Preparar a solução de trombina no SAM (1500 NIH unidade/mg) e a alíquota de 10 µ l, flash congelar em LN2 e manter a-80 ° C.
Cuidado: Use luvas quando manusear a trombina como é prejudicial. - Solução-mãe alíquota de 100 x penicilina-estreptomicina. Manter a-20 ° C.
- Cortar círculos da membrana de politetrafluoretileno (PTFE) (ver tabela de materiais) para o tamanho que se encaixa dentro de um prato fundo de vidro. Lavá-los em 70% EtOH e depois em autoclave dH2O. Esterilize e seco sob fluxo laminar com UV. Mantenha-se em uma placa de Petri estéril. Utilização única.
Nota: O PTFE é uma membrana porosa flexível que permite a troca de gases e impede a evaporação durante a gravação de longo prazo médio.
2. instalação de microscopia lapso de tempo
Nota: A seguinte configuração é para um microscópio confocal de varredor invertido em tandem (veja a tabela de materiais) equipada com um scanner de ressonância (8.000 Hz). O sistema inclui um detector de foto-multiplicador altamente sensíveis, que, juntamente com o scanner de ressonância, impede a fototoxicidade e fotobranqueamento. Temperatura e umidade são controladas dentro de uma câmara ambiental do microscópio (veja a Tabela de materiais) que cobre a maior parte do microscópio.
- Coloca uma câmara de umidade de palco-top.
- Liga os controladores de temperatura e umidade para equilibrar a câmara de microscópio para 25 ° C e 80% de umidade.
- Para realizar experimentos na escuridão constante (DD), cobrir a câmara ambiental do microscópio com uma pano opaco (a menos que a câmara de microscópio é feita de um material opaco).
- Se usando um objectivo de água-imersão, posicione um dispensador de Micro de imersão de água em cima do objetivo e programar um protocolo com o software de controlador do objectivo de Autoimmersion para o fornecimento de água a uma taxa constante durante a imagem latente de lapso de tempo.
Nota: Objectivos de imersão de água juntamente com um dispensador de água ou a seca lente objetiva são recomendados para tratamento de imagens ao vivo a longo prazo, como outro tipo de meio de imersão iria secar. - Coloque um suporte de placa de Petri no palco, dentro da câmara de umidade.
- Inicie o software do microscópio e seleccione o modo de ressonância varredor da primeira caixa de diálogo. Selecione Okey para inicializar o estágio quando solicitado. Vá para o guia de configuração e a configuração de Hardware para ligar as linhas de laser relevantes.
- Ir para adquirir guia e painel de XY para seleccionar o modo bidirecional e definir parâmetros de aquisição, imagem.
Nota: A descrito configuração de imagem aqui apresentada (Figura 2, Figura 3 e 1 filme) é otimizada para observar a expressão circadiana dos repórteres fluorescentes específicos. Os parâmetros a seguir foram escolhidos para caber melhor nossas especificações: 40 X água objetiva de imersão, média de linha X 8 com resolução de imagem 512 × 512. Para a imagem latente multicolor, aquisição de imagens sequenciais é necessária quando o comprimento de onda de emissão de um fluoróforo e o comprimento de onda de excitação de outra sobreposição (aqui, comprimentos de onda de emissão de proteína fluorescente amarela (YFP) e sobreposição de excitação de tomate). Escolha o modo sequencial "entre pilha" como é o mais rápido e o movimento dos neurônios do relógio é insignificante durante a aquisição de um Z-pilha. Configurações de microscopia devem ser adaptadas de acordo com o objectivo de cada experimento.
3. configuração do cérebro Larval explante cultura
Nota: Todo o processo de dissecação, a incorporação de explantes de cérebro leva ~ 30 min.
-
Preparação dos reagentes sob uma capa de cultura.
- Descongelar uma alíquota de trombina e manter à temperatura ambiente até a etapa de incorporação (passo 3.3). Utilização única.
