Summary
여기, 우리 제시 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜 및 사용 생체 외에서 vasculogenesis의 분석 단계 대조 현미경과 함께 오픈 소스 소프트웨어, Vasculogenesis의 운동 분석. 이 프로토콜은 수많은 종류의 혈관 질환 모델 실험 조건 vasculogenic 잠재력을 양적 평가에 적용할 수 있습니다.
Abstract
Vasculogenesis는 복잡 한 프로세스는 내 피 줄기와 조상 세포 드 노 보 배 형성을 받 다. Vasculogenesis의 정량적 평가 내 피 조상 세포 기능의 중앙 판독 되 고 따라서 여러 시도 생체 외에서 그리고 vivo에서 vasculogenesis 모델을 개선 되었습니다. 그러나, 표준 방법이 매우 역동적인 과정의 여러 측면을 캡처를 정적 측정 범위에 제한 됩니다. 따라서, 새로운 프로토콜을 개발의 목표는 네트워크 형성 및 안정화, quantitate로 혈관 기본 잠재적인 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하기 위하여 생체 외에서 vasculogenesis의 활동을 평가 했다 부전입니다. 이 프로토콜의 응용 프로그램은 임산부 당뇨병에 노출 되는 세포 (ECFCs)를 형성 하는 태아 내 피 식민지를 사용 하 여 설명 했다. 태아 ECFCs 출생 다음 탯 줄 혈액에서 파생 된, 교양, 되었고 지하실 멤브레인 매트릭스, 어디 그들은 받았다 vasculogenesis 포함 된 슬라이드에 도금. 전체 슬라이드 웰 스의 이미지는 15 시간 이상 경과 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 인수 했다. 이미지는 키네틱 Vasculogenesis 분석 (KAV) 라는 분석 소프트웨어를 사용 하 여 양적 데이터의 유래에 대 한 분석 했다. KAV 이미지 세분화 뒤에 skeletonization를 사용 하 여 네트워크 구조 등의 (9 측정, 계산 1) 10 매개 변수를 파생 다중 시간 포인트 단계 대조 이미지의 더미에서 네트워크 구성 요소를 분석: 네트워크, 네트워크 영역, 폐쇄 노드, 지점, 지점 총 길이, 평균 분기 길이, 트리플 분기 노드, 쿼드 분기 노드, 네트워크 구조, 및 노드 비율에 분기 식별이 프로토콜의 응용 프로그램에서 임신 당뇨병 mellitus에 의해 복잡 하 게 얻은 ECFCs에서 vasculogenesis의 속도 변경. 그러나,이 기술은 범위 여기에서 보고 된 광범위 한 의미를 갖는다. 이 방법의 구현 기계적 평가 강화 하 고 vasculogenesis 및 많은 세포 유형 또는 질병 상태에 다른 생물학으로 중요 한 분기 프로세스의 기능 정보를 향상 시킬 것입니다.
Introduction
Vasculogenesis, 또는 드 노 보 배 형성을 내 피 조상 세포의 능력 개발1동안 배아 맥 관 구조를 수립에 중요 하다. 또한, 추가 혈관 형성 및 기존 혈관의 신생으로 알려져 있다, 성숙 핵심 프로세스 개발 및 혈액 흐름 및 본문2통해 항상성 유지 하기 위해 출생 후 생활도입니다. 신체의 모든 장기는 산소와 영양분의 전달 및 폐기물3의 제거에 대 한 혈관 시스템에 의존 합니다. 혈관 항상성 유지 되지 않으면 혈관 형성 및 수리는 부족 또는 초과에서 되도록, 혈관 질병4를 발생할 수 있습니다. 따라서, 혈관 형성 및 적응은 일반적으로 공부, 장기 건강의 유지에 필수적인 고 수많은 pathologic 국가 개발에 연루.
때문에 혈관 시스템 개발, 뿐만 아니라 질병 징후 및 진행의 참여의 증가 이해, 분석 모델 vasculogenesis 신생 시험관 및 생체 내에5 개발 되었습니다. ,,67. 선박 대형 모델링 혈관 세포, 내 피 세포, 세포 조직과 선박 네트워크8,,910의 형성을 촉진 하는 지하실 멤브레인 매트릭스에서 등을 도금 하는 작업이 포함 됩니다. 일반적으로, 다음 하룻밤 부 화, 네트워크 분석11,,1213에 대 한 이미지의 작은 숫자의 결과로 한 번 시점 캡처됩니다 셀의 이미지. 따라서, 분석 접근은 크게 개발 되었고 단일 시간 포인트 평가10,14에 대 한 최적화. 그러나, 정적 분석 캡처 혈관 형성의 역동적인 과정에서 단순히 충분 하지 않습니다 하 고 관련 된 잠재적인 메커니즘에 제한 된 통찰력을 제공. 영상 주파수 증가 가능성이 필요한 데이터 형성 속도를 제공, 비록 이미징 접근 시간 다중 포인트에 이전 개발된 분석의 응용 비효율적이 고 노동 집약적인14것입니다. 또한, 상업적으로 사용할 수 있는 분석의 개발에 불구 하 고 수수료를 지불-당-이미지 렌더링이 옵션 운동 연구는 이미지의 수천 있는 생성된15비용 금지 합니다. 따라서, vasculogenesis에서 생체 외에서시간 경과 라이브 셀 현미경 검사 법에 의해 생성 된 큰 이미지 세트를 분석 하는 능력을 포함 하 여 계량을 간소 하 고 효율적인 접근을 위한 분야에 필요가 하다.
이러한 한계를 극복 하기 위해 새로운 접근 방법은 이미지와 함께 vasculogenesis의 동적 평가 가능 하 게 하는 영상 취득 모든 15 분16시간 포인트 확대의 목적으로 개발 되었다. 몇 시간 동안 여러 시간 포인트를 포착 하 여이 방법은 vasculogenesis, 잠재적인 메커니즘 형성 및 선박 네트워크의 유지 관리에 기여에 대 한 통찰력의 과정의 자세한 묘사를 제공 합니다. 주파수 및 이미지 수집의 품질을 개선 하는 것 외에도이 방법은 오픈 소스 플러그인17의 형태로 소설 소프트웨어가 통합 됩니다. 로 운동 분석의 Vasculogenesis (KAV), 불리는 소프트웨어 이미지 처리 및 다중 시간 포인트 인수에서 생성 된 큰 이미지 세트를 위해 특별히 분석을 통합 하는 효율적인된 응용 프로그램입니다. KAV는 skeletonization18다음 이미지 세분화를 통해 단계 대조 이미지를 분석 합니다. 네트워크 구조의 10 개의 매개 변수는 KAV에 의해 계량 등: 분기, 폐쇄 된 네트워크, 노드, 네트워크 영역, 네트워크 구조, 트리플 분기 노드, 쿼드 분기 노드, 총 분기 길이, 평균 분기 길이 및 노드 비율 (참조 지점 그림 1에 도식)16. KAV 접근의 응용 생체 외에서 vasculogenesis, 노드 비율을 지점으로의 소설, 계산 된 형을 포함 한다. 우리의 최근 작품 시연이 비율은 네트워크 연결의 지표 이며 운동 성16등 네트워크 형성에 관련 된 다른 세포질 과정에 연관 될 수 있습니다.
