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Developmental Biology

Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi In Vitro

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/57044

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di time-lapse e analisi di vasculogenesi in vitro usando accoppiata con il software open source, analisi cinetica di vasculogenesi di microscopia di contrasto di fase. Questo protocollo può essere applicato per valutare quantitativamente il potenziale vasculogenic di numerosi tipi cellulari o condizioni sperimentali che modellano la malattia vascolare.

Abstract

Vasculogenesi sono un processo complesso che cellule staminali e progenitrici endoteliali sottoporsi a formazione del vaso de novo . Valutazione quantitativa di vasculogenesi è diventata una lettura centrale di funzionalità delle cellule progenitrici endoteliali, e di conseguenza, parecchi tentativi sono stati fatti per migliorare sia in vitro che in vivo modelli di vasculogenesi. Tuttavia, i metodi standard sono limitati nell'ambito, con misurazioni statiche non riuscendo a catturare molti aspetti di questo processo altamente dinamico. Pertanto, l'obiettivo di sviluppare questo protocollo romanzo era di valutare la cinetica di vasculogenesi in vitro al fine di quantificare i tassi di formazione della rete e di stabilizzazione, nonché a fornire la comprensione nei meccanismi potenziali vascolare disfunzione. Applicazione del presente protocollo è dimostrata utilizzando cellule (ECFCs) esposte a mellito di diabete materno di formazione di colonie endoteliali fetali. ECFCs fetale sono stati derivati da sangue di cordone ombelicale dopo la nascita, coltivate e placcato in diapositive contenenti matrici della membrana dello scantinato, dove hanno subito la vasculogenesi. Immagini dei pozzi intera diapositiva sono stati acquisiti mediante microscopia di contrasto di fase time-lapse oltre 15 ore. Immagini sono stati analizzati per la derivazione dei dati quantitativi utilizzando un software di analisi chiamato analisi cinetica di vasculogenesi (KAV). KAV utilizza la segmentazione di immagini seguita da scheletrizzazione per analizzare i componenti di rete da pile di immagini di contrasto di fase punto multi-time derivare i dieci parametri (9 misurato 1 calcolato) della struttura di rete, tra cui: reti, rete aree, chiuse nodi, rami, lunghezza totale ramo, lunghezza del ramo medio, triple-ramificati nodi, nodi quad-ramificati, strutture di rete e il ramo al rapporto di nodo. Applicazione del presente protocollo identificato alterato tassi di vasculogenesi in ECFCs ottenuti da gravidanze complicate da diabete mellito. Tuttavia, questa tecnica ha vaste implicazioni oltre l'ambito segnalato qui. Implementazione di questo approccio meccanicistico valutazione di aumenterà e migliorerà funzionale letture di vasculogenesi e altri processi di ramificazione biologicamente importante in numerosi tipi cellulari o Stati di malattia.

Introduction

La capacità delle cellule progenitrici endoteliali di subire vasculogenesi, o de novo formazione del vaso, è fondamentale nella creazione di sistema vascolare embrionale durante sviluppo1. Inoltre, ulteriore formazione del vaso e la maturazione dei vasi pre-esistenti, che è conosciuto come l'angiogenesi, è anche un processo chiave nello sviluppo e nella vita postnatale per mantenere il flusso sanguigno e l'omeostasi in tutto il corpo2. Ogni organo del corpo dipende dal sistema vascolare per la consegna di ossigeno e nutrienti e per la rimozione dei rifiuti3. Se non viene mantenuta l'omeostasi vascolare, tale che la riparazione e la formazione del vaso sanguigno sono insufficienti o in eccesso, le malattie vascolari possono provocare4. Di conseguenza, adattamento e formazione vascolare sono comunemente studiati, come essi sono essenziali per il mantenimento della salute dell'organo e sono implicati nello sviluppo di numerosi stati patologici.

A causa di una maggiore comprensione del coinvolgimento del sistema vascolare in sviluppo, come pure nella progressione e nella manifestazione di malattia, le analisi sono state sviluppate per modello vasculogenesi e dell'angiogenesi in vitro e in vivo5 ,6,7. Formazione del vaso di modellazione coinvolge cellule vascolari, quali le cellule endoteliali, nella matrice della membrana basale che promuove l'organizzazione delle cellule e formazione di reti di nave8,9,10di placcatura. In genere, segue una notte di incubazione, immagini della cella reti vengono acquisiti presso un unico punto di tempo, risultante in un piccolo numero di immagini per analisi11,12,13. Di conseguenza, approcci analitici sono stati in gran parte sviluppati e ottimizzati per singola volta punto valutazioni10,14. Tuttavia, analisi statiche sono semplicemente insufficienti a catturare il processo dinamico di formazione del vaso e forniscono approfondimenti limitato di potenziali meccanismi coinvolti. Anche se l'aumento di frequenza imaging sarebbe probabilmente fornire i dati necessari per identificare la cinetica di formazione, applicazione di analitica precedentemente sviluppata ad un punto multi-time imaging approccio sarebbe inefficiente e labor intensive14. Inoltre, nonostante lo sviluppo di analisi commercialmente disponibili, a pagamento pay-per-immagine rende questa opzione costo proibitivo per studi cinetici in cui migliaia di immagini è generate15. Di conseguenza, c'è un'esigenza di un approccio agile ed efficiente catturare e quantificare vasculogenesi in vitro, compresa la possibilità di analizzare set di grande immagine generati da microscopia time-lapse cellule vive nel campo.

Per superare queste limitazioni, un nuovo approccio è stato sviluppato con lo scopo di unico punto di tempo formazione immagine per consentire la valutazione dinamica della vasculogenesi con immagini acquisite ogni 15 min16in espansione. Mediante l'acquisizione di più punti di tempo sopra parecchie ore, questo approccio fornisce una rappresentazione più dettagliata del processo di vasculogenesi, come pure la comprensione nei meccanismi possibili che contribuiscono alla formazione e manutenzione di reti di nave. Oltre a migliorare la frequenza e la qualità di acquisizione delle immagini, questo approccio incorpora nuovi software sotto forma di un plug-in open source17. Il software, definite come Kinetic Analysis di vasculogenesi (KAV), è un'applicazione semplificata che incorpora immagine elaborazione ed analisi in particolare per i set di grande immagine generati dal punto multi-time acquisizioni. KAV analizza le immagini di contrasto di fase attraverso la segmentazione di immagine seguita da scheletrizzazione18. Dieci parametri della struttura di rete sono quantificati da KAV tra cui: rami, reti chiuse, nodi, aree di rete, strutture di rete, triple-ramificati nodi, nodi quad-ramificati, lunghezza totale ramo, lunghezza del ramo medio e il ramo al rapporto di nodo (Vedi schema in Figura 1)16. Applicazione dell'approccio KAV include un fenotipo novello, calcolato di in vitro vasculogenesi, indicato come il ramo al rapporto di nodo. Il nostro lavoro recente ha dimostrato che questo rapporto è indicativo della connettività di rete e può essere associato con altri processi cellulari coinvolti nella formazione della rete, ad esempio motilità16.