- Descongelar rapidamente uma alíquota de SAM a 37 ° C e manter no gelo para uma única utilização.
- Adicionar o SAM a uma alíquota de 10 mg de fibrinogênio para 10 mg/mL, agite suavemente e incubar a 37 ° C durante pelo menos 30 min e durante a etapa de incorporação (passo 3.3). Utilização única.
Nota: Não incube a solução de fibrinogênio mais de 2h quando começa a se polimerizar. - Descongele uma alíquota de 100 ações x penicilina-estreptomicina. Prepare-se 2,5 mL de SAM contendo 1 x penicilina-estreptomicina (SAM/antibióticos). Manter à temperatura ambiente.
Nota: Estoque de loja os restantes 100 x penicilina-estreptomicina a 4 ° C até 1 mês. - Prepare-se uma alíquota de 500 µ l de SAM o restante. Manter-se no gelo.
- Para a imagem latente a longo prazo, aplicar graxa vácuo autoclavada a parte plástica da parte inferior do prato fundo vidro (figura 1A) e esterilizar sob fluxo laminar com UV.
-
Dissecação do sistema nervoso central e ventral cordão nervoso.
- Limpar a pinça e 2 x vidro bem três pratos de dissecação com 70% EtOH. Despeje 400 µ l de DSS em 4 poços e 400 µ l de SAM em um poço. Manter-se no gelo.
- Retire-lhes a voar meio contendo larvas e escolher não vagando 3º ínstar larvas (L3) com fórceps. Enxaguá-los sucessivamente em 2 poços DSS-cheia. Mantê-los no 3º poço cheio de DSS no gelo que anestesia as larvas.
Nota: L3 dura aproximadamente 2 dias a 25 ° C. Para observar o cérebro em período de tempo fisiologicamente relevante que escolhemos usar não-vagando as larvas L3. Outros subgrupos de neurônios de relógio, tais como l-LNvs e DN3s, começam a ser formado no vagando fase L3, mas eles ainda não estão necessariamente ciclismo (dados não mostrados). Portanto, embora seja possível a imagem ciclismo relógio neurônios nesta fase (dados não mostrados), é importante distinguir cuidadosamente os neurônios já funcional relógio larval de desenvolvimento para análise de dados. Non-vagando L3 aparecem cerca de 4 a 4,5 dias depois ovo deitado a 25 ° C. Para usar este protocolo para o estudo dos ritmos circadianos, sincronizar (arrastar) as larvas em desenvolvimento em h 12/12 h LD ciclos a 25 ° C durante 3 dias antes de coletar as larvas L3. - Disse cérebros larvas com pinça fina no poço cheio de DSS 4, que não tem sido usado para enxaguar as larvas, usando o método de dentro para fora,27.
- Brevemente, cortar a larva em dois, suavemente belisca os ganchos de boca com um par de pinças e arregaçar de dentro para fora da parede do corpo usando o outro par de pinças, assim, expondo o cérebro. Livre o cérebro cortando toda a traqueia e nervos que anexá-lo ao resto do corpo.
- Aspirar o cérebro em cerca de 3 µ l de DSS com uma pipeta de 20 µ l (pre-lavada com DSS) e dispense o poço cheio de SAM. Repita o procedimento para até 7 cérebros.
Nota: Dissecação deve ser realizada sobre uma superfície fria para manter as larvas anestesiadas e o cérebro refrigerados. Por exemplo, coloca o prato de dissecação em um bloco de refrigeração ligado a uma bomba para circular a água gelada de gelo. O procedimento de dissecação leva 30 ~ s por cérebro. É importante manter os olho/antenais discos imaginária anexados para o cérebro e o cordão nervoso ventral intacto. A arrancar essas partes irá danificar o cérebro e reduzir a qualidade da cultura. Além disso, Evite expor o cérebro para o ar. Antes de aspirar o primeiro cérebro, pipete subindo e descendo o DSS contendo partes das larvas dissecadas, como impede o cérebro de furar a parede da ponta.
