Mus fettvävnad insamling och bearbetning för RNA analys
Summary
Syftet med denna uppsats är att presentera en steg för steg-procedur för att samla olika vit fettvävnad från möss, behandla fett proverna och extrahera RNA.
Abstract
Jämfört med andra vävnader, har vit fettvävnad ett betydligt mindre RNA och protein innehåll för nedströms tillämpningar såsom realtids PCR och Western Blot, eftersom det mestadels innehåller lipider. RNA isolering från fettvävnad prover också utmanande som extra steg krävs att undvika dessa lipider. Här presenterar vi ett förfarande för att samla in tre anatomiskt olika vit fettvävnad från möss, att bearbeta dessa prover och utföra RNA isolering. Vidare beskriver vi syntesen av cDNA och gen uttryck experiment med realtids-PCR. Härmed beskrivna protokollet tillåter en minskning av föroreningar från djurets hår och blod på fett kuddar samt korskontaminering mellan olika fett kuddar under vävnad samling. Det har också optimerats för att säkerställa tillräcklig kvantitet och kvalitet av RNA extraherade. Detta protokoll kan i stor utsträckning till någon musmodell där fettvävnad prover krävs för rutinmässig experiment såsom realtids-PCR men är inte avsedd för isolering från primära adipocyter cellodling.
Introduction
Fetma är en världsomfattande epidemi som kan leda till komplikationer såsom typ 2-diabetes1. Kost-inducerad feta och genetiskt modifierade djurmodeller används ofta för forskning i fetma och dess komplikationer. Traditionellt, vit fettvävnad är känd som ett förvaringsfack för överskottsenergi och mestadels består av lipider medan Brun fettvävnad omvandlar energi till värme2,3. Fettvävnad kommer att är dynamisk och expandera och krympa beroende på många faktorer såsom matintag och fysisk aktivitet. Därför, för att fastställa faktorer som bidrar till dessa förändringar, adekvat fettvävnad insamling och hantering är krävs4.
Bland vita fettvävnad, är det allmänt accepterat att underhudsfett och visceralt fett depåer har olika egenskaper såsom anatomiska lokalisering och funktion2,5. Följaktligen, för att undvika motstridiga resultat eller stor variabilitet, uppmärksamhet behöver vidtas för att undvika korskontaminering mellan dessa olika fett depåer när du samlar fett kuddar.
Dessutom finns det tre stora utmaningar när isolera RNA- eller protein från möss vit fettväv. Först är samlar fett kuddar i feta möss inte en lätt uppgift som gränsen som skiljer olika vit fett depåer inte är alltid tydlig, i motsats till andra organ såsom njurar och hjärta6. Andra, på grund av den höga fetthalten av fettvävnad, under RNA- eller protein isolering, ett lager av lipider flyter ovanpå och förhindrar direkt tillgång till provet. Tredje, i motsats till Brun fettvävnad eller andra vävnader, vit fettvävnad har betydligt lägre RNA och protein innehåll och detta är av stor vikt när du använder unga möss, möss matas en normal (N) kost och möss som förväntas ha låg fett massorna (dvs. KO modeller, behandling med läkemedel, utöva utbildning, etc.) 7 , 8.
Därför är att välja lämplig metod att isolera RNA från fettvävnaden kritiska. Alternativa metoder till fenol/kloroform utvinning är kommersiella kit. De baseras vanligen på en inledande fenol utvinning steg, följt av RNA rening på en kolumn9. Dessa kit är normalt dyrare och ge prover av lägre avkastning, medan RNA kvaliteten kan vara variabel men är mindre tidskrävande. En av de största fördelarna till fenol lösning/kloroform utvinning beskrivs här är dock möjligheten att isolera RNA, DNA och protein från en enda prov10. Eftersom möss fett kuddar är oftast små och ge liten mängd RNA och proteiner (särskilt i lean musmodeller), maximera dessa protokoll data man kan få ut ur ett litet smakprov.
Syftet med denna uppsats är att beskriva i detalj en metod för att säkerställa adekvat provtagning från tre möss vit fettvävnad depåer samt kvantitet och kvalitet av RNA isolering. RNA som erhållits genom att följa detta protokoll kan användas för att utföra realtids PCR-analyser. Detta protokoll är inte avsedd för RNA isolering från odlade primära adipocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Följande HF-kost utfodring, visade feta möss för att ökad kropp och vit fettvävnad vikter jämfört med möss ges en N kost. RNA extraherade med fenol lösning gav prover med bra renhet. Leptin är ett adipokine som främst produceras av fettvävnad och är känd att korrelera positivt med fett massa16. Som väntat ökade leptin mRNA uttryck i feta möss i concomitance med sin fettmassa.
Denna metod har flera kritiska steg. Den stora är förorening av en vit fettv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Diabetes Kanada.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