셀 (ECFC) vasculogenesis를 형성 하는 태아 내 피 식민지는 이러한 연구에 평가 했다, 비록이 이미지 수집 및 분석 방법은 vasculogenesis 또는 신생 받을 어떤 세포 유형 평가에 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한,이 이렇게 이러한 연구와 같이 변경된 관 기능 pathologic 상태, 임신 당뇨병 mellitus, 등의 다양 한 결과 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 네트워크 형성 및 분기, 다른 생물학으로 관련 프로세스에 대 한 중요 한 평가에 적응 될 수 있습니다. 따라서, 독특한 생물 학적 시스템에이 새로운 접근 방식을 적용 한 잠재적인 영향 아직 결정 될 것 이다.
Protocol
1입니다. 준비
-
문화 내 피 식민지 형성 세포 (ECFCs)
참고: 이러한 실험에 사용 된 태아 ECFC 샘플 인간 탯 줄 혈액에서 고립 되었고는 인디애나 대학의과 대학에 앞에서 설명한6Angio BioCore (ABC)에 의해 경작. 일상적인 품질 관리 형질 확인 앞에서 설명한19,,2021으로 내 피 항 원 표현에 ABC에서 실시 됐다. 실험에 사용 된 샘플 최소한 passaged 했다 (2-3 회). 모든 조직 문화 작업 조직 문화 후드에서 수행 되었다. 모든 시 약, 조직 문화 접시 등 솔루션, 메 마른 했다.- 2 일 전에 실험, 100mm, 0.05 mg/mL 1 형 콜라겐의 6 mL와 조직 문화 접시 라운드 코트 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
참고: 1 형 콜라겐 20 nM 아세트산 0.05 mg/mL의 농도 작업에 포함 된 이중 증 류 물에 희석입니다. - 실험 전날 trypsinize 그리고 1.1.1에 유형 1 콜라겐 코팅 판에 ECFCs replate. (참고 미만 1.1 참조).
- ECFCs, trypsinize 도금된 셀에서 미디어를 발음 하 고 7 mL의 PBS로 세척. PBS, 발음 그리고 0.5 %trypsin 2-3 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 2-5 분에 대 한 셀을 품 어
- 트립 신와 부 화 직후의 EGM2 피펫으로 아래로 모든 부착 세포를 꺼내 려 3 mL를 추가 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
- 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 모든 샘플 원심
- 상쾌한 발음 그리고 다시 EGM2의 1-2 mL에 셀 알 약을 중단. 세포 현 탁 액을 철저 하 게 혼합 하 고 계산을 위한 작은 약 수 (20-40 μ)을 제거 합니다.
- Aliquot 셀으로 등분 trypan blue를 추가 하 고는 hemocytometer에 10 µ L 플라스틱. hemocytometer의 기본 4 사분면에는 셀의 수를 계산 합니다.
참고: 모든 샘플 수에 대 한 hemocytometer의 양쪽 모두를 사용 하 여 정확도를 향상. - 워시 콜라겐 코팅 조직 문화 접시, 1.1.1, PBS의 7 mL로 두 번 단계에서 준비 했다. 발음 두 번째 PBS 워시 (EGM2) 내 피 성장 매체 2의 10 mL를 추가 후 10% 태아 둔감 한 혈 청 플레이트를 보충 하는 미디어 문화.
- 1.1.7 단계에서 얻은 셀 수를 사용 하 여 접시 4 x 105 셀에 필요한 세포 현 탁 액의 양을 계산 합니다. 플레이트 4 x 105 ECFCs 조직 문화 접시에 단계 1.1.8에서 준비 하 고 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 밤새 품 어.
- 2 일 전에 실험, 100mm, 0.05 mg/mL 1 형 콜라겐의 6 mL와 조직 문화 접시 라운드 코트 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
-
실험 전에 저장 공급 4에 °C 하룻밤
- 3 "x 2" 금속 플레이트, 슬라이드 (후드에서 오픈까지 패키지로 유지), 살 균 20 microliter (μ) 팁, 그리고 지하실 멤브레인 매트릭스 (matrix)의 상자를 저장 합니다.
참고: 매트릭스; 장기 저장용-80 ° C 보관 하룻밤 또는 사용 하기 전에 몇 시간 동안 항상 4 ° C에서 그것을 녹여.
- 3 "x 2" 금속 플레이트, 슬라이드 (후드에서 오픈까지 패키지로 유지), 살 균 20 microliter (μ) 팁, 그리고 지하실 멤브레인 매트릭스 (matrix)의 상자를 저장 합니다.
- 컴퓨터의 하드 드라이브에 이미지에 대 한 충분 한 공간 여부를 확인 합니다.
참고:이 프로토콜에서 설명 하는 구성을 사용 하 고, 약 60 기가바이트 (GB)의 공간이 실험 (4 g B/잘) 당 필요 했다. 그러나, 공간 견적 하드웨어 구성에 기초 하 고 각 시스템에 대 한 결정을 해야 합니다.
2. 프로토콜 1: 실험 설정: 슬라이드 준비
-
수집 및 공급을 준비
- 실험의 하루 얼음, 드라이 아이스의 작은 용기가 위, 및 20 μ 피 펫의 버킷을 포함 하 여 슬라이드에 세포를 도금에 대 한 공급을 수집 합니다. 모든 항목 70% 에탄올 스프레이, 종이 타 올, 건조 한 닦 고 항목 무 균 조직 문화 후드 합니다.
- 4 ° C에 저장 된 모든 용품을 수집 (단계 1.2 참조) 금속판, 팁, 슬라이드, 그리고 매트릭스의 상자를 포함 하 여. 70% 에탄올 스프레이 팁의 상자와 드라이 아이스의 컨테이너에 상자를 배치.
참고: 제거 경우에 사용 하 고 항상 계속 얼음에 매트릭스 준비 4 ℃ 냉장고에서 매트릭스. - 70% 에탄올과 금속판을 스프레이 하 고 얼음 양동이에 얼음에 포함. 슬라이드를 포함 하는 패키지를 열고 슬라이드 그것을 차가운 유지 하는 금속 격판덮개에 장소.
