Summary
Здесь мы представляем протокол для покадровой томографии и анализа vasculogenesis в пробирке с использованием фазы контрастной микроскопии, в сочетании с открытым исходным кодом, кинетический анализ Vasculogenesis. Этот протокол может применяться для количественной оценки vasculogenic потенциал многочисленных типов клеток или экспериментальных условиях, которые моделируют сосудистых заболеваний.
Abstract
Vasculogenesis представляет собой сложный процесс, по которому стволовых и прогениторных клеток эндотелия проходят de novo судно формирования. Количественная оценка vasculogenesis стала центральная индикация эндотелиальной прогениторных клеток функциональности, и таким образом, было предпринято несколько попыток улучшить как in vitro и in vivo vasculogenesis модели. Однако стандартные методы ограничены в области, с статических измерений, неспособность захватить многие аспекты этого весьма динамичного процесса. Таким образом цель разработки этого протокола, Роман было оценить кинетику в пробирке vasculogenesis для того чтобы quantitate ставки сети формирования и стабилизации, а также обеспечить понимание потенциальных механизмов, лежащих в основе сосудистой дисфункция. Применение настоящего Протокола продемонстрировал с помощью плода эндотелиальной колонии, формируя клетки (ECFCs) подвергаются матери сахарный диабет. Плода ECFCs были получены из пуповинной крови после рождения, культивированный и покрытием в слайды, содержащий матрицу базальной мембраны, где они прошли vasculogenesis. Образы весь слайд скважин были приобретены с помощью покадровой Фазово-контрастная микроскопия более 15 часов. Изображения были проанализированы для получения количественных данных, с помощью анализа программного обеспечения под названием кинетический анализ Vasculogenesis (KAV). KAV использует сегментации изображений, а затем skeletonization для анализа сетевых компонентов из штабеля Multi-времени точки Фаза контрастность изображения для получения 10 параметров (9 измеряется, 1 рассчитывается) структуры сети, в том числе: закрытые сети, области сети, узлы, филиалов, общее отделение, средняя филиал, тройной разветвленной узлы, квад разветвленные узлы, сетевых структур, длины и ветви узел соотношение. Применение настоящего Протокола определены изменены ставки vasculogenesis в ECFCs, полученные от беременности, осложненной сахарный диабет. Однако этот метод имеет широкие последствия рамки сообщили здесь. Реализация этого подхода повысит механистический оценки и улучшения функционального показаний vasculogenesis и другими биологически важных ветвящихся процессов в многочисленных типов клеток или болезни государства.
Introduction
Способность клеток эндотелия прародитель пройти vasculogenesis, или de novo формирования судна, имеет решающее значение в создании эмбриональных сосудистую во время развития1. Кроме того дальнейшие судно формирования и созревания существующих судов, который известен как ангиогенез, является также ключевым процессом в развитии и в послеродовой период жизни для поддержания потока крови и гомеостаза во всем теле2. Каждый орган в теле зависит от сосудистой системы для доставки кислорода и питательных веществ, а также для удаления отходов3. Если не поддерживается сосудистый гомеостаз, таким образом, чтобы формирование кровеносных сосудов и ремонт либо недостаточными или в избытке, сосудистые заболевания может привести4. Таким образом сосудистые образования и адаптации часто изучаются, как они имеют важное значение в поддержании здоровья органа и вовлечены в развитие многочисленных патологического государств.
Благодаря более глубокому пониманию деятельности сердечно-сосудистой системы в процессе развития, а также проявление болезни и прогрессии, анализы были разработаны модели vasculogenesis и ангиогенеза в пробирке и в естественных условиях5 6, ,7. Моделирование формирования судна включает в себя покрытие сосудистой клеток, таких как эндотелиальные клетки, в матрице базальной мембраны, что способствует организации клеток и формирования судна сети8,9,10. Как правило ниже ночь инкубации, изображения ячейки сети записываются в один момент, что приводит к небольшое количество изображений для анализа11,12,13. Таким образом аналитические подходы во многом разработаны и оптимизированы для один время точки оценки10,14. Тем не менее статический анализ просто недостаточно захвата динамический процесс формирования судна и предоставляют ограниченное понимание потенциальных механизмов. Хотя изображения чаще скорее всего обеспечит необходимые данные для идентификации формирования кинетики, неэффективным и труда интенсивного14бы применение разработанной ранее аналитики Multi-времени точки визуализации подход. Кроме того несмотря на развитие коммерчески доступных анализов, сбор оплаты за изображения делает этот вариант непомерно кинетических исследований, в которых тысячи изображений, созданных15. Таким образом существует потребность в поле рациональный и эффективный подход к сбора и количественной оценки vasculogenesis в пробирке, в том числе возможность анализировать большое изображение наборов, сформированных по микроскопии покадровой живой клетки.
Чтобы преодолеть эти ограничения, новый подход был разработан с целью расширения один момент что изображений для включения динамической оценки vasculogenesis с изображениями приобрел каждые 15 мин16. Захватив несколько моменты времени в течение нескольких часов, этот подход обеспечивает более подробное изображение процесса vasculogenesis, а также понимание потенциальных механизмов, способствующих формирования и обслуживания судна сетей. Помимо повышения частотности и качества захвата изображений, этот подход включает в себя Роман программного обеспечения в виде открытым исходным кодом плагина17. Программное обеспечение, упоминаемый как кинетический анализ из Vasculogenesis (KAV), является обтекаемый приложение, которое включает в себя обработки изображений и анализа специально для больших изображений наборов, сформированных из Multi-времени точки поглощения. KAV анализирует фаза контраст изображения путем сегментации изображений, следуют skeletonization18. Десять параметров сетевой структуры количественно, KAV включая: ветви, закрытые сети, узлы, сети, сетевых структур, тройной разветвленной узлы, квад разветвленные узлы, общее отделение, средняя филиал, длины и филиал узел соотношение (см. Схема на рис. 1)16. Применение подхода KAV включает роман, рассчитанного фенотип в пробирке vasculogenesis, именуемый Филиал узел соотношение. Наши последние работы показал, что это соотношение свидетельствует о подключение к сети и может быть связан с другими клеточных процессов, участвующих в формировании сети, такие как подвижность16.