Anche se in questi studi è stata valutata fetale colonie endoteliali del cellulare (ECFC) vasculogenesi, questo approccio di acquisizione e analisi di immagine può essere applicato facilmente per valutare qualsiasi tipi di cellule che subiscono la vasculogenesi o angiogenesi. Inoltre, questo approccio può essere utilizzato per identificare la funzione vascolare alterata risultante da una varietà di stati patologici, quali il diabete mellito gestazionale, come illustrato in questi studi. Inoltre, questo metodo potrebbe essere adattato per valutare la formazione della rete e ramificazione, che sono importanti per altri processi biologicamente rilevanti. Così, l'impatto potenziale dell'applicazione di questo approccio novello a sistemi biologici unici è ancora da determinare.

Protocol

1. preparati

  1. Colonia endoteliale di cultura che forma le cellule (ECFCs)
    Nota: ECFC fetale campioni utilizzati in questi esperimenti sono stati isolati da sangue del cordone ombelicale umano e coltivati di Angio BioCore (ABC) presso l'Indiana University School of Medicine come precedentemente descritto6. Fenotipizzazione di controllo di qualità di routine è stata condotta all'interno della ABC per confermare l'espressione degli antigeni endoteliali come descritto in precedenza19,20,21. Campioni utilizzati negli esperimenti sono stato attraversati minimamente (2 - 3 volte). Tutto lavoro di coltura del tessuto è stato effettuato in una cappa di coltura del tessuto. Tutti i reagenti, comprese le piastre di coltura del tessuto e le soluzioni, erano sterili.
    1. Due giorni prima dell'esperimento, cappotto 100 millimetri rotonda piastre di coltura del tessuto con 6 mL di collagene di tipo 1 di 0,05 mg/mL e incubare a 37 ° C durante la notte.
      Nota: Collagene di tipo 1 viene diluito in acqua bidistillata contenente acido acetico di 20 nM per una lavoro di concentrazione di 0,05 mg/mL.
    2. Il giorno prima dell'esperimento, tripsinizzano e replate ECFCs sulla targhetta tipo 1 del collagene rivestito in 1.1.1. (Vedi nota sotto 1.1).
    3. Per tripsinizzano ECFCs, aspirare media dalle cellule placcate e lavare con 7 mL di PBS. Aspirare il PBS, poi aggiungere 2-3 mL di tripsina 0.5% e incubare le cellule per 2-5 min a 37 ° C.
    4. Subito dopo incubazione con tripsina, aggiungere 3 mL di EGM2 e dispensare su e giù per rimuovere tutte le cellule aderenti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica 15 mL.
    5. Centrifugare tutti i campioni a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    6. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1-2 mL di EGM2. Mescolare accuratamente la sospensione cellulare e rimuovere una piccola aliquota (20-40 μL) per il conteggio.
    7. Aggiungere del blu di trypan parti uguali alla cella aliquota e Pipettare 10 µ l in un emocitometro. Contare il numero di cellule nei quattro quadranti primari dell'emocitometro.
      Nota: Utilizzare entrambi i lati dell'emocitometro per tutti i numeri dei campioni per aumentare l'accuratezza.
    8. Lavare le piastre di coltura del tessuto collagene-rivestito, che sono state preparate al punto 1.1.1, due volte con 7 mL di PBS. Dopo avere aspirato il secondo lavaggio PBS, aggiungere 10 mL di medium di crescita endoteliale 2 (EGM2) cultura media completati con 10% siero bovino fetale alle piastre.
    9. Utilizza i conteggi delle cellule ottenuti al passaggio 1.1.7, calcolare il volume della sospensione di cellule necessarie per cellule5 piastra 4 x 10. Piatto 4 x 105 ECFCs sulle piastre di coltura del tessuto preparata al punto 1.1.8 e incubare a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO2) durante la notte.
  2. Prima dell'esperimento, memorizzare forniture a 4 °C durante la notte
    1. Memorizzare una placca di metallo 3 "x 2", scivolo (tieni pacchetto fino al Apri in cappa), una scatola di sterile 20 microlitri (μL) consigli e matrice della membrana basale (matrice).
      Nota: La matrice è conservata a-80 ° C per lo stoccaggio a lungo termine; sempre scongelare a 4 ° C durante la notte o per diverse ore prima dell'uso.
  3. Confermare la disponibilità di uno spazio adeguato per le immagini su dischi rigidi del computer.
    Nota: Utilizzando la configurazione descritta in questo protocollo, circa 60 gigabyte (GB) di spazio sono stati richiesti per esperimento (4 GB/pozzetto). Tuttavia, le stime di spazio si basano sulla configurazione hardware e dovranno essere determinata per ciascun sistema.

2. il protocollo 1: Messa a punto sperimentale: preparando la diapositiva

  1. Raccogliere e preparare forniture
    1. Il giorno dell'esperimento, raccogliere le forniture per la placcatura di cellule sulla diapositiva, tra cui un secchio di ghiaccio, un piccolo contenitore di ghiaccio secco, un paio di forbici e una pipetta 20 μL. Tutti gli elementi a spruzzo con etanolo al 70%, asciugare con carta assorbente e inserire elementi in un cappuccio sterili per coltura.
    2. Raccogliere tutte le forniture conservate a 4 ° C (Vedi punto 1.2) tra cui la piastra di metallo, scatola di punte, scivolo e matrice. Spruzzare la casella dei suggerimenti con etanolo al 70% e posizionare la casella nel contenitore del ghiaccio secco.
      Nota: Rimuovi matrice dal frigo 4 ° C solo quando è pronto da usare e da mantenere sempre la matrice sul ghiaccio.
    3. Spruzzare la piastra metallica con etanolo al 70% e incorporarlo nel ghiaccio nel secchio di ghiaccio. Aprire la confezione contenente la diapositiva e porre il vetrino sulla placca di metallo per mantenere il freddo.
  2. Matrice di carico sulla diapositiva
    1. Impostata la pipetta 10 μL e togliere la punta punta fredda della scatola con la pipetta. Tagliare la punta di circa 1 cm con le forbici.
      Nota: taglio perpendicolare alla punta a ridurre le bolle nella matrice. La pipetta può essere impostata un volume leggermente maggiore di 10 μL per contabilizzare matrice attaccare all'interno della punta.
    2. Disegnare lentamente la matrice nella punta della pipetta. Posizionare immediatamente la punta della pipetta sul centro del pozzo. Toccare delicatamente la punta della pipetta sul fondo del pozzo ed estrarre lentamente la matrice.
      Nota: non non sopra pipetta, questo farà sì che bolle a forma. Se si forma una bolla, pop immediatamente utilizzando una piccola mancia.
    3. La diapositiva contiene 15 singoli pozzetti. Ripetere il passaggio precedente per ciascun pozzetto. Usare un nuovo puntale per ciascun pozzetto per mantenere coerenza e ridurre la matrice solidificare all'interno della punta.
    4. Una volta che la diapositiva viene caricata con tutti i pozzetti contenenti matrici, spingere il coperchio completamente sulla diapositiva e incubare a 37 ° C per 30-60 minuti fino a quando non si solidifica la matrice.
      Nota: Non lasciare la matrice asciugare. Aggiungere un piccolo volume (2-3 mL) di PBS nel tappo di una provetta conica da 50 mL accanto alla diapositiva nell'incubatrice per ridurre il rischio di essiccazione di matrice.