-
슬라이드에 부하 매트릭스
- 10 μ를 피펫으로 설정 하 고 피펫으로 차가운 팁 상자에서 끝을 제거. 가 위 팁의 끝에서 약 1cm를 잘라.
참고: 컷 행렬에서 거품을 줄이기 위해 팁에 수직입니다. 피 펫 팁의 내부에 집착 하는 매트릭스에 대 한 계정에 10 μ 보다 약간 더 큰 볼륨을 설정할 수 있습니다. - 천천히 피 펫 팁으로 매트릭스를 그립니다. 바로 피 펫 팁을 우물의 중앙에 놓습니다. 부드럽게 피 펫 팁 우물의 바닥을 터치 하 고 천천히 매트릭스 밖으로 밀어.
참고: 마 안 피 펫, 이상이 하면 거품 형태로. 만약 거품 형태의 작은 팁을 사용 하 여 즉시 팝업. - 슬라이드 15 개인 우물을 포함합니다. 각 잘에 대해 이전 단계를 반복 합니다. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 하 여 일관성을 유지 하 고 매트릭스 팁 내부 응고를 감소.
- 일단 슬라이드 매트릭스를 포함 하는 모든 웰 스와 함께 로드 됩니다, 슬라이드에 있는 모든 방법을 뚜껑을 밀어 하 고 매트릭스 굳은 때까지 30-60 분 동안 37 ° C에서 품 어.
참고:는 매트릭스를 밖으로 건조 하지 마십시오. 매트릭스 건조의 위험을 줄이기 위해 인큐베이터에서 슬라이드 근처 50 mL 원뿔 튜브의 캡에 PBS의 작은 볼륨 (2-3 mL)를 추가 합니다.
- 10 μ를 피펫으로 설정 하 고 피펫으로 차가운 팁 상자에서 끝을 제거. 가 위 팁의 끝에서 약 1cm를 잘라.
3. 프로토콜 2: 도금 행렬에 ECFCs
-
조직 배양 배지에서 점착 ECFCs를 제거 하 고 서 스 펜 션에 수집
- 조직 문화는 ECFCs를 포함 하는 접시 도금 전날 (참조 섹션 1.1.9)를 가져옵니다. EGM2 미디어를 발음 하 고 점착 ECFCs 7 mL의 PBS로 한 번 씻어.
- PBS를 발음, 트립 신의 2-3 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 2-5 분에 대 한 부착 셀을 품 어
- 부 화 직후의 EGM2 피펫으로 아래로 모든 부착 세포를 꺼내 려 3 mL 추가 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
- 반복 단계 3.1.1-3.1.3 나머지 3 ECFC 샘플에 대 한 모든 4 개의 셀 샘플에에서 수집 됩니다.
-
믹스 마스터 준비
- 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 모든 샘플 원심
- 상쾌한 발음 그리고 다시 EGM2의 1-2 mL에 셀 알 약을 중단.
- 세포 현 탁 액을 철저 하 게 혼합 하 고 계산을 위한 작은 약 수 (20-40 μ)을 제거 합니다.
- Aliquot 셀으로 등분 trypan blue를 추가 하 고 10 μ는 hemocytometer에 플라스틱. hemocytometer의 기본 4 사분면에는 셀의 수를 계산 합니다.
참고: 모든 샘플 수에 대 한 hemocytometer의 양쪽 모두를 사용 하 여 정확도를 향상. - 위에서 계산 셀을 사용 하 여, 1.4x104 셀에 포함 된 각 셀 샘플의 볼륨을 계산 합니다. 모든 셀 정지를 철저 하 게 혼합 하 고 각 실험 조건에 대 한 마스터 믹스를 준비 하는 신선한 튜브로 104 셀 x aliquot 1.4. 각 마스터 믹스의 마지막 볼륨은 175 μ EGM2 미디어를 추가 합니다.
- 슬라이드에서 개별 우물으로 마스터 믹스의 부드럽게 pipetting 및 aliquot 50 μ에 의해 각 마스터 믹스 믹스.
참고: 모든 샘플 마스터 믹스 3.5 우물 3 웰 스에 대 한 충분 한 볼륨을 보장 하기 위해 계산 된 3 중에 도금 됩니다.
-
슬라이드를 품 어
- 이미징을 위한 현미경 챔버로 이동할 수 있습니다 때까지 37 ° C에서 슬라이드를 품 어.
참고: 도금 및 이미징 사이의 시간 vasculogenesis의 초기 단계 동안 데이터 손실을 제한 하 가능한 간단한 이어야 한다.
- 이미징을 위한 현미경 챔버로 이동할 수 있습니다 때까지 37 ° C에서 슬라이드를 품 어.
4. 3 프로토콜: 현미경 설치 및 이미지 수집
참고: 우리의 연구에 대 한 프로토콜 2 및 3 실시 했다 동시에 별도 개인에 의해. 프로토콜 2와 3은 동일한 개인에 의해 완료 해야 합니다, 만약 프로토콜 3 단계 4.1 및 4.2 아래 위의 프로토콜 2를 시작 하기 전에 완료 되어야 한다.
-
현미경 및 컴퓨터
- 실험을 시작 하기 전에 약 1 ~ 2 시간 설정 하 고 37 ° C에 단계 가기 인큐베이터를 예 열, 5% CO2 를 설정 습도 85%로 설정. 비어 있는 경우 부 화기의 습도 공기 통을 채우십시오.
- 두 오픈 위치 중 하나에 빈 연 발된 슬라이드를 배치 하 고 증류수를 채워. 사용 가능한 경우 챔버 온도 제어, 피드백 온도계를 보호 합니다.
참고: 의견 온도계를 사용할 수 있는 경우 사용이 "인큐베이터 온도" 챔버 equilibrated 있다 확인 하. - 39-42 ° C 아래에서 슬라이드를 열 및 응축을 최소화로 설정 하는 보조 송풍기를 켭니다.
- 실험적인 슬라이드를 추가할 수 있습니다 때까지 빈으로 두 번째 슬라이드를 추가 합니다. 이 슬라이드는 설치 하는 동안 개별 웰 스에 대 한 이미지 수집 설정의 구성에 대 한 위치 자리 표시자 역할을 합니다.
- 이미징 실험 기간 동안 상태를 모방 하는 두 번째 슬라이드에 우물 주변 저수지에 물을 추가 합니다. 물 우물을 둘러싼 현미경 설치 및 예 열 하는 동안 습도의 평가 수 있습니다.