Хотя в этих исследованиях оценивали плода эндотелиальной колонии, образуя vasculogenesis клеток (ECFC), этот подход приобретения и анализ изображений может применяться для оценки любых типов клеток, которые проходят vasculogenesis или ангиогенеза легко. Кроме того этот подход может использоваться для определения измененных сосудистой функции, вытекающие из различных патологических государств, таких как гестационный сахарный диабет, как показано в этих исследованиях. Кроме того этот метод может быть адаптирована к оценить формирование сети и ветвления, которые важны для других биологически соответствующих процессов. Таким образом потенциальное воздействие применения этот новаторский подход к уникальным биологических систем является еще предстоит определить.
Protocol
1. Подготовка
-
Формирование культуры эндотелиальной колонии клеток (ECFCs)
Примечание: Плода ECFC образцы, используемые в этих экспериментов были изолированы от человеческой пуповинной крови и культивировали BioCore ангио (ABC) в школе медицины университета Индианы как описано6. Фенотипирование рутинной контроль качества был проведен в рамках ABC для подтверждения выражение эндотелиальной антигены как описано19,,2021. Образцы, используемые в экспериментах были пассированной минимально (2 - 3 раза). Все культуры ткани работа была выполнена в культуре ткани капюшоном. Все реагенты, включая культуры ткани пластины и решения, были стерильные.- За два дня до эксперимента, пальто 100 мм круглые пластины культуры ткани с 6 мл 0,05 мг/мл тип 1 коллагена, и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
Примечание: Тип 1 коллагена разбавляется в двойной дистиллированной воды, содержащей 20 Нм уксусной кислоты к рабочей концентрации 0,05 мг/мл. - За день до эксперимента, trypsinize и replate ECFCs на 1 коллагена покрытием плиты типа в 1.1.1. (См. Примечание под 1.1).
- Trypsinize ECFCs, аспирационная СМИ от покрытием клеток и мыть с 7 мл ФСБ. Аспирационная PBS, затем добавить 2-3 мл 0,5% трипсина и инкубации клеток для 2-5 минут при 37 ° C.
- Сразу же после инкубации с трипсином, добавить 3 мл EGM2 и пипетки вверх и вниз, чтобы выбить всех адэрентных клеток. Суспензию клеток передавать 15 мл Конические трубки.
- Центрифугуйте образцы всех на 500 g x 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная супернатант и вновь приостановить гранулы клеток в 1-2 мл EGM2. Тщательно перемешать суспензию клеток и снять небольшой Алиготе (20-40 мкл) для подсчета.
- Добавление равных частей Трипановый синий аликвота ячейку и Пипетка 10 мкл на Горяева. Подсчитать количество ячеек в четырех основных квадрантов Горяева.
Примечание: Используйте обе стороны Горяева для всех выборок для повышения точности. - Вымойте коллаген покрытием культуры ткани пластины, которые были подготовлены в шаге 1.1.1, дважды с 7 мл ФСБ. После аспирационных второй мыть PBS, добавляют 10 мл эндотелиальной роста среднего 2 (EGM2) культуры СМИ, дополнена плода бычьим сывороточным 10% к пластинам.
- С использованием клеток, полученных на шаге 1.1.7, рассчитайте объем суспензии клеток, необходимых для клеток5 Клемная 4 x 10. Клемная 4 x 105 ECFCs на культуре ткани пластины подготовлен на шаге 1.1.8 и Инкубируйте на 37 ° C и 5% двуокиси углерода (CO2) на ночь.
- За два дня до эксперимента, пальто 100 мм круглые пластины культуры ткани с 6 мл 0,05 мг/мл тип 1 коллагена, и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
-
До эксперимента, хранить материалы на 4 °C ночь
- Магазин 3 "x 2" металлические плита, слайд (держать в пакете до открытых в вытяжном шкафу), ящик стерильных 20 мкл (мкл) советы и базальной мембраны матрицы (матрица).
Примечание: Матрица хранится при температуре-80 ° C для длительного хранения; всегда оттепель его на 4 ° C на ночь или на несколько часов перед использованием.
- Магазин 3 "x 2" металлические плита, слайд (держать в пакете до открытых в вытяжном шкафу), ящик стерильных 20 мкл (мкл) советы и базальной мембраны матрицы (матрица).
- Подтверждение наличия достаточного пространства для изображений на жестких дисках компьютера.
Примечание: С помощью конфигурации, изложенные в настоящем Протоколе, приблизительно 60 гигабайт (ГБ) пространства необходимы за эксперимент (4 ГБ/а). Однако пространство оценки основаны на конфигурации оборудования и должны быть определены для каждой системы.
2. Протокол 1: Экспериментальная установка: подготовка слайд
-
Собрать и подготовить материалы
- В день эксперимента, собирайте материалы для обшивки клетки на слайде, включая ведро льда, небольшой контейнер сухого льда, ножницы и 20 мкл пипетки. Спрей все элементы с 70% этиловом спирте, протрите насухо бумажным полотенцем и поместить элементы в стерильных культуры ткани капюшоном.
- Собрать все материалы, хранить при 4 ° C (см. шаг 1.2) включая металлическую пластину, окно подсказки, слайд и матрицы. Спрей поле подсказки с 70% этанола и поместите поле в контейнере сухого льда.
Примечание: удаление матрица от 4 ° C холодильник только тогда, когда он готов использовать и всегда держать матрицы на льду. - Спрей металлическую пластину с 70% этанола и вставлять его в лед в ведро льда. Откройте пакет, содержащий слайд и место слайда на металлической табличке, чтобы держать холодно.
-
Загрузка матрицы на слайд
- Установите дозатор 10 мкл и удалите наконечник из холодных кончик коробки с пипеткой. Сократить около 1 см от конца кончик с ножницами.
Примечание: отрезок перпендикулярно оконечности сократить пузыри в матрице. Дозатор может быть присвоено тома немного больше, чем 10 мкл для учета матричные, прилипания внутрь кончиком. - Медленно нарисуйте матрицы в наконечник пипетки. Сразу же место кончике пипетку в центре скважины. Нежно коснуться наконечник пипетки в нижней части скважины и постепенно вытесняет матрицы.