-
Incorporação de explantes de cérebro em uma matriz 3D e montagem (~ 20 min).
- Mergulhe um cérebro dissecado em solução de trabalho de fibrinogênio (concentração final de fibrinogênio ~3.3 mg/mL, 10.5 µ l por cérebro) como segue:
- Aspire 3,5 µ l de SAM/antibióticos (com a mesma dica usada na seção 3.2.3). Aspire um cérebro dissecado com a dissecção bem para a ponta da pipeta mesmo sem dispensar o meio de SAM/antibióticos na ponta.
- Dispense o cérebro e o meio da tampa de uma placa de Petri estéril. Adicione outro µ l 3.5 de SAM/antibióticos e 3,5 µ l de fibrinogênio quente/SAM 10 mg/mL solução na gota que contém o cérebro. Misture a solução ao redor do cérebro suavemente pipetando com uma ponta de pipeta de 20 µ l.
Nota: Usar uma pipeta, ao invés de fórceps nesta etapa evita salientando o cérebro. - Pegue 2 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio no menu suspenso e aplicá-lo sobre a lamela de vidro prato fundo como um pequeno círculo. Adicionar 0,8 µ l de trombina e mistura-se muito rapidamente com a ponta da pipeta. O fibrinogênio é convertido em fibrina e começa a se polimerizar.
- Pegue o cérebro que senta-se em solução (passo 3.3.1) entre um par de pinças de trabalho o fibrinogênio e posicioná-lo na matriz, uma vez que um branco matriz de fibrina é visível. Oriente o lado anterior do cérebro para baixo (para imagem relógio neurônios). -Empurre para baixo tão próxima quanto possível para o tampa de vidro. Coágulo de fibrina é composto de camadas de fibrina. Escolha uma camada e dobre-o em cima do cérebro com movimentos pequenos e suaves sem desanexar a matriz.
- Repita 2 a 3 vezes de diferentes partes do coágulo para estabilizar o cérebro.
Nota: Quando estiver manipulando o cérebro com fórceps, tenha cuidado para não secar ou impô-la um estresse físico.
- Repita 2 a 3 vezes de diferentes partes do coágulo para estabilizar o cérebro.
- Adicione 20 µ l de SAM/antibióticos em cima do cérebro incorporado para parar a ação da trombina.
- Repita o procedimento para montar o restante do cérebro. É possível inserir até 5 a 6 cérebros em um prato fundo de vidro.
- Para geração de imagens ao vivo a longo prazo, adicione 600 µ l de SAM/antibióticos na fonte interna (a parte de vidro). Posicione uma membrana PTFE pré-cortada em cima do meio e furá-lo para a vácuo graxa aplicada na parte de plástico da parte inferior (3.1.5) (figura 1A).
- Para os ensaios farmacológicos, encha o prato com 2 mL de SAM/antibióticos (figura 1B).
Nota: É muito importante evitar a evaporação do meio, como a pressão osmótica do meio é fundamental para a viabilidade dos neurônios. Portanto, para experimentos de imagem a longo prazo, é necessário selar o prato de cultura com membrana PTFE. Considerando que para experimentos de curto prazo, membrana de vedação não é necessária enquanto o prato está cheio de 2 mL do meio e monitorado em uma câmara umidificada.
4. aquisição de imagem lapso de tempo
- Coloque o prato fundo de vidro no suporte do prato de Petri dentro da câmara de umidade de palco-top.
- Vá ao painel de z-pilha na aba de adquirir e definir as etapas de z-seção a partir do software de microscópio (2 µm × ~ 40 nos experimentos mostrado na Figura 2 e Figura 3e 1 filme). Defina o início de uma z-pilha no plano mais afastado da lamela e final na superfície do explante do cérebro, perto da lamela. Embora os movimentos do cérebro são negligenciáveis, adicionar z-seções extras no início e no final da pilha-z.