3. protocollo 2: Placcatura ECFCs sulla matrice

  1. Rimuovere aderente ECFCs dalle piastre di coltura del tessuto e raccogliere in sospensione
    1. Ottenere la coltura di tessuto piastre contenenti le ECFCs placcati il giorno precedente (Vedi sezione 1.1.9). EGM2 media di aspirare e lavare aderente ECFCs una volta con 7 mL di PBS.
    2. Aspirare il PBS, aggiungere 2-3 mL di tripsina e incubare le cellule aderenti per 2-5 min a 37 ° C.
    3. Subito dopo incubazione, aggiungere 3 mL di EGM2 e dispensare su e giù per rimuovere tutte le cellule aderenti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica 15 mL.
    4. Ripetere passaggi 3.1.1-3.1.3 per i restanti tre campioni ECFC fino a quando tutti i campioni di quattro cellule sono raccolti in sospensione.
  2. Preparare il mix master
    1. Centrifugare tutti i campioni a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    2. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1-2 mL di EGM2.
    3. Mescolare accuratamente la sospensione cellulare e rimuovere una piccola aliquota (20-40 μL) per il conteggio.
    4. Aggiungere del blu di trypan parti uguali alla cella aliquota e aggiungere 10 μL su un emocitometro. Contare il numero di cellule nei quattro quadranti primari dell'emocitometro.
      Nota: Utilizzare entrambi i lati dell'emocitometro per tutti i numeri dei campioni per aumentare l'accuratezza.
    5. Utilizzando la cella conta dall'alto, calcolare il volume di ogni campione di cellule che contiene 1.4x104 celle. Mescolare accuratamente tutte le sospensioni cellulari e aliquota 1.4 x 104 celle in una nuova provetta per preparare un mix master per ogni condizione sperimentale. Aggiungere media EGM2 in modo che il volume finale di ogni mix master è 175 μL.
    6. Mescolare ogni mix master delicatamente pipettaggio e aliquota 50 μL di mix master nei singoli pozzetti sulla diapositiva.
      Campioni di Nota: tutti sono placcati in triplice copia, con mix master calcolato per 3,5 pozzi assicurare un volume sufficiente per 3 pozzi.
  3. Incubare il vetrino
    1. Incubare il vetrino a 37 ° C fino a quando non può essere spostato nella camera del microscopio per l'imaging.
      Nota: Il tempo tra la placcatura e la formazione immagine dovrebbe essere quanto più breve possibile limitare la perdita di dati durante le prime fasi di vasculogenesi.

4. protocollo n. 3: Installazione di microscopio e acquisizione di immagini

Nota: Per i nostri studi, protocolli 2 e 3 sono state condotte simultaneamente da individui separati. Se protocolli 2 e 3 devono essere completate dalla stessa persona, protocollo 3 punti 4.1 e 4.2 sotto deve essere completato prima dell'inizio del protocollo n. 2 qui sopra.