Примечание: у вас не через пипетку, как это вызовет пузыри форме. Если пузырь формы, поп немедленно с помощью небольшая заметка. - Слайд содержит 15 отдельных скважин. Повторите предыдущий шаг для каждой скважины. Используйте новый наконечник пипетки для каждой скважины для поддержания согласованности и сокращения матрица застывающих внутри кончик.
- Как только слайд загружается с всех скважин, содержащий матрицу, нажмите крышку всю дорогу на слайд и инкубировать при 37 ° C за 30-60 мин до матрицы застывает.
Примечание: Не позволяйте матрица высохнуть. Добавьте небольшой объем (2-3 мл) PBS в кепке 50 мл конические вблизи слайд в инкубаторе для снижения риска матрицу сушильной.
- Установите дозатор 10 мкл и удалите наконечник из холодных кончик коробки с пипеткой. Сократить около 1 см от конца кончик с ножницами.
3. Протокол 2: Покрытие ECFCs на матрице
-
Удаление сторонник ECFCs из культуры ткани пластины и собирать в подвеска
- Получение культуры ткани, которую пластины, содержащие ECFCs покрытием за предыдущий день (см. раздел 1.1.9). Аспирационная EGM2 СМИ и мыть сторонник ECFCs раз с 7 мл ФСБ.
- Аспирационная PBS, добавить 2-3 мл трипсина и инкубировать адэрентных клеток для 2-5 минут при 37 ° C.
- Сразу же после инкубации, добавить 3 мл EGM2 и пипетки вверх и вниз, чтобы выбить всех адэрентных клеток. Суспензию клеток передавать 15 мл Конические трубки.
- Повторите шаги 3.1.1-3.1.3 для остальных трех образцов ECFC, до тех пор, пока все четыре ячейки образцы собираются в суспензии.
-
Подготовка мастер смеси
- Центрифугуйте образцы всех на 500 g x 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная супернатант и вновь приостановить гранулы клеток в 1-2 мл EGM2.
- Тщательно перемешать суспензию клеток и снять небольшой Алиготе (20-40 мкл) для подсчета.
- Добавление равных частей Трипановый синий аликвота ячейку и Пипетка 10 мкл на Горяева. Подсчитать количество ячеек в четырех основных квадрантов Горяева.
Примечание: Используйте обе стороны Горяева для всех выборок для повышения точности. - С помощью метода ячейки подсчитывает сверху, рассчитать объем каждой ячейки выборки, содержащий 1.4x104 клетки. Тщательно перемешать все клеточных суспензий и аликвота 1.4 x 104 клетки в свежий трубку подготовить мастер смесь для каждого экспериментальные условия. Добавьте EGM2 СМИ, так что окончательный объем каждого мастер смеси составляет 175 мкл.
- Mix каждый мастер смесь осторожно дозирования и аликвота 50 мкл мастер смеси в индивидуальные добра на слайде.
Примечание: все образцы в трех экземплярах, покрыты мастер смеси рассчитывается для 3.5 скважин для обеспечения достаточного объема для 3 скважины.
-
Инкубировать слайд
- Инкубируйте слайд при 37 ° C, до тех пор, пока он может быть помещено в камеру микроскоп для воображения.
Примечание: Время между обшивкой и изображений должно быть максимально ограничить потери данных на ранних этапах vasculogenesis.
- Инкубируйте слайд при 37 ° C, до тех пор, пока он может быть помещено в камеру микроскоп для воображения.
4. Протокол 3: Микроскоп Setup и захвата изображений
Примечание: Для нашего исследования, протоколы 2 и 3 были проведены одновременно отдельных лиц. Если протоколы 2 и 3 должны быть завершены к тем же лицом, протокол 3 шаги 4.1 и 4.2 ниже должна быть завершена до начала протокол 2 выше.
-
Включите компьютер и Микроскоп
- Примерно один-два часа до начала эксперимента, включите и Разогрейте стадии Топ инкубатора до 37 ° C, установите CO2 на 5% и установить влажность до 85%. Заполните инкубатор влажность водохранилище, если последовательность пуста.
- Пустой камерных слайд в одном из двух открытых позиций и заполнить с дистиллированной водой. Обеспечение обратной связи термометр для контроля температуры камеры, если таковые имеются.
Примечание: Если термометр обратной связи, использовать это «инкубатор температуры» чтобы убедиться, что камера достижение равновесного уровня. - Включите вентилятором вторичного, равным 39-42 ° C тепла слайды ниже и свести к минимуму конденсации.
- Добавьте второй слайд как пустой, пока экспериментальный слайдов могут быть добавлены. Этот слайд служит местоположение заполнитель для конфигурации параметров приобретения изображения для отдельных скважин во время установки.
- Добавьте воды в водохранилище, окружающих скважин на втором слайде для имитации условий во время визуализации эксперимента. Воды, окружающие скважин позволяет оценки влажности во время установки микроскопа и подогрева.
Примечание: Перед уравновешивания инкубатора этап Топ и среднего воздуходувка имеет решающее значение для поддержания стабильных условий культивирования. Большинство контроллеров живой клетки камеры реального времени обратной температуры, CO,2и влажности воздуха для оценки готовности системы. Перед продолжением, проверьте накопление влажности на слайде и чрезмерного высыхания водохранилища как заполнить 4.1.5. Влажность может потребоваться скорректировать, если есть чрезмерного высыхания или конденсата в камере. Чтобы увеличить влажность, добавьте салфетки, смоченные дистиллированной водой. Для уменьшения конденсации, уменьшить значение влажности, скорректированные в 4.1.1 или как конденсации может быть признаком низкой температуры, проверьте настройки температуры камеры и позиционирования вторичных воздуходувки.
-
Настройте параметры приобретения основного изображения во время уравновешивания.