참고: 단계 가기 인큐베이터 및 보조 송풍기의 전 평형은 안정적인 자란 환경 유지 중요 합니다. 대부분의 라이브 셀 챔버 컨트롤러2및 시스템의 준비 상태를 평가 하기 위해 습도 온도, CO의 실시간 피드백을 제공 합니다. 계속, 이전 슬라이드에 습도의 축적과 4.1.5에 가득 저수지의 과도 한 건조를 확인 합니다. 습도 경우 과도 한 건조 또는 응축 챔버에 조정 될 필요가 있습니다. 습도 증가, 잎사귀 증류수와 접촉을 추가 합니다. 응축을 감소, 감소 습도 설정 4.1.1에 조정 하거나 응축 저온의 표시 될 수, 챔버 온도 설정 및 보조 송풍기의 위치를 확인 합니다.
-
재래식 동안 기본 이미지 수집 설정을 구성 합니다.
참고: 이미지 수집 단계, 셔터, 및 카메라 제어 소프트웨어를 통해 구성 됩니다. 다차원 설치 도구는 소프트웨어를 구성 하는 가장 쉬운 방법은. 또한, 소프트웨어 자동 루틴을 실험의 기간에 초점 제어를 해야 합니다.- 소프트웨어를 사용 하 여 각 음에 대 한 여러 단계 위치를 설정 하려면. 이 프로토콜에 대 한 우물의 센터를 선택 합니다.
- 각 단계 위치에서 전체 잘은 몇 군데 이미지 수집을 구성 합니다. 예를 들어 10-20% 이미지 겹치기와 카메라와 최종 확대에 따라 약 5 x 5 필드는 tilescan를 사용 합니다.
- 모든 15 분 영상에 대 한 시간 경과 구성 합니다.
참고:이 프로토콜에서 설명 하는 구성을 사용 하는 슬라이드의 모든 15 웰 스는 15 분 간격 내 몇 군데.
-
실험적인 슬라이드 로드
- 인큐베이터 챔버의 평형, 다음 실험 슬라이드 빈 슬라이드를 교체 합니다.
참고: 안정적인 온도, CO2, 그리고 적어도 20 분 동안 습도 equilibrated 챔버를 있을 것 이다. 실험적인 슬라이드 준비가 되 면, 그 단계를 수행 해야 신속 하 게 "배달 시간"을 최소화 하기 위해 도금 및 현미경에 의해 점령 초기 시간 포인트 사이 필수적입니다. 또한, 이미징 실험 사이 비교를 촉진 하기 위하여이 시간 일관 되어야 합니다. 이 실험에서 프로토콜 3 4.3 섹션에에서 설명 된 모든 단계를 완료 하려면 약 30 분 필요 합니다. - 슬라이드 뚜껑을 제거 하 고 슬라이드에 우물 주변 저수지에 물을 추가.
참고: 뚜껑 이미징 실험 하는 동안 제거 됩니다.
- 인큐베이터 챔버의 평형, 다음 실험 슬라이드 빈 슬라이드를 교체 합니다.
-
최종 이미지 수집 설정 구성
- CFI 계획 Fluor DL 10 X 목표 위치에 배치 하 고 콘덴서에 Ph1 단계 반지를 선택 합니다. 초점에서 첫 번째 잘 쾰러 조명에 대 한 diascopic 빛 경로 조정 하 고 객관적인 위상 마스크와 콘덴서에 위상 링의 맞춤을 선택 하 여 위상 광학을 구성 합니다.
- 노출 시간을 구성 하 고는 일반적으로 500 밀리초 미만 단계 대조에 대 한 램프 강도 조정 합니다.
- 4.2.1에서 각 단계 위치 설정 하 고 필요한 경우 우물의 중심을 선택 하 고, 그것을 조정 하는 것을 확인.
- 각 단계 위치에서 셀 우물에서 도금과 무대 위치 z 위치 이미징 소프트웨어에서 사용 설정에 초점.
- 현미경에 대 한 자동 초점 메커니즘을 테스트 합니다. 자동 초점 하드웨어 기반 하는 경우에, 그것에 및 올바르게 모든 무대 위치에 대 한 위치를 확인 합니다.
참고: 견본 및 무대는 실험 기간 동안 수직으로 드리프트 수 있습니다, 그것은 중요 한 소프트웨어 각 단계 위치 및 시간-과정 동안 안정적인 이미지를 보장 하기 위해 모든 시간-포인트 자동 초점 확인. 만약에 가능 하다 면, 이전 시간 지점에서 결정 하는 자동 초점 위치 이후의 자동 루틴에 대 한 시작 지점으로 사용 될 해야 합니다. 이러한 방법으로, 온가 드리프트 수 있습니다 조정할 수 쉽게. - 감소 또는 현미경 방에 빛을 소화 하 고 이미징 실험을 시작 합니다.
5. 프로토콜 4: 이미지 Vasculogenesis (KAV)의 처리 및 운동 분석
-
각 잘 이미지 스택으로 개별 시간 포인트에서 이미지를 저장
참고: 이미지 캡처에 대 한 대부분의 소프트웨어는 다중 페이지 tiff (스택) 시계열의 내보낼 수 있습니다. KAV는 여러 시간 포인트를 포함할 수 있는 데이터 집합에서 작동 하도록 설계 되었습니다. 따라서, 분석 주어진된 무대 위치에 대 한 전체 이미지 스택에 발생합니다. 필요한 경우 이미지 프로세싱 소프트웨어는 이미지 스택을 재구성을 각 시간 지점에서 단일 이미지를 가져올 수 있습니다. - 컴퓨터에서 소프트웨어를 처리 하는 이미지를 엽니다
-
이미지 프로세싱 소프트웨어에 KAV를 추가
- 소프트웨어 창 하단의 회색 바에 KAV 파일을 폴더에서 끕니다. 소프트웨어 목록에 추가 하려면 '저장'을 클릭 합니다.
-
분석 이미지 스택을 엽니다
- 클릭 하십시오 '파일' 다음 '열기' 이미지 프로세싱 소프트웨어, 또는 단계 5.3.1 에서처럼 회색 표시줄에 드래그 이미지 파일 드롭다운 메뉴를 통해.
- '이미지', '유형', '8 비트'를 클릭 하 여 8 비트 이미지를 변환 합니다.
-
관심 (ROI) 영역 만들기
- 도구 모음에서 '분석'을 클릭 하 여 투자 수익 관리자를 엽니다. 뒤에 ' 투자 수익 관리자 '에서 ' 도구'를 선택 합니다.
- 원 또는 사각형 선택 도구 도구 모음에서 클릭 하 여 이미지에 원하는 선택 영역 그리기 새로운 투자 수익을 만듭니다. 그 모양을 저장 ROI 관리자 창에서 ' 추가'를 클릭 합니다.