  1. Accendere il microscopio e il computer
    1. Circa una o due ore prima di iniziare l'esperimento, accendere e preriscaldare l'incubatore di fase superiore a 37 ° C, impostare la CO2 al 5% e impostare l'umidità al 85%. Riempire il serbatoio di umidità di incubatrice, se è vuota.
    2. Inserire una diapositiva vuota chambered in una delle due posizioni aperte e riempire con acqua distillata. Fissare il termometro di feedback per controllo temperatura in camera, se disponibile.
      Nota: Se il termometro di feedback è disponibile, utilizzare questa "temperatura incubatrice" per verificare che la camera ha equilibrato.
    3. Accendere un ventilatore secondario impostato su 39-42 ° C per riscaldare le diapositive dal basso e minimizzare la condensazione.
    4. Aggiungere una seconda diapositiva come un vuoto fino a quando la diapositiva sperimentale può essere aggiunto. Questa diapositiva funge da un segnaposto di posizione per la configurazione delle impostazioni di acquisizione immagine per singoli pozzetti durante l'installazione.
    5. Aggiungere acqua al serbatoio che circondano i pozzi della seconda diapositiva per imitare le condizioni durante l'esperimento di formazione immagine. L'acqua che circonda i pozzi consente la valutazione dell'umidità durante l'installazione di microscopio e preriscaldamento.
      Nota: Pre-equilibrazione del palcoscenico-top incubatrice e soffiatore secondario è fondamentale per mantenere un ambiente di coltura stabile. Maggior parte dei controllori di camera di cellule vive dare feedback in tempo reale della temperatura, CO2e l'umidità per valutare la conformità del sistema. Prima di continuare, controllare l'accumulo di umidità sulla diapositiva ed eccessivo essiccamento del serbatoio come riempito in 4.1.5. Potrebbe essere necessario essere regolato se vi è eccessiva essiccazione o condensa nella camera di umidità. Per aumentare l'umidità, aggiungere salviette bagnate con acqua distillata. Per ridurre la condensa, ridurre l'impostazione di umidità adeguato in 4.1.1 oppure come condensazione potrebbe essere un segno di bassa temperatura, controllare le impostazioni di temperatura di camera e il posizionamento della ventola secondaria.
  2. Configurare le impostazioni di acquisizione di immagini di base durante l'equilibrazione.
    Nota: Image acquisition viene configurato tramite software che controlla la fase dell'otturatore e fotocamera. Uno strumento di installazione multidimensionale è il modo più semplice per configurare il software. Inoltre, il software sarà necessario dispongono di routine di messa a fuoco automatica per garantire il controllo di messa a fuoco nel corso della durata dell'esperimento.
    1. Utilizzare il software per impostare posizioni multiple di fase per ciascun pozzetto. Per questo protocollo, selezionare il centro dei pozzi.
    2. Configurare l'acquisizione dell'immagine in modo tale che ad ogni posizione di fase, l'intero bene è imaged. Ad esempio, utilizzare un multiposizione con sovrapposizione di immagine di 10-20% e circa 5 x 5 campi, dipendendo dalla fotocamera e ingrandimento finale.
    3. Configurare l'intervallo di tempo per l'imaging ogni 15 min.
      Nota: Utilizzando la configurazione descritta in questo protocollo, 15 tutti i pozzetti della diapositiva sono imaging all'interno di un intervallo di 15 min.
  3. Caricare la diapositiva sperimentale
    1. In seguito equilibrazione della camera dell'incubatore, sostituire la diapositiva vuota con la diapositiva sperimentale.
      Nota: un'equilibrato camera avrà una temperatura stabile, CO2e l'umidità per almeno 20 min. Una volta che la diapositiva sperimentale è pronta, è imperativo che i passaggi siano completati rapidamente per ridurre al minimo i "tempi morti" tra placcatura e il punto iniziale tempo catturato dal microscopio. Inoltre, per facilitare il confronto tra esperimenti di formazione immagini, questa volta deve essere coerenza. In questi esperimenti, tutti i passaggi descritti nel protocollo 3 sezione 4.3 richiesto circa 30 minuti per completare.
    2. Rimuovere il coperchio scorrevole e aggiungere acqua al serbatoio che circondano i pozzi sulla diapositiva.
      Nota: Il coperchio viene rimosso per tutta la durata dell'esperimento imaging.
  4. Configurare le impostazioni di acquisizione di immagine finale
    1. Posizionare l'obiettivo CFI piano Fluor DL 10 X e selezionare l'anello di fase Ph1 sul condensatore. Con il primo bene a fuoco, regolare il percorso della luce diascopica per illuminazione di Köhler e configurare ottica fase controllando l'allineamento dell'anello di fase nel condensatore con la maschera di fase oggettiva.
    2. Configurare il tempo di esposizione e regolare l'intensità della lampada per contrasto di fase, che in genere è inferiore a 500 ms.
    3. Ciclicamente ogni fase posizione insieme a 4.2.1 e confermare che il centro del pozzo è selezionata e regolare, se necessario.
    4. Ad ogni posizione di fase, concentrarsi sulle cellule placcato nel pozzo e impostare z posizione della posizione fase utilizzata per l'imaging nel software.
    5. Testare il meccanismo di messa a fuoco automatica per il microscopio. Se l'autofocus è basata su hardware, assicurarsi che è su e posizionati correttamente per tutte le posizioni di fase.
      Nota: come il campione e il palco può deriva verticalmente durante l'esperimento, è importante che il software verifica l'autofocus a ogni posizione di fase e ogni punto di tempo affinché imaging affidabile durante il corso di tempo. Se possibile, una posizione di messa a fuoco automatica determinata al punto precedente di tempo deve essere utilizzata come punto di partenza per la routine successiva messa a fuoco automatica. In questo modo, deriva in corso può essere regolato facilmente per.
    6. Ridurre o spegnere le luci in camera microscopio e iniziare l'esperimento di formazione immagine.

5. protocollo n. 4: Analisi elaborazione e cinetica di vasculogenesi (KAV) dell'immagine

  1. Salvare immagini da tempo singoli punti come una serie di immagini per ogni pozzetto
    Nota: maggior parte dei software per l'acquisizione immagine possibile esportare file TIFF multipagina (stack) di serie temporali. KAV è progettato per funzionare su set di dati che possono includere più punti di tempo. Così, nello stack di tutta l'immagine per una posizione determinata fase di esecuzione dell'analisi. Se necessario, il software di elaborazione di immagini possono importare singole immagini da ogni punto di tempo per ricostruire una serie di immagini.
  2. Aprire il software sul computer di elaborazione di immagini
  3. Aggiungere KAV per il software di elaborazione di immagini
    1. Trascinare il file KAV da una cartella nella barra grigia nella parte inferiore della finestra del software. Fare clic su 'Salva' per aggiungere il software all'elenco.
  4. Aprire lo stack di immagine per essere analizzati
    1. Fare clic su 'File' e poi 'Open' attraverso il menu a discesa nel software di elaborazione delle immagini, o trascinare il file di immagine nella barra grigia come descritto al punto 5.3.1.
    2. Convertire le immagini a 8 bit facendo clic su 'Immagine', 'Tipo', '8 bit'.
  5. Creare un'area di interesse (ROI)
    1. Aprire il gestore di ROI cliccando su 'Analyze' nella barra degli strumenti. Quindi selezionare 'Strumenti' seguiti da ' ROI Manager'.
    2. Creare un nuovo ROI facendo clic su strumenti di selezione cerchio o rettangolo sulla barra degli strumenti e l'area di selezione desiderata di disegno sull'immagine. Fare clic su 'Aggiungi' nella finestra di gestione di ROI per salvare quella forma.
      Nota: Un ROI creato in precedenza possono essere aperti mediante trascinamento salvato ROIs (cartella compressa) al bar 'Drag and Drop' per aprire in gestione.
    3. Fare clic sull'etichetta del ROI elencato in gestione ROI per vederlo sull'immagine.
      Nota: Se il ROI non apparirà sull'immagine, creare un secondo ROI (qualsiasi dimensione/forma) e aggiungerlo al manager. Una volta che entrambi ROIs compare nell'elenco, fare clic su Avanti e indietro tra i due e il ROI desiderato apparirà sull'immagine.
    4. Se necessario, allineare il ROI. Una volta che il ROI è a posto sull'immagine nella posizione desiderata, andare al Menu e fare clic su 'Modifica' poi 'Chiaro fuori'. Questo cancellerà i dati di immagine all'esterno il ROI (utile per le forme non rettangolari) per ogni immagine nello stack.
      Nota: È possibile anche scegliere il 'Immagine' e 'Crop' se si utilizza un ROI rettangolarmente sagomato.
  6. Eseguire il software KAV
    1. Nella barra dei menu, fare clic su 'Plug-in'.
    2. Selezionare la rete 'analizzare' plug-in. Si aprirà una finestra con opzioni per modificare le impostazioni del plug-in.
    3. Modificare il metodo di Sogliatura utilizzando la freccia a discesa.
    4. Una volta che vengono selezionate tutte le impostazioni appropriate, fare clic su 'OK' per avviare il software di elaborazione.
      Nota: Le impostazioni Appropriate sono determinate attraverso la visualizzazione delle consegne di scheletro e maschera generata da KAV, che sono indicativi di precisione del software per identificare e discernere le cellule e reti da fondo dell'immagine di contrasto di fase.
  7. Salvare i dati generati dal KAV
    1. Una volta che il plug-in ha terminato l'analisi, due finestre saranno pop-up sullo schermo tra cui una tabella di dati con valori numerici e una pila di fuse immagini raffiguranti rappresentazioni da scheletro e maschera.
    2. Salvare i valori numerici di navigazione verso l'angolo superiore sinistro della tabella dati e facendo clic su 'modifica', quindi 'copia' o 'Taglio' per incollare i valori in un foglio di calcolo excel.
    3. Fare clic sull'immagine fusa di scheletro e maschera. Salvare lo stack di immagine fusa scheletro/maschera come file TIFF Tagged Image File Format () facendo clic su 'File', 'Save As' 'TIFF'.
    4. Salvare il contrasto di fase ritagliata immagine dello stack (creato utilizzando ROI) facendo clic su 'File,' 'Save As' 'TIFF.'
    5. Fare clic sulla finestra di ROI Manager e selezionare il ROI utilizzato per ritagliare le immagini. Fare clic su 'Piu' seguito da 'Salva' per salvare il ROI per un utilizzo futuro.
      Nota: Utilizzando il ROI stesso contribuirà a mantenere coerenza attraverso analisi.