Примечание: изображение приобретение настраивается с помощью программного обеспечения, которое управляет стадии, затвора и камеры. Средство многомерные установки является самым простым способом настройки программного обеспечения. Кроме того программное обеспечение будет нужно иметь автофокус процедуры для обеспечения контроля фокус за продолжительность эксперимента.- Используйте программное обеспечение для установки нескольких стадии позиции для каждой скважины. Для этого протокол выберите центр скважин.
- Настройте образ приобретения таким образом, чтобы на каждой стадии позиции, все хорошо это образы. Например используйте tilescan с 10-20% изображение перекрытия и примерно 5 х 5 полей, зависящ на камеру и окончательное увеличение.
- Настройте промежуток времени для визуализации каждые 15 мин.
Примечание: С помощью конфигурации, изложенные в настоящем Протоколе, все 15 скважин слайда отражаются в течение 15 мин.
-
Загрузить экспериментальной слайд
- После уравновешивания палаты инкубатора замените пустой слайд экспериментальной слайд.
Примечание: уравновешенной палата будет иметь стабильную температуру, CO2и влажности для по крайней мере 20 мин. После того, как экспериментальный слайд готов, важно, что шаги завершены быстро свести к минимуму «мертвых время» между покрытием и точкой начальное время, захвачен в Микроскоп. Кроме того для облегчения сопоставления между изображений эксперименты, это время должно быть последовательным. В этих экспериментах все шаги, описанные в протокол 3 раздел 4.3 требуется около 30 минут для завершения. - Удалить слайд крышка и добавьте воду в резервуар, окружающих скважин на слайде.
Примечание: Крышку на время визуализации эксперимента.
- После уравновешивания палаты инкубатора замените пустой слайд экспериментальной слайд.
-
Настройка параметров приобретение окончательное изображение
- Цель плана Fluor DL CFI 10 X в позиции и выберите Ph1 фазы кольцо на конденсаторе. С первой скважины в фокусе настроить на diascopic пути света для освещения Кёлер и настройте фазу оптика путем проверки выравнивания этапа кольца в конденсаторе с маской цель этапа.
- Настройте время экспозиции и отрегулировать интенсивность лампы для фазового контраста, которая обычно меньше, чем 500 мс.
- Цикл через каждый этап позиции в 4.2.1 и убедитесь, что центр также выбрана и настроить его, при необходимости.
- На каждой стадии позиции фокус на клетки покрытием в колодец и установить сцену положение z положение используется для изображений в программном обеспечении.
- Проверьте механизм автофокусировки для микроскопа. Если автофокусировки аппаратное, обеспечить это на и правильно установлен на все стадии должности.
Примечание: как образец и стадии может дрейф по вертикали во время эксперимента, важно, что программного обеспечения проверить автофокусом на каждой стадии позиции и каждый момент времени для обеспечения надежной изображений во время курса. Если возможно позиция автофокусом, определено в предыдущем этапе следует использовать как отправную точку для последующего автофокусом рутины. Таким образом, продолжается дрейф может настраиваться для легко. - Уменьшить или потушить свет в комнате микроскоп и начать изображений эксперимент.
5. Протокол 4: Изображения обработки и кинетический анализ Vasculogenesis (KAV)
-
Сохранение изображений из отдельных временных точек в стек изображений для каждой скважины
Примечание: большинство программного обеспечения для захвата изображений можно экспортировать многостраничных ссоры (штабеля) рядов. KAV предназначен для работы на наборы данных, которые могут включать несколько моментов времени. Таким образом анализ происходит в стеке всего изображения для данного этапа позиции. При необходимости, обработки изображений программное обеспечение можно импортировать отдельные изображения из каждой точки время восстановить стек изображений. - Откройте изображение, обработки программного обеспечения на компьютере
-
Добавление обработки изображений программное обеспечение KAV
- Перетащите KAV файл из папки в серой панели в нижней части окна программного обеспечения. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы добавить программу в список.
-
Откройте стек изображений для анализа
- Нажмите кнопку «файл», затем «Open» через в раскрывающемся меню обработки изображений программное обеспечение, или перетащить файл изображения в сером как шаг 5.3.1.
- Преобразуйте изображения в 8 бит, нажав «Изображения», «Тип», '8 bit».
-
Создайте область интереса (ROI)
- Откройте диспетчер ROI, нажав на «Analyze» в панели инструментов. Затем выберите «Инструменты» следуют ' ROI диспетчером '.
- Создайте новый ROI, нажав на инструменты выделения круг или прямоугольник на панели инструментов и рисунок желаемого выбора области на изображении. Нажмите кнопку «Add» в окне менеджера ROI, чтобы сохранить эту форму.
Примечание: Ранее созданный ROI может открываться путем перетаскивания спас трансформирования (сжатые папки) в «Перетаскивание» панель, чтобы открыть в диспетчере. - Нажмите на метку ROI, перечисленные в менеджере ROI для его просмотра на изображении.
Примечание: Если ROI не появится на изображении, создайте второй ROI (любой размер/форма) и добавить его в менеджере. После того как оба ROIs появляются в списке, нажмите кнопку взад и вперед между двумя и желаемой рентабельности появится на изображении. - Совместите ROI, если необходимо. Как только ROI в место на изображении в нужном месте, перейдите в меню и нажмите «Изменить» тогда «Ясно вне». Это удалит данные изображения за пределами ROI (полезно для непрямоугольной формы) для каждого изображения в стеке.
Примечание: Вы также можете нажать на «Образ» и «Урожай», если вы используете rectangularly формы ROI.
-
Запуск программного обеспечения KAV
- Нажмите кнопку «Plug-ins» в строке меню.
- Выберите «Анализировать сети» плагин. Это откроет окно с параметрами, чтобы изменить настройки плагина.
- Измените метод бинаризация, используя стрелку раскрывающегося.
- После того, как выбраны все соответствующие параметры, нажмите кнопку «OK», чтобы начать программное обеспечение обработки.
Примечание: Соответствующие параметры определяются путем визуализации скелета и маска представлений, порожденных KAV, которые свидетельствуют о точности программного обеспечения для выявления и распознавать клетки и сетей от фона в фазе контраст изображения.
