Single-cell Resolution fluorescens lever avbildning av Drosophila dygnsrytm klockor i Larval hjärnan kultur
Summary
Målet med detta protokoll är att etablera ex vivo Drosophila larval hjärnan kultur optimerad för att övervaka dygnsrytm molekylär rytmer med långsiktiga fluorescens time-lapse imaging. Tillämpningen av denna metod på farmakologiska analyser diskuteras också.
Abstract
Dygnsrytm pacemaker kretsen orkestrerar rytmiska beteendemässiga och fysiologiska utgångar samordnas med miljömässiga ledtrådar, såsom dag/natt cykler. Den molekylära klockan inom varje pacemaker neuron genererar dygnsrytmen i genuttryck, som ligger bakom de rytmiska neuronala funktionerna som är avgörande för driften av kretsen. Utredning av enskilda molekylär oscillatorerna i olika underklasser av pacemaker nervceller och deras interaktion med nervcellernas signalering egenskaper ger en bättre förståelse av dygnsrytm pacemaker kretsen. Här presenterar vi en time-lapse fluorescerande mikroskopi metod utvecklad för att övervaka det molekylära urverket i klocka nervceller av odlade Drosophila larval hjärna. Denna metod tillåter flera dagars inspelning av rytmer av genetiskt kodade fluorescerande dygnsrytm reportrar på encelliga upplösning. Denna inställning kan kombineras med farmakologiska manipulationer för att noga analysera realtid svar av molekylära klockan till olika föreningar. Bortom dygnsrytm erbjuder denna mångsidiga metod i kombination med kraftfulla Drosophila genetiska tekniker möjligheten att studera olika neuronala eller molekylära processer i levande hjärnvävnad.
Introduction
Dygnsrytm klockor hjälpa organismer att anpassa sig till de periodiska miljöförändringar som genereras av 24 h rotation av jorden. De förreglade transkriptionell-translationell feedbackloopar ligger ofta bakom den molekylära maskinen av dygnsrytm klockor över arter1. Dygnsrytm pacemaker kretsen består av klocka-innehållande nervceller integrerar tid-för-dag information förmedlas av miljömässiga ledtrådar, såsom ljus och mörker (LD) och temperatur cykler, att orkestrera rytmer i en uppsjö av dagliga fysiologiska och beteendemässiga processer2,3. Samordning av molekylär rytmer med neuronala ingångar och utgångar är kritiskt viktigt för driften av den dygnsrytm krets men återstår endast delvis förstås.
I Drosophila, kärnan i den molekylära klockan, den KLOCKCYKEL (CLK/CYC) heterodimer aktiverar transkriptionen av period (per) och tidlös (tim). PER och TIM bildar ett komplex och ange kärnan, där de hämmar transkriptionell aktivitet CLK/CYC och därmed sin egen transkription. Post-transcriptional och post-translationella förordningar orsaka förseningar mellan CLK/CYC-medierad transkription och förtryck av PER / TIM, att säkerställa generationen av circa 24-h molekylära svängningarna1,3,4 . Ca 150 nervceller som innehåller dessa molekylära klockor bildar flyger en krets till control dygnsrytm beteende vuxen5. En mycket enklare men fullt funktionella dygnsrytm krets som består av 3 grupper av klocka nervceller – 5 ventrala laterala nervceller (LNvs; 4 PDF-positiva LNvs och en PDF-negativ LNv, se nedan), 2 dorsala Neuron 1s (DN1s) och 2 dorsala Neuron 2s (DN2s) – finns i de larver hjärnan6,7.
Den enkla larval dygnsrytm kretsen erbjuder en utmärkt modell för att studera interaktioner mellan Inter neuronal kommunikation och den molekylära clockwork. Med vårt nyutvecklade fluorescerande reporter PER-TDT, som härmar nivåerna PER protein och dess subcellulär lokalisering, försökte vi karaktärisera dynamiken i det molekylära urverket i olika klocka neuron undergrupper i larval dygnsrytm kretsen 8. dessutom veta den nyckelroll som den neuropeptid pigment-spridning faktorn (PDF) producerad av 4 LNvs reglera dygnsrytmen på neuronal nivå9,10,11, vi ville undersöka direkt effekt av PDF på molekylära klockor. För detta ändamål har vi utvecklat en metod för att övervaka dygnsrytm genuttryck rytmer i larval hjärnan explant över flera dagar av time-lapse konfokalmikroskopi. Protokollet var också anpassad för farmakologiska analyser att testa effekten av PDF- eller andra föreningar på nivån på PER-TDT. Anpassningen består således, av att göra hjärnan explant kulturen tillgänglig för läkemedel ansökan, ökad temporal upplösning och imaging för en kortare period.
Ex vivo kulturen i Drosophila hjärnor olika utvecklingsstadier har varit tidigare etablerade12,13,14,15,16,17 ,18. Medan dessa protokoll har använts för imaging olika biologiska fenomen, vissa av dem är inte kompatibla med imaging encelliga upplösning eller stöder inte kulturen i flera timmar. Alternativa metoder att utföra långsiktiga levande avbildning av dygnsrytm nervceller i Drosophila inkluderar Mareld avbildning av molekylär rytmer19,20,21 och fluorescens avbildning av kalcium-indikator med lätta blad mikroskopi22,23. Även om Mareld imaging kan uppnå högre temporal upplösning och lätta blad mikroskopi kan vara anpassningsbar för i vivo imaging, de är begränsade på den rumsliga upplösningen och kräver specialiserade Mikroskop system.
Den metod som beskrivs här är skräddarsydd för att visualisera fluorescerande signaler i hela hjärnan kultur med encelliga upplösning över flera dagar. Denna lättköpt och mångsidig metod kunde anpassas till bild odlade vuxen fluga hjärnor och för farmakologiska experiment för att studera många olika problem i Drosophila neurobiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs vi metoden för långsiktiga time-lapse fluorescensmikroskopi av odlade larval hjärnor. Framgången för denna typ av experiment beror på flera faktorer, såsom kultur, hälsa metod för immobilisering av hjärnan explant, fluorescensintensiteten och signal-brus-förhållande av reporter, tidsmässiga och rumsliga upplösningen, och tillgängligheten till explant. Dessa faktorer kan vara ömsesidigt uteslutande. Exempelvis öka time-lapse frekvens påverkar hälsan hos kulturen och immobilisering av den h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Michael Rosbash för sitt mentorskap och stöd under den inledande fasen av utvecklingen av denna metod. Detta arbete finansierades av JST PRESTO programmet, schweiziska National Science Foundation (31003A_149893 och 31003A_169548), European Research Council (ERC-StG-311194), Novartis stiftelse för medicinsk-biomedicinsk forskning (13A39) och universitetet i Genève .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?. Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 – Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila’s circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O’Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