- Ir para marcar & encontrar a aquisição de imagens multi-posição do painel e set-up. Com um objetivo X 40, 1 hemisfério do cérebro pode ser capturado dentro de um campo de visão
- Vá ao painel de modo de aquisição e selecione xyzt (z-pilha de lapso de tempo). Vá ao painel de aquisição de tempo e definir os parâmetros de intervalo e frequência de tempo preferido.
Nota: Adquirir imagens de lapso de tempo com a frequência desejada. Observe que a longo prazo-imagem ao vivo (24-72 h), com intervalo de lapso de tempo inferior a 2 h tende a resultados em menos neurônios ciclismo, provavelmente porque reduz a viabilidade dos neurônios. O volume de dados se expande como a taxa de aumento de aquisição de imagem, que torna o armazenamento e análise de dados mais desafiador.
5. farmacológico tratamento de explantes de cérebro com curto prazo viver Imaging
Nota: O procedimento a seguir é essencialmente a mesma que para a imagem latente a longo prazo, mas não requer uma membrana PTFE. Para evitar expor o cérebro para luz azul quando o produto químico é adicionado para a cultura, o microscópio deve ser colocado no quarto escuro com luz vermelha.
- Vá ao painel de aquisição de tempo e definir o intervalo de tempo desejado e o número de verificação para obter os dados de linha de base antes da aplicação da droga. Inicie a digitalização.
- Depois da linha de base digitalização é concluída, levantar a cabeça de varredura do sistema de microscópio. Retire a tampa do controlador de umidade de palco-top e com muito cuidado, retire a tampa do prato fundo vidro sem movê-lo.
- Se necessário, remova a quantidade apropriada de meio de cultura. Adicionar a solução experimental no meio e, com cuidado e muito delicadamente, misture com uma pipeta Pasteur estéril sem tocar os explantes de cérebro.
Nota: Para aplicação de banho de PDF, use 2 µM PDF solução (em 10% DMSO). - Substitua as tampas do prato fundo de vidro e a câmara húmida e a cabeça de varredura. Se usando, reposicione o pano preto opaco ao redor da câmara de microscópio.
- Verifique se os cérebros estão em suas posições originais no modo de varredura ao vivo. Ajuste se necessário.
- Vá ao painel de aquisição de tempo e definir o intervalo de tempo desejado e o número de verificação. Inicie a digitalização.
Nota: Aqui nós testamos o lapso de tempo imagens adquiridas a cada hora por até 10 h.
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Representative Results
Aqui, nós mostramos os resultados representativos da gravação a longo prazo de uma repórter fluorescente circadian ex vivo cultura larval do cérebro e os resultados ao vivo de imagem do aplicativo de banho PDF na expressão de repórter.
Non-vagando as larvas L3 expressando o relógio molecular repórter PER-TDT e conduzido por um motorista de neurônio relógio Clk 856-gal4 (Figura 1) foram arrastado em ld. Brains UAS-mCD8::YFP foram dissecadas e configurar para cultura a longo prazo, durante o último Acenda a fase do ciclo de LD só prévio a fase escura (figura 1A e 2B). Imagem de lapso de tempo foi realizada em DD e cérebro explantes foram fotografadas a cada 2h para 64 h. Uma soma-pilha contendo o neurônio de interesse foi criada e a intensidade de fluorescência média da área correspondente ao neurônio foi medida após a subtração de fundo8. Para determinar a ritmicidade da expressão repórter, tanto a análise espectral de entropia máxima (MESA) e a inspeção manual foram usados8. Dois DN2s que exibem ritmo circadiano com um período de ~ 26 h em níveis de PER-TDT são aqui apresentados (Fig. 2A, 2C e 1 filme).