-
Сохранить данные, генерируемые KAV
- После того, как подключаемый модуль завершил анализ, два окна появится на экране, включая таблицы данных с числовыми значениями и стек плавленого изображений с изображением скелета и маска представлений.
- Сохраните численные значения путем перехода в верхний левый угол таблицы данных и нажав кнопку «изменить», затем «Copy» или «Cut», чтобы вставить значения в таблицу excel.
- Нажмите на расплавленный скелета и маска изображение. Сохранить плавленого скелет/маска стек изображений в формате Tagged Image File Format (TIFF), нажав кнопку «Файл» «Сохранить как», «TIFF».
- Сохранить обрезанное фазового контраста изображения стека (созданное с помощью ROI), нажав кнопку «Файл,» «Сохранить как», «TIFF.»
- Нажмите на окно ROI менеджера и выберите ROI, используемый для обрезки изображения. Нажмите «Больше» следуют «Сохранить», чтобы сохранить рентабельность инвестиций для будущего использования.
Примечание: Использование же ROI поможет поддерживать согласованность на уровне анализа.
Representative Results
KAV производит визуальные представления структуры сети
Контраст между ECFCs и матрица фон в фазе контрастность изображения позволяет KAV для выявления клеток конкретных структур. ECFC сетей, выявленные KAV представлены графически, как скелет и маска представлений для иллюстрации структуры используется программное обеспечение для количественной оценки(Рисунок 2). Главное качественной оценки скелета и маска представлений позволяет быстро идентифицировать KAV чувствительность и точность, которые могут быть полезны в определении оптимального порогового значения параметров и интерпретации результатов анализа. Когда качество фазы контрастность изображения является высоким и достаточного контраста достигается, KAV точно определяет ECFC сетей, как отмечал сходство между фазы контраст изображения и генерируемые KAV скелета и маска представлений (Рисунок 2 Видео 1и A ).
В качестве альтернативы если этап контрастность изображения не имеют высокой контрастности и/или артефакты изображения, такие как координатной привязки происходят, уменьшается точность обнаружения сети и результаты стали неоднозначным (рис. 2B). Кроме того формирование воздушных пузырьков в пределах ячейки СМИ также могут скрывать точность обнаружения (рис. 2). Однако проблемы с качеством изображения, часто могут быть преодолены подборку ограничивание различных методов, включенных в KAV программного обеспечения. Например этап контраст изображения в Рисунок 2B была проанализирована с помощью параметров обработки идентичные изображения за исключением метода Бинаризация. От скелета и маска представлений очевидно, что порог Оцу привела к более точного обнаружения сетей ECFC, показано в фазе контраст изображения (рис. 2B). Таким образом качество изображения имеет решающее значение для достижения точного и значимых результатов в этот assay. Однако различные Бинаризация методы, включенные в пользовательском интерфейсе KAV позволяют перестройки анализа изображений, основанный на качество входного изображения.
Покадровой микроскопии определяет качественные и количественные различия в ECFC vasculogenesis после воздействия внутриматочная Гестационный сахарный диабет
Недавно KAV аналитический подход был применен для оценки плода ECFC функции после воздействия материнской тип 2 диабет (T2DM) в утробе матери16. С помощью KAV, изменены кинетика vasculogenesis были определены в плода ECFCs, подвергается T2DM. Однако помимо T2DM воздействия, которое происходит на протяжении всей беременности, Гестационный сахарный диабет (GDM) или развитие нетерпимости глюкозы обычно в третьем триместре беременности, также препятствует ECFC функции13. Таким образом KAV был применен для определения, если GDM-подвергаются ECFCs также отображать изменения кинетики формирования сети ECFC. Этап 1 (0-5 h) и этап 2 (5 + h) были оценены с использованием времени перерыва микроскопии в сочетании с KAV анализа (рис. 3). Представитель этап контрастность изображения приобрел в начале захвата изображений (0,50 h) и на протяжении времени (5.00 и 10.00 h) изображают ECFC формирование сети в четырех образцов от один экспериментальный день (рис. 3 и видео 1 ). Несмотря на эквивалентные клеток, загрузки, как отмечено в фазе контрастность изображения в 0,50 м качественные различия в структуре сети очевидны в точках 5.00 и 10.00-час времени. ECFCs с неосложненной беременности (UC) образуют сеть, сложных и запутанных 5 часов после обшивки, похож на наших ранее опубликованных данных16. И наоборот ECFCs из GDM образец 1 (GDM1) формы, очень немногие сетевых структур, которые не связаны. Однако этот шаблон не отражается во всех ECFC образцах, полученных от GDM беременностей, свидетельствует о неоднородности между выборками. Образцы GDM2 и GDM3 отображения более формирование сети по сравнению с GDM1, хотя модели подключения изменены по сравнению с UC образца. Главное KAV меры несколько структурных компонентов ECFC сетей для выявления как очевидные, так и тонкие фенотипов.
В дополнение к генерации скелета и маска представления структуры сети, KAV quantitates десять показателей сетевой структуры, включая количество отдельных сетевых структур, узлы, тройной разветвленной узлы, узлы четырехместные ветвлению, ветви, всего филиал, средняя филиал, филиал узел соотношение, всего закрытые сети, длины и сети области16. KAV компилирует данные для каждого образца в одну таблицу значений для всех изображений время курса. Таблица 1 содержит представитель необработанные данные из одного исследования изображений для одного ECFC образца. Параметры сетевой структуры, измеряется KAV организованы в столбцы и данные для последовательных изображений, приобретенных за время организованы в строки. Например, в наших исследованиях, изображение 1 было получено 30 мин после покрытия с последующим изображениями, людей собираются каждые 15 мин необработанные значения, генерируемые KAV может затем быть графике или далее проанализированы с использованием более сложных статистических подходов к16.