참고: 이전에 만든된 투자 수익 열 수 있습니다 저장 ROIs (압축된 폴더)을 드래그 하 여 관리자에서 '드래그 앤 드롭' 바에. - 투자 수익 라벨 이미지에 그것을 볼 수 아 관리자에 나열을 클릭 합니다.
참고: 경우 ROI는 이미지에 표시 되지 않습니다, 두 번째 투자 수익 (어떤 크기/모양) 만들고 관리자에 추가 합니다. 일단 둘 다 두 사이 이리저리 클릭 ROIs는 목록에 표시 하 고 원하는 투자 수익 이미지에 표시 됩니다. - 필요한 경우 투자 수익을 맞춥니다. 투자 수익 되 면 원하는 위치에 이미지에 장소, 메뉴에가 고 '수정'을 클릭 후 ' 분명 밖에 서 '. 이 스택의 모든 이미지에 대 한 투자 수익 (비 직사각형 모양에 대 한 유용한) 외부 이미지 데이터를 삭제 합니다.
참고: 당신은 클릭할 수 있다 또한 '이미지'와 '자르기' rectangularly 모양의 ROI를 사용 하는 경우.
-
KAV 소프트웨어 실행
- 메뉴 표시줄에서 ' 플러그인 '을 클릭 합니다.
- ' 네트워크 분석 플러그인. 이 플러그인에서 설정을 변경 하는 옵션 창이 열립니다.
- 드롭다운 화살표를 사용 하 여 임계 처리 방법을 변경.
- 일단 적절 한 설정을 모두 선택 소프트웨어 처리를 시작 하려면 ' 확인'을 클릭 합니다.
참고: 적절 한 설정은 식별 하 고 분별 세포와 위상 대비 이미지에 배경에서 네트워크 소프트웨어의 채택해 지표는 KAV에 의해 생성 된 골격과 마스크 변환 시각화를 통해 결정 됩니다.
-
KAV에서 생성 된 데이터를 저장
- 일단 플러그인 분석 완료, 두 개의 창이 숫자 값과 퓨즈 이미지 뼈대와 마스크 변환 묘사의 스택 데이터 테이블을 포함 하 여 화면에 팝업 것입니다.
- 데이터 테이블의 상단 왼쪽된 모서리에 이동 하 여 숫자 값을 저장 하 고 클릭 하면 '수정' 다음 '복사' 또는 '컷' excel 스프레드시트에 값을 붙여 넣습니다.
- 융합된 뼈대와 마스크 이미지를 클릭 하십시오. 파일 클릭 하 여 ',' ' 다른 이름으로 저장 ' '티파니.' 융합된 해골/마스크 이미지 스택 태그 이미지 파일 형식 (TIFF) 파일로 저장
- 자른된 단계 대조를 저장 스택 (ROI를 사용 하 여 만든) '파일 을' ' 다른 이름으로 저장 ' '티파니.'를 클릭 하 여 이미지
- 투자 수익 관리자 창에서 클릭 하 고 이미지를 자르려면 사용 ROI를 선택. '더' 뒤에 나중에 사용에 대 한 투자 수익을 저장 하려면 '저장'을 클릭 합니다.
참고: 사용 같은 ROI 분석에 걸쳐 일관성을 유지 도움이 됩니다.
Representative Results
KAV 생산 네트워크 구조를 시각적으로 표현
ECFCs와 위상 대비 이미지에서 매트릭스 배경 셀 특정 구조를 규명 KAV 수 있습니다. ECFC 네트워크 식별 KAV 정량화 (그림 2A)에 대 한 소프트웨어에 의해 사용 되는 구조를 설명 하기 위해 pictorially 골격과 마스크 변환으로 표시 됩니다. 중요 한 것은, 골격과 마스크 변환의 질적 평가 KAV 감도와 정확도, 최적의 임계값 설정을 결정 하 고 분석 결과 해석 하는 데 유용 수 있는 급속 한 식별 수 있습니다. 단계 대조 이미지의 품질이 높은 하 고 충분 한 대비 달성, KAV 정확 하 게 식별 ECFC 네트워크 위상 대비 이미지와 KAV에서 생성 된 골격과 마스크 변환을 (그림 2 사이의 유사성에 의해 표시 된 대로 A 와 비디오 1).
또는, 단계 대조 이미지에 고대비 및/또는 발생 하는 gridding 같은 이미징의 유물 없는 경우 네트워크 탐지 정확도 감소 하 고 결과 될 모호한 (그림 2B). 또한, 셀 미디어 내에서 기포의 형성 탐지 정확도 (그림 2) 모호한 또한 수 있습니다. 그러나, 이미지 품질 문제가 종종 KAV 소프트웨어에 포함 된 다른 임계 처리 방법의 선택을 통해 극복할 수 있다. 예를 들어 그림 2B 단계 대조 이미지 임계 처리 방법 제외 하 고 동일 이미지 처리 설정을 사용 하 여 분석 했다. 골격과 마스크 변환에서 오쓰 임계 처리 단계 대조 이미지 (그림 2B)에 표시 된 ECFC 네트워크의 더 정확한 검색 결과 분명 하다. 따라서 이미지 품질은이 분석 결과에 정확 하 고 의미 있는 결과 달성 하는 데 중요 합니다. 그러나, KAV 사용자 인터페이스에 포함 된 다른 임계 처리 메서드 입력된 이미지의 품질에 따라 이미지 분석의 조정을 수 있습니다.
시간 경과 현미경 ECFC vasculogenesis 자궁내 임신 당뇨병 mellitus 노출 다음에 질적, 양적 차이 식별
최근, KAV 분석 접근 모성 타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM) utero에서16에 노출 다음 태아 ECFC 함수를 평가 하기 위해 적용 되었습니다. KAV를 사용 하 여, vasculogenesis의 변경된 활동 T2DM에 노출 태아 ECFCs에서 확인 되었다. 그러나, T2DM 뿐만 아니라 전체 임신, 임신 당뇨병 mellitus (GDM), 또는 임신의 3 달 동안에 일반적으로 포도 당 옹 졸의 개발을 통해 발생, 노출, 또한 손상 한다 ECFC 함수13. 따라서, KAV GDM 노출 ECFCs ECFC 네트워크 형성의 변경된 활동 또한 표시 결정에 적용 했다. 1 단계 (0-5 h) 2 단계 (5 + h) 시간을 사용 하 여 평가 했다 그리고 경과 현미경 결합 KAV 분석 (그림 3). 대표 위상 대비 이미지 이미지 수집 (0.50 h)의 시작에 인수 및 시간 과정 (5.00 및 10.00 h)을 통해 묘사 (그림 3 및 비디오 1 실험 하루에서 테스트 하는 4 개의 샘플에서 ECFC 네트워크 형성 ). 해당 셀 로드, 0.50 시간에 단계 대조 이미지에서 관찰에 불구 하 고 네트워크 구조에서 질적 차이 5.00 및 10.00 시간 시간 지점에서 분명 하다. 단순한 임신 (UC)에서 ECFCs는 5 시간 후 도금, 우리의 이전 게시 데이터16비슷한 복잡 하 고 복잡 한 네트워크를 형성 한다. 반대로, GDM에서 ECFCs 샘플 1 (GDM1) 형태가 거의 구조를 하지 상호 연결 네트워크. 그러나,이 패턴은 GDM 임신, 나타내는 샘플 사이에서 얻은 모든 ECFC 샘플에 반영 되지 않습니다. 샘플 GDM2 및 GDM3의 연결 패턴 표시 변경 UC 샘플에 비해 큰 네트워크 형성, GDM1에 비해 표시. 중요 한 것은, KAV ECFC 명백 하 고 미묘한 고기를 식별 하기 위해 네트워크의 여러 구조 구성 요소를 측정 합니다.