Representative Results

KAV produce rappresentazioni visive della struttura di rete
Il contrasto tra il ECFCs e lo sfondo di matrice nelle immagini di contrasto di fase consente KAV identificare strutture cellula-specifico. Reti ECFC identificati da KAV sono rappresentati pittoricamente come rappresentazioni da scheletro e maschera per illustrare la struttura usata dal software per la quantificazione (Figura 2A). Soprattutto, valutazione qualitativa delle copie trasformate scheletro e maschera consente la rapida identificazione di KAV sensibilità e precisione, che può essere utile nel determinare le impostazioni di soglia ottimale e interpretare i risultati di analisi. Quando la qualità delle immagini di contrasto di fase è alta e si ottiene un contrasto sufficiente, KAV individua con precisione le reti ECFC come indicato dalla somiglianza tra l'immagine di contrasto di fase e il KAV-generato scheletro e maschera rendition (Figura 2 A e Video 1).

In alternativa, se immagini di contrasto di fase non si devono ad alto contrasto e/o manufatti di imaging, come si verificano gridding, precisione di rilevamento di rete è ridotto e i risultati diventano ambigue (Figura 2B). Inoltre, formazione di bolle d'aria all'interno della media delle cellule può anche oscurare la precisione di rilevamento (Figura 2). Tuttavia, problemi con la qualità dell'immagine spesso possono essere superati attraverso la selezione dei metodi di soglia diversi inclusi nel software KAV. Ad esempio, l'immagine di contrasto di fase in Figura 2B è stata analizzata utilizzando le impostazioni di elaborazione di immagine identica ad eccezione del metodo di soglia. Dalle consegne di scheletro e maschera, si evince che la soglia di Otsu ha provocato una maggiore accuratezza nel rilevamento delle reti ECFC mostrato nell'immagine di contrasto di fase (Figura 2B). Di conseguenza, la qualità dell'immagine è fondamentale per raggiungere risultati precisi e significativi in questo test. Tuttavia, metodi di soglia diversi inclusi nell'interfaccia utente di KAV permettono la regolazione di analisi di immagine basata sulla qualità delle immagini in ingresso.

Time-lapse microscopia identifica le differenze qualitative e quantitative nella vasculogenesi ECFC dopo l'esposizione intrauterina diabete mellito gestazionale
Recentemente, l'approccio analitico di KAV è stata applicata per valutare la funzione ECFC fetale dopo esposizione materna tipo 2 mellitus del diabete (T2DM) nell'utero16. Usando KAV, alterata cinetica di vasculogenesi sono stati identificati in fetale ECFCs esposti di T2DM. Tuttavia, oltre a T2DM l'esposizione, che si verifica durante la gestazione intera, diabete mellito gestazionale (GDM) o lo sviluppo di intolleranza al glucosio comunemente nel terzo acetonide della gravidanza, altera anche ECFC funzione13. Di conseguenza, KAV è stato applicato per determinare se esposti a GDM ECFCs visualizzare anche alterata cinetica di formazione di rete ECFC. Fase 1 (0-5 h) e fase 2 (5 + h) sono stati valutati usando tempo microscopia lasso accoppiato con analisi KAV (Figura 3). Immagini di contrasto di fase rappresentativa ha acquisito all'inizio dell'acquisizione di immagini (h 0,50) e nel corso del tempo (5.00 e 10.00 h) raffigurano la formazione della rete ECFC nei quattro campioni testati da una singola giornata sperimentale (Figura 3 e Video 1 ). Nonostante equivalente cella di carico, come osservato nelle immagini di contrasto di fase nelle ore 0,50, differenze qualitative nella struttura di rete sono evidenti nei punti di tempo 5,00 e 10,00 ore. ECFCs dalla gravidanza senza complicazioni (UC) formano una rete complessa e intricata 5 ore post-placcatura, simili a nostri dati precedentemente pubblicati16. Al contrario, ECFCs da GDM 1 (GDM1) modulo, che molto poche strutture che non sono interconnessi di rete di esempio. Tuttavia, questo modello non si riflette in tutti i campioni ECFC ottenuti dalle gravidanze GDM, indicative di eterogeneità tra i campioni. GDM2 campioni e GDM3 visualizzare una maggiore formazione di rete rispetto alle GDM1, anche se i modelli di connettività appaiono alterati rispetto al campione di UC. D'importanza, KAV misura diversi componenti strutturali delle reti ECFC di individuare fenotipi sia ovvi e sottili.

Oltre a generare copie trasformate di scheletro e maschera della struttura di rete, KAV quantitates dieci metriche della struttura di rete, incluso il numero di strutture di rete individuali, nodi, nodi triple-ramificati, Quadrupla-ramificati nodi, rami, totale lunghezza del ramo, lunghezza del ramo medio, reti di filiali a rapporto di nodo, totale chiuso e rete zona16. KAV compila i dati per ciascun campione in un'unica tabella di valori per tutte le immagini del corso di tempo. La tabella 1 include dati rappresentativi crudi da uno studio di imaging per un campione ECFC. Parametri della struttura di rete misurata da KAV sono organizzati in colonne, e i dati per immagini sequenziali acquisite nel corso del tempo sono organizzati in righe. Per esempio, nei nostri studi, immagine 1 è stata ottenuta il post-placcatura 30 min con le immagini successive essere raccolti ogni 15 min. Raw valori generati da KAV può quindi essere rappresentati graficamente o ulteriormente analizzati utilizzando più complesso statistica si avvicina a16.