Для одного неосложненной образца (UC) и трех образцов GDM (рис. 4) указаны пять графиков, изображающих средние значения сетевой структуры из трех отдельных экспериментов. UC образца в этих экспериментах, выполняется аналогично к ранее проанализированы UC образцы16. Ранее было определено, что ECFC vasculogenesis в пробирке Би фазовые, состоящий из этапа 1 (0 - 5 h) и этап 2 (5-10 h)16. Этот шаблон соответствует в текущих исследованиях, что подтверждается на графике с изображением закрытой сети данных (Рисунок 4). В образце UC сформировал большее количество закрытых сетей, по сравнению с всех трех образцов GDM. Интересно, что три из четырех образцов, как представляется, подобные время максимальное количество закрытых сетей, которое происходит между 2,5 и 3 часа. Однако GDM2 образец был медленнее, для достижения максимальной закрытых сетей, имевших место 5 часов после покрытия. И, несмотря на GDM2 образца, образуя меньше максимальной сетей, по сравнению с UC образца, сетей, к которым он образует поддерживались аналогично UC образца с течением времени. И наоборот GDM1 и GDM3, который меньше по сравнению с UC пример сети, также выставлены общее сокращение числа сети с течением времени. В целом от графа, изображающие номер закрытой сети, очевидно, что все образцы ECFC отображается шаблон Би фазовые формирования сети, однако скорость образования и максимальное количество сетей достигнуто различаются между образцами.
Сети представляет собой средняя площадь в пределах закрытой сети, образованной ECFCs. Поэтому чем больше закрытой сети номер, тем меньше сети области. Этот шаблон отражается в сети области графики, где UC образца, который сформировал большее количество закрытых сетей, имел меньшие площади сети с течением времени, по сравнению с трех образцов GDM (рис. 4). GDM2, который достиг максимального закрытых сетей более медленно, выставлены высокой сетевой области первоначально, однако области стабилизировалась со временем и это был наиболее близок к UC образца в 15 часов. Со временем средняя сети во всех пробах возросло благодаря сети де стабилизации. Однако некоторые образцы, такие как GDM1 и GDM3, выставлены более быстрый рост в области сети, которая, вероятно, свидетельствует о снижение стабильности, по сравнению с другими образцов экспонируется более постепенный рост.
GDM-воздействию ECFCs демонстрируют сокращение сети стабильность
Доля филиалов к узлам Роман фенотип рассчитывается путем KAV и определены в ходе наших предыдущих исследований, и это свидетельствует о сети подключение16. В текущем исследовании UC образец был низкий коэффициент, который представляет высокий уровень сетевого подключения, который был сохранен во времени (рис. 4). И наоборот три GDM образцы имели более высокий коэффициент филиалов в узлы, особенно в фазе 2 формирования сети. Это наблюдение демонстрирует снижение подключения и де стабилизации сетевых структур.
В целом GDM1 сформировал меньше узлов и ветвей, по сравнению с других образцов, с сокращением поддерживали в течение эксперимента. GDM2 и GDM3 создана и поддерживается большее количество филиалов, по сравнению с UC образца, особенно между 5-15 h. Количество узлов, обнаруженных в сети GDM2 и GDM3 были больше похожи на количество узлов в образце UC, особенно между 10-15 часов. Большее количество филиалов, но такое же количество узлов, можно объяснить повышенной ветви узел соотношение очевидным в позднее время точках в образцах GDM. Важно отметить, что одновременные изменения в отрасли и узел номер может быть трудно интерпретировать в отдельных графиков. Однако Роман филиал узел соотношение предлагает способ оценить, каким образом изменений, включая незначительные изменения трудно обнаружить в отдельных графах, в номер филиала и узла, результатом изменения сетевого подключения.
Рисунок 1 : Схема изложением 10 параметров, количественно, кинетический анализ Vasculogenesis (KAV). KAV quantitates десять различных параметров сетевой структуры. Все параметры являются цветом и изложенные в схеме численно (1-10). Параметры включают количество сетей филиалов (зеленый, 1), закрыт (синий, 2), и узлы (красный, 3), средняя площадь сети (оранжевый, 4), число сетевых структур (черный, 5), тройной разветвленной узлов (желтый, 6) и quad разветвленные узлов (фиолетовый, 7), а также всего (9) и средней длины (10) филиала и соотношение числа филиалов на количество узлов (10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Кинетический анализ Vasculogenesis (KAV) quantitates структуры сети. (A) скелет и маска представлений сетевых структур, выявленные с помощью этапа контрастность изображения обеспечивают визуальное представление сетевых структур выявлять и количественно KAV KAV. Шкалы бар = 500 мкм. (B) контраст изображения представительный этап ECFC сетей 10 h после покрытия, что имеет низкий контраст и сетки знаков от сшивая отдельных изображений. Бинаризация различные методы, такие как среднее или Оцу, могут быть выбраны в KAV плагин для улучшения точности количественный, если этап контраст изображения имеют низкий контраст или возникновении координатной привязки. Скелета и маска представлений фазы контраст изображения отображаются как среднее, так и Оцу Бинаризация методы. Фаза контрастность изображения были захвачены с использованием 10 X цель. Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : GDM внутриутробного облучения изменяет формирование сети ECFC. Изображения ECFC формирование сети были захвачены с интервалом 15 минут 15 h фазово-контрастной микроскопии. Представитель этап контрастность изображения с шагом 5 h, начиная в момент покрытие (0,5 ч), показаны для UC и трех образцов GDM. Фаза контрастность изображения были захвачены с использованием 10 X цель. Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : ECFCs, подвергается внутриматочная GDM экспонат изменены сети формирования кинетики. ECFCs были получены из неосложненной беременности (UC, черный) и три беременности, осложненной Гестационный сахарный диабет (GDM 1-3, красный). Фаза контрастность изображения были захвачены на 15 мин интервалы для 15 h. кинетический анализ Vasculogenesis (KAV) программного обеспечения предел закрытые сети, сети, ветви, узлы и соотношение ветвей к узлам. Иллюстрированный данные представляют собой среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего (SEM) три отдельных экспериментов для каждого образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: GDM внутриутробного облучения изменяет кинетики формирования сети ECFC. Изображения ECFC формирование сети были захвачены с интервалом 15 минут 15 h фазово-контрастной микроскопии. Фаза контрастность изображения показываются для UC и три GDM образцы свыше 15 h, начиная с 0,5 ч. Линейки шкалы представляет 500 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