네트워크 구조의 골격과 마스크 변환을 생성 이외에 KAV quantitates 네트워크 구조, 네트워크 구조, 노드, 트리플 분기 노드, 네 번 분기 노드, 지점, 총 수의 10 통계 분기 길이, 평균 분기 길이, 분기 노드 비율, 총 폐쇄 네트워크 및 네트워크 영역16 KAV 시간 과정의 모든 이미지에 대 한 값의 단일 테이블에 각 샘플에 대 한 데이터를 컴파일합니다. 표 1 1 ECFC 샘플에 대 한 하나의 영상 연구에서 대표적인 원시 데이터를 포함합니다. KAV에 의해 측정 네트워크 구조의 매개 변수 열로 구성 되어 있습니다 그리고 시간이 지남에 인수 순차적 이미지에 대 한 데이터 행으로 구성 됩니다. 예를 들어, 우리의 연구, 이미지 1에서에서 얻은 후속 이미지 되 고 수집 모든 15 분 원시 값에 의해 생성 된 30 분 후 도금에 대 한 KAV 그래프로 다음 수 또는16접근 더 복잡 한 통계를 사용 하 여 추가 분석.
5 그래프 네트워크 구조에서 3 개의 별도 실험의 평균값을 묘사한 한 단순한 샘플 (UC) 및 3 개의 GDM 샘플 (그림 4)에 대 한 표시 됩니다. 이러한 실험 이전에 마찬가지로 수행에 UC 샘플 분석 UC 샘플16. 이전에, 그것은 ECFC vasculogenesis 시험관 bi phasic, 1 단계 (0-5 h)의 구성 이며 2 (5-10 h)16단계 확인 되었다. 이 패턴은 현재 연구에서 일관 된 폐쇄 네트워크 데이터 (그림 4)를 묘사 하는 그래프에 의해 입증. UC 샘플 GDM 샘플의 모든 3에 비해 폐쇄 된 네트워크의 더 많은 수를 형성 했다. 흥미롭게도, 4 개의 샘플의 3 비슷한 시간 2.5 시간에서 3 시간 사이 발생 하는 폐쇄 된 네트워크의 최대 수를 나타납니다. 그러나, GDM2 샘플 느린 발생 5 시간 후 도금 최대한 폐쇄 네트워크에 도달 했다. 그리고, GDM2 샘플 UC 샘플에 비해 적은 최대한 네트워크 형성에 불구 하 고 그것은 형성 하는 네트워크 유지 마찬가지로 UC 샘플 시간이 지남에. 반대로, GDM1 및 GDM3, UC 샘플에 비해 적은 네트워크를 형성, 또한 시간이 지남에 네트워크 번호의 전반적인 감소를 전시. 그러나 전반적으로, 폐쇄 네트워크 번호를 묘사 하는 그래프에서 분명 하다 모든 ECFC 샘플 네트워크 형성의 bi phasic 패턴 표시 형성의 속도 최대한 달성 하는 네트워크 샘플 마다.
네트워크 위치를 ECFCs에 의해 형성 된 닫힌된 네트워크에서 평균 영역을 나타냅니다. 따라서, 큰 폐쇄 네트워크 번호, 작을수록 네트워크 분야. 이 패턴은 닫힌된 네트워크의 많은 수를 형성, UC 샘플 3 GDM 샘플 (그림 4)에 비해 시간이 지남에 작은 네트워크 영역을 했다 네트워크 영역 그래프에 반영 됩니다. 그러나 최대한 폐쇄 된 네트워크를 더 느리게 도달 GDM2 전시 높은 네트워크 지역 처음, 시간, 그리고이 지역의 안정 되는 가장 유사한 UC 샘플 15 시간에. 시간이 지남에, 모든 샘플에서 평균 네트워크 영역 네트워크 드 안정화 때문에 증가. 그러나, GDM1 및 GDM3, 같은 일부 샘플 더 점진적 증가 전시 하는 다른 샘플에 비해 감소 안정성의 가능성이 나타내는 네트워크 지역에 있는 더 급속 한 증가 전시.
GDM 노출 ECFCs 전시 감소 네트워크 안정성
노드를 분 지의 비율 KAV 계산 되며 우리의 이전 연구에서 확인 된 소설 형 이며이 네트워크 연결16. 현재 연구에서 UC 샘플 낮은 비율, (그림 4) 동안 유지 되었다 네트워크 연결의 높은 수준을 대표 했다. 반대로, 3 GDM 샘플 네트워크 형성의 단계 2에서 특히 노드에, 분기의 높은 비율을 했다. 이 관측 감소 연결 드 안정화의 네트워크 구조를 보여 줍니다.
전반적으로, GDM1 적은 노드와 분기 감소 실험의 과정을 통해 유지 관리와 함께 다른 샘플에 비해 형성. GDM2와 GDM3 형성 및 분 지 5-15 h 사이 특히 UC 샘플에 비해 더 많은 유지 됩니다. GDM2 및 GDM3 네트워크에서 검색 된 노드의 숫자의 10-15 h 사이 특히 UC 샘플 노드 수를 더 유사 했다. 많은 수의 분기, 하지만 노드, 비슷한 수 계정 노드 비율 증가 분기 GDM 샘플 나중 시간 지점에서 분명. 중요 한 것은, 지점 및 노드 번호에 동시 변경 별도 그래프에서 해석 하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 노드 비율에 소설 분기 평가 방법을 변경, 지점 및 노드 번호, 개별 그래프에 감지 하기 어려운 약간의 변화를 포함 하 여 변경 된 네트워크 연결에서 발생할 수 있는 방법을 제공 합니다.