Usando essencialmente a mesma configuração de cultura (figura 1B), estudou-se o efeito do neuropeptídeo PDF a expressão PER-TDT. O cérebro de larvas não vagando com o mesmo genótipo, como descrito acima foram dissecado em ZT1 (Zeitgeiber tempo 1, 1h Após luzes acesas em LD) ou ZT13 (1 h depois de luzes apagadas). Os frascos contendo larvas foram imediatamente refrigerados no gelo depois de retirado da incubadora. No ZT13, os frascos foram também envolto em papel alumínio, para evitar a exposição de luz azul. A dissecação cerebral foi realizada no gelo e cérebros dissecados foram mantidos no gelo. O cérebro tirado no ZT13 estava coberto com folha de alumínio, sempre que possível. Assim, embora este procedimento foi realizado no laboratório iluminado com luz natural, o efeito da exposição à luz na síntese macromolecular e metabolismo foi mínimo. Os cérebros foram escaneados duas vezes com intervalo de 1h para obter os dados de linha de base. PDF ou veículo (DMSO) foi adicionado ao meio de cultura e Time-Lapse imagens foram adquiridas a cada 1 h para h. 6 subsequente PER-TDT perfil de expressão mostrou um aumento de tempo-do-dia-dependente da intensidade de fluorescência após adição de PDF no ZT13 na LNvs e DN1s e para um menor medida sobre o DN2s (Figura 3)8.
Estes resultados indicam que a técnica de imagem e o método de cultura descrito aqui habilitada a gravação dos ritmos de PER-TDT em célula única resolução sem perceptível deriva de fototoxicidade, fotobranqueamento ou foco.
Nota: Imagens foram analisadas e processadas usando Fiji28. Deconvolução iterativa de 10 X foi realizada com AutoQuant e Imaris. Desvios menores nas imagens de lapso de tempo foram corrigidos com plugin correto 3D deriva do ImageJ.
Figura 1: Anatomia de neurônios relógio cérebro larvas L3 e a configuração de cultura cérebro explante. (A e B) Esquemas de configuração de cultura do cérebro para a imagem latente de longo prazo (A) e para os ensaios farmacológicos com curto prazo de imagem (B). (A), vácuo graxa (amarela) foi aplicada na parte de plástico do prato fundo vidro para anexar a membrana PTFE. (C) uma imagem representativa de um cérebro de larvas L3 LD-arrastado na ZT2. A expressão do repórter relógio molecular PER-TDT (magenta) é visível nos neurônios do relógio, que são rotulados por UAS-mCD8::YFP(green) conduzido por Clk 856-gal4. Existem 3 grupos de neurônios de relógio diferenciado em L3: 5 LNvs (incluindo o 5º LNv, que não expressam o PDF), 2 DN1s e 2 DN2s, indicado por setas brancas. Observe a expressão de PER-TDT nos núcleos de neurônios do relógio. YFP-negativo PER-TDT-positivo células é glia e outro subgrupo de neurônios de relógio que ainda estão em desenvolvimento. Barra de escala = 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados representativos de longo prazo ao vivo imagens dos neurônios relógio larval. (A) ampliada vista de DN2s a imagem de lapso de tempo a longo prazo de um cérebro culta. Cérebro explantes foram preparados a partir das larvas L3 LD-arrastado dissecadas em ZT11. Imagens foram tiradas a cada 2h de CT17 (Circadian tempo 17, 5h após subjetivas luzes apagadas em DD) para 64 h em DD. mesclada imagens de PER-TDT (magenta) e UAS-mCD8::YFP guiado por Clk 856-gal4 (verde) estão à esquerda de cada painel e níveis de PER-TDT representado como heatmap com gradiente azul estão à direita. Barra de escala = 10 µm. Para representação apenas, imagens foram processadas com deriva de correção 3D e uma deconvolução iterativa de X 10. (B) na hora do experimento. (C) gráfico que representa a intensidade