| Изображение | Общая филиальных сетей | Узлы | Трехместные номера | Четырехместные номера | Филиалы | Длина общая филиал * | AVG филиал длина * | Филиал в узел соотношение | Закрытые сети | Зона сети ** |
| 1 | 382 | 290 | 278 | 11 | 943 | 47210 | 124 | 3.25 | 9 | 480214 |
| 2 | 284 | 345 | 337 | 8 | 940 | 50699 | 179 | 2.72 | 16 | 264469 |
| 3 | 205 | 376 | 366 | 9 | 910 | 55728 | 272 | 2.42 | 27 | 150621 |
| 4 | 162 | 422 | 407 | 15 | 947 | 59692 | 368 | 2.24 | 40 | 98713 |
| 5 | 132 | 454 | 441 | 12 | 967 | 61923 | 469 | 2.13 | 53 | 72951 |
| 6 | 122 | 435 | 419 | 14 | 907 | 62587 | 513 | 2.09 | 68 | 56948 |
| 7 | 88 | 429 | 411 | 17 | 852 | 63983 | 727 | 1.99 | 74 | 51429 |
| 8 | 68 | 451 | 437 | 13 | 874 | 63960 | 941 | 1.94 | 74 | 51780 |
| 9 | 93 | 437 | 417 | 18 | 905 | 60901 | 655 | 2.07 | 49 | 82919 |
| 10 | 126 | 511 | 487 | 24 | 1075 | 61981 | 492 | 2.1 | 37 | 116857 |
| 11 | 49 | 397 | 384 | 12 | 737 | 61823 | 1262 | 1.86 | 79 | 48805 |
| 12 | 81 | 376 | 364 | 10 | 751 | 56817 | 701 | 2 | 63 | 64431 |
| 13 | 98 | 509 | 482 | 26 | 1028 | 60799 | 620 | 2.02 | 44 | 98056 |
| 14 | 93 | 449 | 416 | 31 | 909 | 58282 | 627 | 2.02 | 45 | 94081 |
| * округляется до ближайшего мкм, ** округляется до ближайшего микрон ^ 2 | ||||||||||
Таблица 1: Представитель необработанные данные из одного изображения исследования для одного образца ECFC.
Discussion
KAV дает оценку больших наборов данных с несколькими моментами времени
Традиционно количественный vasculogenesis в пробирке включает одно или несколько измерений времени точки. Этот статический подход просто недостаточно для захвата и количественного определения динамичный и сложный процесс. Таким образом этот роман метод был разработан для включения эффективного анализа кинетики формирования сети получить представление о потенциальных молекулярных механизмов, участвующих в процессе динамической vasculogenesis. Эффективность и автоматизации являются важными компонентами в разработке новых методов для создания и анализа больших объемов данных изображений. KAV был разработан специально для анализа стеки большие изображения, состоящий из сотни изображений для уменьшения времени и труда, необходимых для получения биологически значимые выводы из покадровой наборов данных. Главное, KAV проводит обработку изображений и генерации данных в считанные секунды для малых (менее 100 изображений) изображения стеки и минут для больших (больше чем 100 изображений) стеки, что привело к беспрецедентной эффективности изображений. Кроме того организации данных в таблицы по времени и измеряемых параметров позволяет быстрого поколения графическое представление и статистического анализа.
Проблемы в успешного применения этого подхода
Хотя этот assay включает улучшения для захвата изображений и анализ, некоторые проблемы могут препятствовать успешному осуществлению. Четыре основных препятствий относятся влажность стабильности, точность сроков от обшивки для захвата изображений, программного и аппаратного обеспечения надежности и управления большие наборы данных, созданные для каждого эксперимента. Стабильные живой клетки изображений в течение нескольких часов может быть сложным. В частности надлежащие и последовательные увлажнения требуется для тепловизионных камер. Ангиогенез слайды используются в этот assay, которые предназначены для параллелизации анализов на основе матрицы ангиогенеза. Их низкий объем, примерно 50 мкл, делает испарение и конденсация существенных соображений для расширенной культуры условий. Для борьбы с этой экспериментальной проблемы, необходимо использовать инкубатор, который регулирует влажность. Однако она также может потребоваться дополнить настоящие правила в случае чрезмерного высыхания тепловизионные камеры с течением времени. Мы обнаружили, что самый простой способ увеличить влажность увеличить площадь поверхности воды в камере. Для достижения этой цели, наши протокол предлагает следующие три источники воды: второй патрон слайд заполнены с водой, которая также является, где измеряется температура инкубатора, вода в окрестности скважины на слайды и увлажненный фильтровальной бумаги или Влажные салфетки. И наоборот конденсация происходит, когда температура воздуха в комнате остывает в нижней части слайда и влажности внутри камеры конденсируется на слайды и колодцы. Это осложнение может привести к размыванию ячейки СМИ и линзирования эффект, который вмешивается фазового контраста. В этих исследованиях был свернут конденсации путем применения нагретого воздуха (39-42 ° C) на нижней части слайда.
Ключевым моментом для любой промежуток времени исследования является согласованность между эксперимент посвящения и томографии. Сроки начала изображений имеет решающее значение для интерпретации событий, ниже по течению. Для обеспечения точности времени этот assay, время между первоначального покрытия и Первая фотосъемка время точки должны жестко контролироваться. На практике этот «мертвого времени» может быть сведено к минимуму, но что более важно, он должен быть последовательным разрешить эксперименты в разные дни для сравнения. Например в этом протоколе мы ожидаем Мертвое время приблизительно 30 мин. Это может быть облегчено близость экспериментальной подготовки и визуализации объектов.
Что может показаться на первый взгляд мирской детали важны для программного обеспечения, аппаратного обеспечения стабильности и управления данными. Программное обеспечение и связанные драйверы, сетевой среды и программного обеспечения автоматизированной обновляет все влияет на стабильность программного обеспечения. Это стоит попробовать этот протокол в «всухую» для выявления узких мест и потенциальных источников проблем в связи с приобретением изображений; например проверьте установки ненадежной живой клетки, стадии, затвора и камеры надежности и институциональных информационной технологии политики на автоматизированной операционной системы и обновлений программного обеспечения.