그림 1 : 계량에 의해 운동 분석의 Vasculogenesis (KAV) 10 매개 변수를 설명 하는 도식. KAV는 네트워크 구조의 10 가지 매개 변수를 quantitates. 모든 매개 변수는 색상으로 구분 하 고 설계도에 명시 된 숫자 (1-10). 분기 (녹색, 1), 폐쇄 네트워크 (블루, 2)의 수를 포함 하는 매개 변수 및 노드 (레드, 3), 평균 네트워크 영역 (주황색, 4), 네트워크 구조 (검정, 5), 트리플 분기 노드 (노란색, 6), 및 쿼드 분기 노드 (보라색, 7)의 수 뿐만 아니라 총 (9)와 평균 (10) 분기 길이 및 분기 노드 (10) 수 하의 수의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 키네틱 Vasculogenesis 분석 (KAV) 네트워크 구조 quantitates. KAV 이미지 네트워크 구조를 식별 하 고 KAV에 의해 정량의 시각적 표현을 제공 하는 단계를 사용 하 여 식별 하는 네트워크 구조 (A) 골격과 마스크 변환. 눈금 막대 = 500 µ m. (B) ECFC 네트워크 10 h 후 도금 낮은 대비와 격자의 대표 위상 대비 이미지 표시에서 개별 이미지를 함께 바느질. 평균 또는 오 츠, 같은 다른 임계 처리 방법 단계 대조 이미지는 낮은 대비 또는 gridding 경우 정량 정확도 높이기 위해 플러그 인 KAV에서 선택할 수 있습니다. 단계 대조 이미지의 골격과 마스크 변환은 의미와 오쓰 임계 처리 방법에 대 한 표시 됩니다. 단계 대조 이미지 10 X 목표를 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 자궁내 GDM 노출 변경 ECFC 네트워크 형성. ECFC 네트워크 형성의 이미지 15 h 15 분 간격 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 점령 되었다. 5 h 증가, (0.5 h), 도금 시간의 시작에서 대표적인 단계 이미지는 UC와 3 GDM 샘플에 대 한 표시 됩니다. 단계 대조 이미지 10 X 목표를 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 자궁내 GDM 전시 변경 네트워크 형성 활동에 노출 하는 ECFCs. ECFCs는 단순한 임신 (UC, 검정)과 3 개의 임신 임신 당뇨병 mellitus (GDM 1-3, 레드)에 의해 복잡에서 얻은 했다. 단계 대조 이미지는 15 분 간격으로 15 h. quantitated 키네틱 Vasculogenesis 분석 (KAV) 소프트웨어에 대 한 폐쇄 네트워크, 네트워크 영역, 가지, 노드와 노드를 분 지의 비율에 점령 했다. 그림 데이터는 각 샘플에 대 한 3 개의 별도 실험의 의미 (SEM)의 평균 ± 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: 자궁내 GDM 노출 ECFC 네트워크 형성의 속도 론 변경. ECFC 네트워크 형성의 이미지 15 h 15 분 간격 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 점령 되었다. 단계 대조 이미지는 UC와 3 GDM 샘플 이상 15 h 0.5 h에서 시작에 대 한 표시 됩니다. 눈금 막대가 나타냅니다 500 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
| 이미지 | 총 지사 네트워크 | 노드 | 세 배 | 상관 | 분기 | 총 분기 길이 * | Avg 분기 길이 * | 분기 노드 비율 | 폐쇄 된 네트워크 | 네트워크 지역 * * |
| 1 | 382 | 290 | 278 | 11 | 943 | 47210 | 124 | 3.25 | 9 | 480214 |
| 2 | 284 | 345 | 337 | 8 | 940 | 50699 | 179 | 2.72 | 16 | 264469 |
| 3 | 205 | 376 | 366 | 9 | 910 | 55728 | 272 | 2.42 | 27 | 150621 |
| 4 | 162 | 422 | 407 | 15 | 947 | 59692 | 368 | 2.24 | 40 | 98713 |
| 5 | 132 | 454 | 441 | 12 | 967 | 61923 | 469 | 2.13 | 53 | 72951 |
| 6 | 122 | 435 | 419 | 14 | 907 | 62587 | 513 | 2.09 | 68 | 56948 |
| 7 | 88 | 429 | 411 | 17 | 852 | 63983 | 727 | 1.99 | 74 | 51429 |
| 8 | 68 | 451 | 437 | 13 | 874 | 63960 | 941 | 1.94 | 74 | 51780 |
| 9 | 93 | 437 | 417 | 18 | 905 | 60901 | 655 | 2.07 | 49 | 82919 |
| 10 | 126 | 511 | 487 | 24 | 1075 | 61981 | 492 | 2.1 | 37 | 116857 |
| 11 | 49 | 397 | 384 | 12 | 737 | 61823 | 1262 | 1.86 | 79 | 48805 |
| 12 | 81 | 376 | 364 | 10 | 751 | 56817 | 701 | 2 | 63 | 64431 |
| 13 | 98 | 509 | 482 | 26 | 1028 | 60799 | 620 | 2.02 | 44 | 98056 |
| 14 | 93 | 449 | 416 | 31 | 909 | 58282 | 627 | 2.02 | 45 | 94081 |
| * 반올림 가장 가까운 미크론 * * 가까운 미크론 반올림 ^2 | ||||||||||
표 1: 한 영상에서 원시 데이터를 대표 한 ECFC 샘플에 대 한 연구.
Discussion
KAV 있습니다 여러 시간 포인트와 큰 데이터 세트의 평가
전통적으로, 생체 외에서 vasculogenesis의 정량, 단일 또는 몇 시간 포인트 측정 이루어져 있다. 이 정적 접근 단순히 역동적이 고 복잡 한 과정을 측정 하 고 위한 적합 하지 않습니다. 따라서,이 소설 메서드 vasculogenesis의 역동적인 과정에 관련 된 잠재적인 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기 위해 네트워크 형성 활동의 효율적인 분석을 사용 하도록 개발 되었다. 효율성과 자동화는 생성 하 고 많은 양의 이미지 데이터 분석 소설 기술의 개발에 중요 한 요소입니다. KAV 시간과 시간 경과 데이터 세트에서 생물학적으로 의미 있는 결론을 파생 하는 데 필요한 노동 감소 이미지의 수백으로 구성 된 큰 이미지 스택 분석으로 개발 되었다. 중요 한 것은, KAV 이미지 처리를 수행 하 고 작은 (100 이미지)에 대 한 초만에 데이터 생성 이미지 스택 및 분 큰 (100 이상) 이미지 스택, 탁월한 효율성이. 또한, 시간과 매개 변수 측정 하 여 스프레드시트에 데이터 조직 그래픽 프레 젠 테이 션 및 통계 분석의 급속 한 발생을 가능 합니다.