Cinque grafici raffiguranti i valori medi della struttura di rete da tre esperimenti separati sono indicati per un singolo campione semplice (UC) ed i tre campioni GDM (Figura 4). Il campione di UC in questi esperimenti effettuato similmente ai precedentemente analizzato UC campioni16. In precedenza, è stato identificato che ECFC vasculogenesi in vitro è bi-fasico, che consiste della fase 1 (0 - 5 h) e fase 2 (5-10 h)16. Questo modello è costante negli studi attuali, come evidenziato dal grafico raffigurante dati rete chiusa (Figura 4). Il campione UC formato un maggior numero di reti chiuse rispetto a tutti e tre i campioni GDM. È interessante notare che, tre dei quattro campioni sembrano avere un momento simile al numero massimo di reti chiuse, che si verifica tra 2,5 e 3 ore. Tuttavia, il campione di GDM2 era più lento raggiungere massimale reti chiuse, che si sono verificati 5 ore post-placcatura. E, nonostante l'esempio GDM2 formando reti massimale meno rispetto al campione di UC, le reti di che forma sono state mantenute allo stesso modo al campione UC nel corso del tempo. Al contrario, GDM1 e GDM3, che formano reti meno rispetto al campione di UC, inoltre hanno esibito una riduzione globale della rete numero nel corso del tempo. Nel complesso, dal grafico che raffigura il numero di rete chiusa, è evidente che tutti i campioni di ECFC visualizzato un modello bi-fasico di formazione della rete, tuttavia il numero massimo delle reti raggiunto il tasso di formazione varia con i campioni.

Area di rete rappresenta l'area medio all'interno delle reti chiuse formata dalle ECFCs. Di conseguenza, maggiore numero rete chiusa, il più piccolo le aree di rete. Questo modello si riflette nei grafici di zona di rete dove il campione UC, che ha formato un numero maggiore di reti chiuse, ha avuto più piccole zone di rete nel tempo rispetto ai tre campioni GDM (Figura 4). GDM2, che ha raggiunto il massimi reti chiuse più lentamente, ha esibito la zona alta rete inizialmente, tuttavia l'area stabilizzata nel tempo e questo era più simile al campione UC a 15 ore. Nel corso del tempo, la superficie media della rete in tutti i campioni aumentata dovuto de-stabilizzazione rete. Tuttavia, alcuni campioni, come GDM1 e GDM3, hanno esibito un aumento più rapido nell'area di rete, che è probabilmente indicativo di stabilità in diminuzione rispetto ad altri campioni che esibiscono un aumento più graduale.

GDM-esposti ECFCs esibiscono stabilità di rete ridotto
Il rapporto dei rami ai nodi è un fenotipo novello calcolato di KAV e identificato nei nostri studi precedenti, e questo è indicativo di connettività di rete16. Nello studio corrente, il campione UC ha avuto un rapporto basso, che ha rappresentato un alto livello di connettività di rete che è stata mantenuta nel tempo (Figura 4). Per contro, i tre campioni GDM ha avuto un più alto rapporto dei rami ai nodi, soprattutto nella fase 2 di formazione della rete. Questa osservazione dimostra de-stabilizzazione di strutture di rete e connettività ridotta.

Nel complesso, GDM1 formato meno nodi e rami rispetto ad altri esempi, con la riduzione mantenuta nel corso dell'esperimento. GDM2 e GDM3 formato e mantenuto un maggior numero di rami rispetto al campione di UC, soprattutto tra 5-15 h. I numeri dei nodi rilevati nelle reti GDM2 e GDM3 erano più simili al numero di nodi nel campione UC, soprattutto tra 10-15 h. Un maggior numero di rami, ma un simile numero di nodi, ha potuto rappresentare il ramo maggiore rapporto tra nodo evidente intervalli di tempo successivi nei campioni di GDM. D'importanza, modifiche simultanee nel ramo e nodo numero possono essere difficili da interpretare in grafici separati. Tuttavia, il romanzo ramo al rapporto di nodo offre un modo per valutare come i cambiamenti, tra cui lievi modifiche difficile da rilevare nei grafici singoli, di ramo e il nodo numero, provocare connettività di rete alterata.

Figure 1
Figura 1 : Disegno schematico che illustra 10 parametri quantificati da analisi cinetica di vasculogenesi (KAV). KAV quantitates dieci parametri distinti della struttura di rete. Tutti i parametri sono codificati per colore e descritta nello schema numerico (1-10). I parametri includono il numero di reti di filiali (verde, 1), chiusi (blu, 2) e nodi (rosso, 3), media di rete (arancione, 4), il numero di strutture di rete (nero, 5), triple-ramificati nodi (giallo, 6) e quad-ramificati (viola, 7), così come il totale (9) e media lunghezza del ramo (10) e il rapporto tra il numero di rami per il numero di nodi (10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Analisi cinetica di vasculogenesi (KAV) quantitates struttura rete. (A) scheletro e maschera interpretazioni delle strutture di rete identificate da KAV utilizzando fase contrasto immagini forniscono una rappresentazione visiva delle strutture di rete individuati e quantificati da KAV. Barra della scala = 500 µm. (B) un'immagine di contrasto di fase rappresentativa della post-placcatura di ECFC reti 10 h con basso contrasto e griglia segna da cuciture singole immagini insieme. Metodi di soglia diversi, come media o Otsu, selezionabili nel KAV plug-in per migliorare l'accuratezza di quantificazione, se immagini di contrasto di fase hanno un basso contrasto o gridding si verifica. Rappresentazioni di scheletro e maschera dell'immagine di contrasto di fase sono mostrati per metodi di soglia media sia Otsu. Immagini di contrasto di fase sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo 10x. Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : L'esposizione intrauterina GDM altera la formazione del reticolo ECFC. Immagini di formazione della rete ECFC furono catturati a intervalli di 15 min per 15 h di microscopia di contrasto di fase. Immagini di contrasto di fase rappresentativa con incrementi di 5 h, a partire dal momento di placcatura (0,5 h), sono indicati per il UC e tre campioni di GDM. Immagini di contrasto di fase sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo 10x. Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : ECFCs esposto alla cinetica di formazione rete di intrauterina GDM espositivo alterato. ECFCs sono stati ottenuti da una gravidanza semplice (UC, nero) e tre gravidanze complicate da diabete mellito gestazionale (rosso di 1-3, GDM). Immagini di contrasto di fase vennero catturati a 15 min intervalli per 15 h. software di analisi cinetica di vasculogenesi (KAV) quantificato chiusi reti, rete aree, rami, nodi e il rapporto dei rami ai nodi. I dati illustrati rappresentano la media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti separati per ciascun campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1: L'esposizione intrauterina GDM altera la cinetica di formazione di rete ECFC. Immagini di formazione della rete ECFC furono catturati a intervalli di 15 min per 15 h di microscopia di contrasto di fase. Immagini di contrasto di fase sono indicati per il UC e tre campioni di GDM oltre 15 h a partire da 0,5 h. La barra della scala rappresenta 500 µm. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Immagine Totale ramo reti Nodi Triple Quadruple Rami Lunghezza totale ramo * Ramo di medio lunghezza * Ramo di nodo rapporto Reti chiuse Zona di rete * *
1 382 290 278 11 943 47210 124 3.25 9 480214
2 284 345 337 8 940 50699 179 2.72 16 264469
3 205 376 366 9 910 55728 272 2.42 27 150621
4 162 422 407 15 947 59692 368 2.24 40 98713
5 132 454 441 12 967 61923 469 2.13 53 72951
6 122 435 419 14 907 62587 513 2.09 68 56948
7 88 429 411 17 852 63983 727 1.99 74 51429
8 68 451 437 13 874 63960 941 1.94 74 51780
9 93 437 417 18 905 60901 55V 2.07 49 82919
10 126 511 487 24 1075 61981 492 2.1 37 116857
11 49 397 384 12 737 61823 1262 1,86 79 48805
12 81 376 364 10 751 56817 701 2 63 64431
13 98 509 482 26 1028 60799 620 2.02 44 98056
14 93 449 416 31 909 58282 627 2.02 45 94081
* arrotondato al più vicino micron, * * arrotondato al più vicino micron ^ 2