Управление данными является постоянной задачей любых изображений эксперимента, который генерирует сотни тысяч изображений. К счастью коммерческого программного обеспечения часто проверяет наличие свободного пространства до начала эксперимента изображений. Однако этот assay включает также обработки отснятых изображений и анализ, которые можно добавить в бременем пространства жесткого диска и препятствовать визуализации эксперименты, если доступное пространство ограничено. Кроме того безопасность и стабильность компьютера невозможно, даже с аппаратные решения, такие как избыточный массив из одинаковых дисков. Таким образом стратегия по управлению данными для обеспечения места на жестких дисках компьютера для текущие эксперименты и надежный удаленный архивирования, например с ресурсом институциональных архивирования, необходим.
Стратегии для максимального качества изображения
Хотя способность KAV точно отличить ECFCs от фона матрица является надежной, чувствительность анализа зависит от качества изображения. Например если изображение имеет низкий контраст, программное обеспечение будет обнаруживать сотовых сетей с меньшей точностью (рис. 2B). Качество фазового контраста зависит от нескольких факторов, включая параметры микроскопа, используемые для захвата изображений, Загрузка матрицы и СМИ подвеска клеток во время анализа подготовка и поддержание уровней средств массовой информации в рамках скважин на протяжении всего изображения. Чтобы оптимизировать фазового контраста для этих анализов, были внесены незначительные изменения фазы кольцо выравнивания в микроскопе для улучшения контрастности. Кроме того пробоподготовка был тщательно протестированы для обеспечения равных и последовательной СМИ загрузки. Если матрица и/или СМИ, загружается в лунки сумма ниже или выше оптимального диапазона, мениска могут образовывать приводит к измененным фазового контраста. Наконец из-за малого объема жидкости в скважинах, имеет решающее значение для поддержания уровня средств массовой информации путем сведения к минимуму испарения и конденсации, как отмечалось выше. В целом оптимизация пробирного имеет решающее значение для создания контраста изображения высокого качества для анализа.
Помимо этапа контрастность качества другие факторы могут повлиять также пробирного исходов, включая загрязнение СМИ, недостатки в матрице и частицы или мусора в матрице или средств массовой информации. Загрязнение представляет собой опасность этот assay, поскольку она включает в себя изображения живых клеток в течение нескольких часов в камере микроскопии. Чтобы уменьшить риск заражения, матрица и клеток суспензий загружаются на слайд в стерильных Худ. Кроме того каждый образец обычно покрытием в дубликат или экземплярах для эксперимента, чтобы свести к минимуму риск потери данных из-за непредвиденных проблем как мусор или смешанным анализ частиц.
Пример неоднородность диски необходимо для расширения анализа чувствительности
Неоднородность наблюдается и в предыдущих исследованиях ECFCs, подвержены GDM13. Высокий уровень гетерогенности в функции клеток, наблюдаемыми в этих предположил, чтобы быть обусловлены несколькими факторами, в том числе тяжести заболевания матери, продолжительность заболевания и стиль управления, используемый для регулирования уровня глюкозы в крови. Важно отметить, что этот аналитический подход отражает динамический диапазон ECFC vasculogenesis, что делает его возможным определить фенотипические различия вследствие функциональных неоднородности в образцах из GDM беременностей. В целом использование первичных пациентов образцов, таких как те, которые используются в этих исследованиях, могут ввести больше изменчивость по сравнению с линией клеток. Больший упор делается на трансляционного исследования с участием нескольких первичных проб животных или человека с функциональной изменчивости, чувствительность анализа имеет важное значение для обнаружения и дифференцирование биологически значимых измерений и выводы. Таким образом разработка подходов как KAV будет повышение количества и качества данных порожденных в пробирке vasculogenesis и ангиогенез анализов для более надежного наблюдения и выводы. Кроме того эти данные будут способствовать будущих расследований основные молекулярные механизмы, которые способствуют измененные ECFC vasculogenesis после внутриутробного облучения GDM.
Будущего применения этого подхода
Хотя этот метод был применен для оценки плода ECFC vasculogenesis в пробирке в этих исследованиях, возможности применения этого подхода являются многочисленными. Эта техника может осуществляться легко изучить любой популяции клеток, который участвует в процессах vasculogenesis или ангиогенеза. В частности она может использоваться для изучения отдельных клеточных популяций, как было продемонстрировано в данном исследовании, но он может также применяться для систем совместного культуры. В будущем было бы полезно расширить этот подход за пределами двухмерный в vitro пробирного оценить трехмерные модели (3D). Хотя в текущей версии KAV будет недостаточно для quantitating 3D визуализации данных, аналогичным образом разработанные покадровой, несколькими параметрическими аналитический подход специально для моделей 3D или в естественных условиях будет информировать если замечания в двух измерениях в пробирке , представитель функции клеток в условиях более биологически соответствующих.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают, что Люси Миллер, Лин Эрнандес, д-р Дэвид Хаас, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), д-р Карен Pollok, Джули Мунд, Мэтью возвращаться и Эмили Симс (ангио BioCore на центре рака Симон университета Индианы) для Отличная техническая помощь в вытекающих ECFC образцов. Авторы также признают Drs. Морин а. Харрингтон, Эдвард F. Srour, Ричард н. день, Мервин C. Yoder и Маттиас а. Клаусса (Indiana University School of Medicine) для научной дискуссии, а также Дженис стены (Indiana University School of Medicine) для административная поддержка. Все изображения была исполнена в центре Индиана для микроскопии биологических, Indiana University School of Medicine. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R01 HL094725 Р30 CA82709 и U10 HD063094) и Райли Детский фонд. Кроме того эта публикация стало возможным при частичной поддержке от национального сердца, легких и крови института национальных институтов здоровья под награду # T32 HL007910.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 1495949B | |
| Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
| Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
| EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium. |
| 0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
| Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL. |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM. |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
| Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
| Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
| Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
| Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10X |
| Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
| Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
| Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
| Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
| FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298 (2011).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
- Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
- Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
- Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
- Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
- Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
- Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
- WimTube. , Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
- Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