de fluorescência relativo normalizado em t = 0 de dois DN2s (azul e vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: resultados representativos de imagens ao vivo para experimentos farmacológicos. LD-arrastado larvas cérebros foram dissecados e montados em PDF ou ZT13 e ZT1 (2 µM) ou DMSO foi aplicado no ZT2 ou ZT14. Expressão PER-TDT no cérebro explantes foi monitorada a cada hora por microscopia de lapso de tempo. Fluorescência de média intensidade ± SEM normalizada para o valor no início da imagem latente (correspondente a ZT1 ou ZT13) é mostrado. Setas vermelhas indicam o tempo de aplicação PDF ou veículo (ZT2 ou ZT14). * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 e * * * p < 0,0001 por ANOVA de duas vias com a correção do Sidak para comparações múltiplas. Um mínimo de 32 LNvs, 18 DN1s e 16 DN2s foram analisados para cada ponto de dados. Esta figura foi modificada de referência8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: imagens ao vivo a longo prazo dos neurônios de relógio DN2 larvas. Filme lapso de tempo do cérebro larval cultivo dissecado em ZT11 e fotografada em Magnified DD. vista para o DN2s em um único hemisfério expressando PER-TDT e UAS-mCD8::YFP guiado por Clk 856-gal4 é mostradas. Imagens foram adquiridas a cada 2h para 64 h. PER-TDT (magenta) e YFP (verde) estão no lado esquerdo e níveis de PER-TDT, representados como um heatmap (gradiente azul) estão à direita. Barra de escala = 10 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
| Passos | Reagentes | Concentração |
| 1. misturar os reagentes. | KH2PO4 | 4,18 mM |
| CaCl2 | 1,05 mM | |
| MgSO4.7h2, O | 0,7 mM | |
| NaCl | 116 mM | |
| NaHCO3 | 0,7 mg/ml | |
| Glicose | 2 mg/ml | |
| Trealose | 2 mg/ml | |
| Ácido alfa-cetoglutárico | 0,35 mg/ml | |
| Ácido fumárico | 60 μg/ml | |
| Ácido málico | 0,6 mg/ml | |
| Ácido succínico | 60 μg/ml | |
| Extrato de levedura | 2 mg/ml | |
| Inactivados calor FCS | 20% | |
| dH2O, autoclavado | ||
| 2. esterilizar com filtro de 0,22 μm. | ||
| 3. Incubar em uma incubadora para cultura de células, a 25 ° C, no escuro para 72 h. incubadora tem que ser desprovido de contaminação bacteriana ou fúngica. | ||
| 4. Adicione os reagentes. | Insulina | 2 μg/ml |
| Bis-Tris pH 6,8, esterilizar com filtro de 0,22 μm | 5 mM | |
| 5. Ajuste o pH para 6,8-6.9. | NaOH (10 N) | ~ 8 gotas |
| 6. esterilizar com filtro de 0,22 μm. | ||
| 7. a alíquota de 5 ml, Flash congelar em LN2 loja a-80 ° C. Use whithin 60 dias. | ||
| Nota: Para grandes volumes, esterilizar com garrafa superior do filtro por vácuo, caso contrário, use um filtro de seringa. Alíquotas abertas numa vizinhança de cultura. Utilização única. | ||
Tabela 1: preparação do meio de SAM (1x) para cultura de cérebro de drosófila . Médio e explante de cérebro de cultura. Todas as etapas devem ser executadas em uma capa de cultura, exceto para a incubação do meio.
| Passos | Reagentes | Concentração |
| 1. misturar os reagentes. | HEPES-KOH, pH 7,4 | 99 mM |
| NaCl | 1,37 M | |
| KCl | 54 mM | |
| NaH2PO4 | 1,7 mM | |
| KH2PO4 | 2.2 mM | |
| Glicose | 33 mM | |
| Sacarose | 438 mM | |
| autoclavado dH2O | ||
| 2. esterilizar com filtro de 0,45 μm. | ||
| 3. armazenar a 4 ° C até 6 meses. | ||
| Nota: Para uso experimental: diluir a 1 X com autoclavado dH2O e esterilizar com 0,45 μm top frasco de filtro por vácuo ou com seringa de filtro. Manter a 4° C. Aberto em uma capa de cultura, uso múltiplo. | ||
Tabela 2: preparação do DSS (10x). Solução salina para dissecar cérebros de Drosophila . Prepare em uma capa de cultura.