Tabella 1: Rappresentante dati grezzi da formazione immagine di uno studiano per un campione ECFC.

Discussion

KAV consente la valutazione di grandi insiemi di dati con più punti di tempo
Tradizionalmente, la quantificazione di vasculogenesi in vitro ha consistito di un singolo, o alcune misurazioni del punto di tempo. Questo approccio statico è semplicemente inadeguato per catturare e quantificare un processo dinamico e complesso. Pertanto, questo nuovo metodo è stato sviluppato per consentire efficiente analisi della cinetica di formazione di rete per ottenere informazioni sulle potenziali meccanismi molecolari coinvolti nel processo dinamico di vasculogenesi. Efficienza e automazione sono componenti importanti nello sviluppo di nuove tecniche per generare e analizzare grandi quantità di dati di imaging. KAV è stato sviluppato specificamente per analizzare gli stack di grande immagine composto da centinaia di immagini per diminuire il tempo e la manodopera necessaria per ricavare conclusioni biologicamente significative da insiemi di dati time-lapse. D'importanza, KAV conduce elaborazione delle immagini e generazione di dati in una manciata di secondi per i piccoli (meno di 100 immagini) immagine pile e minuti per più grande (maggiore di 100 immagini) pile, con conseguente efficienza impareggiabile di immagine. Organizzazione dei dati in fogli di calcolo di tempo e parametri misurati consente inoltre la rapida generazione di presentazione grafica e analisi statistica.

Sfide in applicazione di successo di questo approccio
Anche se questo test include miglioramenti di analisi e acquisizione di immagini, alcune sfide possono ostacolare la corretta implementazione. I quattro principali ostacoli sono la umidità stabilità, precisione di temporizzazione di cromatura per acquisizione di immagini, software e affidabilità hardware e la gestione di grandi insiemi di dati generati per ogni esperimento. Formazione immagine stabile di cellule vive sopra parecchie ore può essere impegnativa. In particolare, umidificazione appropriata e coerenza è richiesta per le camere a imaging. L'angiogenesi diapositive vengono utilizzati in questo test, che sono progettati per la parallelizzazione di saggi di angiogenesi basato su matrice. Loro volume basso, circa 50 µ l, rende evaporazione e condensazione considerazioni rilevanti per le condizioni di coltura estesa. Per combattere questo problema sperimentale, è necessario utilizzare un'incubatrice che regola l'umidità. Tuttavia, è possibile anche richiesto di aumentare questo regolamento se eccessivo essiccamento della camera imaging si verifica nel corso del tempo. Abbiamo trovato che l'approccio più semplice per aumentare l'umidità è quello di aumentare la superficie dell'acqua nella camera. Per raggiungere questo obiettivo, il nostro protocollo suggerisce le seguenti tre fonti di acqua: una seconda diapositiva chambered riempito d'acqua, che è anche dove viene misurata la temperatura dell'incubatore, acqua nella zona circostante i pozzi sulle diapositive e carta da filtro bagnata o salviette. Al contrario, la condensazione si verifica quando la temperatura dell'aria in camera si raffredda la parte inferiore della diapositiva e l'umidità all'interno della camera condensa sulle diapositive e i pozzi. Questa complicazione può portare ad una diluizione dei media delle cellule e un effetto lente che interferisce con il contrasto di fase. In questi studi, la condensazione è stato minimizzato attraverso l'applicazione di aria riscaldata (39-42 ° C) sulla parte inferiore della diapositiva.

Una considerazione fondamentale per qualsiasi studio time-lapse è coerenza tra esperimento iniziazione e imaging. I tempi di avvio di imaging sono critico per l'interpretazione degli eventi a valle. Per garantire la precisione di temporizzazione di questo test, il tempo tra placcatura iniziale e il primo punto di tempo imaged deve essere controllato attentamente. In pratica, questo "tempo morto" può essere ridotto al minimo, ma ancora più importante, deve essere coerente per consentire esperimenti in giorni diversi da confrontare. Per esempio, in questo protocollo ci aspettiamo un tempo morto di circa 30 min. Questo può essere facilitato dalla vicinanza della preparazione sperimentale e strutture di formazione immagine.

Che cosa potrebbe sembrare banali dettagli a prima vista sono importanti per la gestione dei dati, stabilità dell'hardware e software. Il software e i driver hardware associato, ambiente di rete e software automatizzato Aggiorna tutti influenzano la stabilità del software. Vale la pena di test questo protocollo in una "prova generale" per identificare i colli di bottiglia e potenziali fonti di problemi nell'acquisizione immagine; per esempio, controllare per installazione inaffidabile cellule vive, fase, otturatore e fotocamera affidabilità e le politiche di tecnologia di informazioni istituzionali sulla automatizzato sistema operativo e gli aggiornamenti software.

Gestione dei dati è una preoccupazione costante di ogni esperimento imaging che genera centinaia di migliaia di immagini. Fortunatamente, software commerciale spesso controlla lo spazio disponibile prima di iniziare un esperimento di formazione immagine. Tuttavia, questo test include anche l'elaborazione delle immagini post-acquisizione e analisi che possono aggiungere l'onere di spazio di disco rigido e interferire con imaging esperimenti, se lo spazio disponibile è limitato. Ulteriormente, la sicurezza e la stabilità del computer non può essere garantite, anche con soluzioni hardware come ad esempio una matrice ridondante di dischi identici. Così, una strategia di gestione dei dati per garantire spazio sul hard disk del computer per esperimenti in corso e un robusto l'archiviazione remota, ad esempio con una risorsa di archiviazione istituzionale, è necessaria.

Strategie per ottimizzare la qualità dell'immagine
Anche se la capacità di discernere con precisione ECFCs dallo sfondo matrix KAV è robusta, la sensibilità del test dipende dalla qualità dell'immagine. Ad esempio, se l'immagine ha un contrasto basso, il software rileverà le reti delle cellule con meno precisione (Figura 2B). La qualità del contrasto di fase è influenzata da diversi fattori, tra cui le impostazioni del microscopio utilizzato per acquisizione di immagini, caricamento della matrice e il supporto di sospensione cellulare durante la preparazione di test e mantenimento dei livelli di media all'interno dei pozzetti nel corso di formazione immagine. Per ottimizzare il contrasto di fase per queste analisi, sono stati effettuati adeguamenti minori per allineamento di anello di fase nel microscopio per migliorare il contrasto. Inoltre, preparazione del campione è stato rigorosamente testata per garantire il caricamento media uguale e coerente. Se la quantità di matrice e/o supporto caricato nei pozzetti è sotto o sopra il range ottimale, un menisco può formare leader a contrasto di fase alterata. Infine, data la bassa quantità di liquido nei pozzetti, è fondamentale per mantenere i livelli di supporto riducendo evaporazione e condensazione, come indicato in precedenza. Nel complesso, ottimizzazione del dosaggio è fondamentale per generare immagini di contrasto di alta qualità per l'analisi.

Oltre alla qualità di contrasto di fase, altri fattori possono avere un impatto anche risultati di analisi compreso contaminazione media, imperfezioni nella matrice e le particelle o detriti nella matrice o media. La contaminazione è un pericolo di questo test poiché coinvolge live cell imaging sopra parecchie ore in una camera di microscopia. Per ridurre il rischio di contaminazione, le sospensioni delle cellule e matrice vengono caricate sulla diapositiva in una cappa sterile. Inoltre, ogni campione è in genere placcato in doppio o triplice copia per un esperimento per ridurre al minimo il rischio di perdita di dati a causa di problemi imprevisti come detriti o particelle l'analisi di confondimento.

Bisogno di esempio eterogeneità unità per una maggiore sensibilità
Eterogeneità è stato osservato e segnalato in precedenti studi di ECFCs esposti a GDM13. Un alto livello di eterogeneità nella funzione delle cellule osservata in questi campioni è speculato per essere attribuibile a parecchi fattori compreso la gravità della malattia materna, durata di malattia e di stile di gestione utilizzato per regolare i livelli di glucosio del sangue. Cosa importante, questo approccio analitico acquisisce la gamma dinamica di ECFC vasculogenesi, rendendo così possibile identificare differenze fenotipiche dovuto eterogeneità funzionale in campioni da gravidanze GDM. Nel complesso, l'uso di campioni primari, come quelli utilizzati in questi studi, può introdurre maggiore variabilità rispetto ad una linea cellulare. Come maggiore enfasi è posta sulla traslazionale studi condotti su campioni multipli di animale o umani primari con variabilità funzionale, sensibilità del test è essenziale per il rilevamento e la derivazione delle misurazioni biologicamente significativi e conclusioni. Di conseguenza, lo sviluppo di approcci come KAV migliorerà la quantità e la qualità dei dati generato di angiogenesi e vasculogenesi in vitro saggi per abilitare più robusto osservazioni e conclusioni. Inoltre, questi dati agevolerà futuri indagine dei meccanismi molecolari che contribuiscono alla alterata ECFC vasculogenesi, seguendo l'esposizione intrauterina GDM.

Applicazioni future di questo approccio
Anche se questo metodo è stato applicato per valutare fetale ECFC vasculogenesi in vitro in questi studi, le potenziali applicazioni di questo approccio sono numerose. Questa tecnica può essere facilmente implementata per studiare qualsiasi popolazione di cellule che partecipa nel processo di vasculogenesi o l'angiogenesi. In particolare, può essere utilizzato per lo studio di popolazioni di cellule individuali, come è stato dimostrato in questo studio, ma potrebbe essere applicato anche ai sistemi di co-coltura. In futuro, sarebbe utile espandere questo approccio oltre l'analisi bidimensionale in vitro per valutare modelli tridimensionali (3D). Anche se la versione corrente di KAV sarebbe insufficiente per la quantificazione dei dati di imaging 3D, un approccio analitico time-lapse, multi-parametrico similmente progettato specificamente per i modelli 3D o in vivo informerebbe se le osservazioni fatte in due dimensioni in vitro sono rappresentativi della funzione delle cellule in un ambiente più biologicamente rilevante.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass ed Emily Sims (Angio BioCore presso l'Indiana University Simon Cancer Center) per ottima assistenza tecnica nel derivare i campioni ECFC. Gli autori riconoscono anche d. ssa Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder e Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) per discussione accademica così come Janice pareti (Indiana University School of Medicine) per supporto amministrativo. Tutti imaging è stata eseguita presso il centro Indiana per microscopia biologica, Indiana University School of Medicine. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 e U10 HD063094) e Fondazione per bambini di Riley. Inoltre, questa pubblicazione è stato reso possibile con supporto parziale dal National Heart, Lung e sangue Istituto di The National Institutes of Health sotto Premio # T32 HL007910.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Tissue Culture Plates Fisher 353003
15 mL conical tubes Fisher 1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides Ibidi 81506
Matrigel Fisher (Corning) 354234
EGM2 Medium Lonza CC3162
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic Fisher MT30004C1 Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS Fisher (Corning) MT25052CI
Type 1 Collagen Fisher (Corning) 354226 100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL.
Glacial Acetic Acid Fisher A38-212 Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM.
Kim Wipes Fisher 06-666
Chambered slide Ibidi 80296 This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher (Gibco) 20012027 1x solution, pH 7.2
Microscope Nikon Instruments MEA53100 and MEF55030 Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage Prior Instruments ProScan II Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective Nikon Instruments 93178 CFI Plan Fluor DL 10X
Camera Hamamatsu C11440-42U ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower Precision Controls N/A This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator  OKOLabs H301 BoldLine including a two position slide holder
Computer Hewlett-Packard Z620 or equivalent 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card 
Nikon Elements Software Nikon Instruments AR v 4.20 ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis

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Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi <em>In Vitro</em>
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Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).More

Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).

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