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Discussion
Aqui, descrevemos o método para longo prazo lapso de tempo a microscopia de fluorescência dos cérebros larvas culturas. O sucesso deste tipo de experiências depende de vários fatores, tais como a saúde da cultura, método para a imobilização do explante cérebro, intensidade de fluorescência e relação sinal-ruído do repórter, temporal e resolução espacial, e acessibilidade para o explante. Estes fatores podem ser mutuamente exclusivos. Por exemplo, aumento da frequência de lapso de tempo afeta a saúde da cultura, e a imobilização do explante do cérebro pode impedir a troca gasosa. Assim, encontrar um meio termo (sem trocadilhos) para o fenômeno em estudo é a chave para um protocolo bem sucedido. O método descrito aqui é otimizado para monitorar a expressão de repórteres circadianos fluorescentes na escala de horas, dias. Também é aplicável para estudar outros assuntos em neurobiologia da drosófila , enquanto os processos críticos são inalterados e executados com cuidado.
Neste protocolo, cérebro explantes são imobilizadas em um coágulo de fibrina, que cria uma matriz 3D. Embora existam outros métodos de imobilização, tais como a poli-lisina ou laminina revestimento do vidro tampa, estes abrandar o desenvolvimento da larva cérebros29 e, portanto, pode comprometer a sua robustez fisiológica. Pela sua natureza, a fibrina fornece uma excelente matriz que é solto o suficiente para permitir que os nutrientes alcançar o explante de cérebro e pegajoso o suficiente para o cérebro ser perto do copo tampa sem pisar na-16. Devido a estas vantagens, método de coágulo de fibrina tem sido empregado em vários protocolos para cultura de células e cérebro explant cultura14,17,29,30,31,32 ,33,34. Recomendamos usar uma matriz 3D de fibrina para cultura larval cérebro mesmo para experiências relativamente a curto prazo, que duram mais de algumas horas. Cultura larval cérebro sem matriz 3D dá resultados erráticos (dados não mostrados), provavelmente devido à falta de suporte físico necessário para o desenvolvimento de cérebros.
É importante observar cuidadosamente a morfologia do explante e as células no tecido antes e durante o lapso de tempo de imagem para detectar qualquer sinal de socorro. Nos experimentos aqui apresentados, expressão de mCD8::YFP a membrana-limite mostrou intacta morfologia dos neurônios e PER-TDT foi detectado no citoplasma e núcleo, conforme o esperado, indicando que o explante de cérebro permaneceu viável e saudável ao longo a duração da imagem latente. Ritmicidade circadiana foi estudada por até 72 h, mas observamos que explantes de cérebro podem ser cultivadas por até 5 dias sem se deteriorar a integridade dos neurônios do cérebro (dados não mostrados). Se os neuritos se tornar dotty ou o corpo celular dos neurônios estourar, estes são geralmente sinais de fototoxicidade e facilmente prevenida, adaptando as configurações do microscópio em conformidade. Por exemplo, tente reduzir a potência do laser ao aumentar o tamanho do pinhole, ganho inteligente e a janela da deteção. No entanto, geralmente, a intensidade da fluorescência do repórter é o fator limitante para a obtenção de imagens de boa relação sinal-ruído sem iluminação do laser de alta intensidade. Portanto, o design do repórter, escolha o fluoróforo, e o número de cópia do repórter são as primeiras coisas a considerar quando solução de problemas de viabilidade. (No experimento apresentado aqui, 4 cópias do repórter por tdt foram usadas.)
Outros sinais de uma cultura de comprometimento cerebral incluem a explosão de um hemisfério durante a imagem latente de lapso de tempo e movimento do fluido fora o explante de cérebro. Isto é provavelmente devido a microfuros causados durante a dissecção do cérebro. Remover os discos imaginária anexados ao cérebro larval é a principal fonte de punções, assim Aconselhamos contra ele.
A vantagem das imagens ao vivo circadiano de fluorescência sobre imagens de bioluminescência é sua alta resolução espacial. Além disso, a facilidade do uso de marcadores celulares, juntamente com o repórter ritmo facilita a análise da especificidade do tipo de célula. Em contraste, a bioluminescência tem resolução temporal superior e excelente relação sinal-ruído19,20,21. No entanto, total número de neurônios ciclismo por cérebro fotografada por bioluminescência não é superior em comparação com o número obtido com nosso método8,19,21. Na maioria dos casos, os ritmos dos repórteres fluorescentes detectados com nosso método são sincronizados dentro do mesmo agrupamento de neurônios de relógio (ver Figura 2), como mostrado com bioluminescência19. Foram observadas diferenças de fase entre clusters de neurônio de relógio em fluorescência e bioluminescência circadian imagem8,19,21. Portanto, tanto as metodologias são igualmente válidas em observar ritmos circadianos em cérebros culturas, e a escolha entre o florescimento e bioluminescência deve ser feita de acordo com o objectivo do estudo.
A principal dificuldade técnica desse método está na etapa de incorporação. Porque o protocolo chama-se para a imagem latente confocal de varredura rápida com um microscópio invertido e espalhamento de luz no tecido cerebral reduz a deteção de fluorescência, especialmente quando a imagem de fundo no tecido, explantes de cérebro devem ser montados tão próximo quanto possível para o tampa de vidro. Além disso, a reprodutibilidade dos resultados de imagem varia de acordo com a consistência das posições-z de neurônios de interesses. Portanto, é importante orientar e montar o cérebro sempre da mesma forma, o que requer prática. A imagem neuronal de clusters localizados em posições anatomicamente distintas, pode ser necessário executar experimentos separados com orientação de explant cerebrais diferentes. Existem métodos alternativos para imagem ao vivo do profundo-tecido que não necessitam de cultivo do tecido, tais como por dois fotões microscopia e microscopia de luz folha. O último sucesso serviu para dinâmica de cálcio circadian imagem em Drosophila ao cérebro22,23. No entanto, microscopia de luz folha tem resolução espacial menor do que a microscopia confocal e assim sua aplicação para a imagem latente em célula única resolução continua a ser um desafio.
Em resumo, este protocolo combina um sistema de cultura simples do cérebro larval explantes sob condições que oferecem suporte a aquisição de imagens de lapso de tempo de repórteres fluorescentes durante dias e análise quantitativa de ritmos biológicos. Embora existam certas limitações, como discutido acima, a metodologia pode ser adaptada para diferentes repórteres de imagem nos cérebros de Drosophila larvas e adultos e posteriormente modificada para aumentar a sensibilidade e resolução espacial. Por exemplo, projeções axonal localizada profundamente no cérebro ou transporte vesicular pode ser detectável, combinando a nossa técnica de cultura de explante de cérebro com microscopia de dois fotões35. Que sendo dito, ainda é possível realizar imagens ao vivo de organelas como mitocôndrias no cérebro adulto explants usando este protocolo (dados não mostrados). Também apresentamos a variação do presente protocolo para aplicação de banho de solução experimental em ensaios farmacológicos. Um poderia estender este protocolo para realizar experimentos de "pulso-perseguição" manualmente, substituindo o meio de cultura para lavar a droga ou usando uma câmara de perfusão18,36.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Michael Rosbash por sua orientação e apoio durante a fase inicial do desenvolvimento deste método. Este trabalho foi financiado pelo programa JST PRESTO, o Swiss National Science Foundation (31003A_149893 e 31003A_169548), o Conselho Europeu de investigação (ERC-StG-311194), Fundação Novartis para pesquisa médica-biomédica (13A39) e da Universidade de Genebra .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
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