이 방법의 성공적인 적용 과제
이 분석 결과 향상 된 이미지 수집 및 분석을 포함, 일부 과제는 성공적인 구현을 방해 수 있습니다. 4 주요 장애물 습도 안정성, 타이밍 정밀도 도금에서 이미지 수집, 소프트웨어 및 하드웨어 안정성 및 각 실험에 대 한 생성 하는 큰 데이터 집합의 관리를 포함 합니다. 몇 시간 동안 안정적인 라이브 셀 이미징도 전하실 수 있습니다. 특히, 적절 하 고 일관 된 습기는 이미징 챔버에 대 한 필요 합니다. 신생 슬라이드는 병렬화 매트릭스 기반 신생 분석 실험을 위한 설계는이 분석 결과에 사용 됩니다. 그들의 낮은 볼륨을 약 50 µ L은 증발 및 응축 확장된 문화 조건에 대 한 중요 한 고려 사항. 이 실험적인 문제를 방지 하기 위해 습도 조절 하는 인큐베이터를 사용 하는 데 필요한입니다. 그러나, 그것은 또한 이미징 챔버의 과도 한 건조 시간이 지남에 발생 하는 경우이 규칙을 증가 시키기 위해 필요할 수 있습니다. 우리는 습도 증가 하는 간단한 방법을 챔버에 물 표면 영역을 증가 하는 것입니다 발견. 이 목표를 달성 하기 위해 우리의 프로토콜 제안 다음 세 물 소스: 물, 인큐베이터 온도 측정은 또한 이다, 슬라이드 및 유체 필터 종이에 우물 주변에 물 가득 2 연 발된 슬라이드 또는 정리합니다. 반대로, 결로 발생 방에 공기 온도 냉각 슬라이드의 하단 슬라이드와 우물에 응축 챔버 내부에 습도. 이 합병증 셀 미디어와 위상 대비 방해 렌즈 효과 희석 될 수 있습니다. 이러한 연구에서 응축은 슬라이드의 아래쪽에 격렬된 한 공기 (39-42 ° C)의 응용 프로그램을 통해 최소화 했다.
모든 시간 경과 연구에 대 한 주요 고려 사항은 실험 개시 및 이미징 간의 일관성입니다. 영상 시작할 때의 타이밍은 다운스트림 이벤트의 해석에 대 한 중요 합니다. 이 분석 결과의 타이밍 정밀도 보장 하기 위해, 초기 도금 및 첫 번째 이미지 시간 포인트 사이의 시간 밀접 하 게 제어할 수 한다. 실제로,이 "죽은 시간"을 최소화 할 수 있습니다, 하지만 더 중요 한 것은, 비교할 다른 일에 실험을 허용 하도록 일치 해야 합니다. 예를 들어,이 프로토콜에 우리는 약 30 분의 죽은 시간을 기대합니다. 이 실험 준비 및 시설 이미징의 근접에 의해 촉진 될 수 있다.
어떤 평범한 첫눈에 자세한 사항은 소프트웨어, 하드웨어 안정성, 및 데이터 관리에 대 한 중요 한 처럼 보일 수 있습니다. 소프트웨어와 관련된 하드웨어 드라이버, 네트워크 환경 및 자동화 된 소프트웨어 모든 영향 소프트웨어의 안정성을 업데이트 합니다. 병목 현상 및 이미지 수집;에 문제의 잠재적인 출처를 식별 하는 "건조 실행"에서이 프로토콜을 테스트 가치가 예를 들어, 신뢰할 수 없는 라이브 셀 설치, 단계, 셔터, 그리고 카메라 안정성 및 기관 정보 기술 정책 자동화 된 운영 체제 및 소프트웨어 업데이트를 확인 합니다.
데이터 관리는 이미지의 수천 수백을 생성 하는 모든 이미징 실험의 지속적인 관심사 이다. 다행히도, 상용 소프트웨어는 종종 이미징 실험을 시작 하기 전에 사용 가능한 공간에 대 한 확인 합니다. 그러나,이 분석 결과 또한 포스트 캡처 이미지 처리 및 하드 드라이브 공간 부담에 추가 하 고 사용 가능한 공간이 제한 된 경우 이미징 실험을 방해할 수 있는 분석 포함 되어 있습니다. 또한, 컴퓨터의 보안과 안전을 보장할 수 없습니다, 동일한 디스크의 중복 배열 등 하드웨어 솔루션과. 따라서, 지속적인 실험과는 강력한 원격 보관, 예를 들어 기관 보관 리소스에 대 한 컴퓨터의 하드 드라이브에 공간을 보장 하는 데이터 관리 전략 필요 하다.
이미지 품질을 극대화 하는 전략
KAV의 능력을 정확 하 게 매트릭스 배경에서 ECFCs를 분별 하는 강력한, 분석 결과의 감도 이미지 품질에 따라. 예를 들어 이미지에 낮은 반면, 소프트웨어 (그림 2B) 더 적은 정확도 가진 셀 네트워크를 감지 합니다. 단계 대조의 품질 이미지 취득에 사용 하는 현미경의 설정을 비롯 한 여러 요인에 의해 영향을 받는 동안 시험 준비, 및 우물에서 미디어 레벨의 유지 보수는 매트릭스와 셀 서 스 펜 션 미디어의 로드 전체 이미지입니다. 이러한 분석에 대 한 위상 대비 최적화, 현미경에서 위상 링 맞춤 약간 조정 대비 개선 되었다. 또한, 샘플 준비 동일 하 고 일관 된 미디어 로드 되도록 엄격 하 게 시험 되었다. 우물에 로드 하는 미디어 매트릭스의 금액 아래 또는 최적의 범위 위의 경우는 초승달 모양 변경된 단계 대조를 선도 형성할 수 있습니다. 마지막으로, 우물에 액체의 작은 볼륨 때문에 그것은 위에서 설명한 증발 및 응축을 최소화 하 여 미디어 수준을 유지 하기 위해 중요 한. 전반적으로, 분석 결과 최적화 분석에 대 한 높은 품질 이미지를 생성에 중대 하다.
단계 대비 품질 외에 다른 요인 수 또한 분석 결과 결과 미디어 오염를 포함 하 여 행렬 및 입자에 결점 또는 파편 매트릭스 또는 미디어에 영향을. 이후 현미경 실에서 몇 시간 동안 라이브 셀 이미징 관련 된 오염이 분석이 결과의 위험입니다. 오염의 위험을 줄이기 위해, 매트릭스 및 셀 정지 불 임 후드에 슬라이드에 로드 됩니다. 또한, 각 샘플은 중복 또는 파편 또는 분석을 혼동 하는 입자 같은 뜻하지 않은 문제로 인해 데이터 손실의 위험을 최소화 하기 위해 실험에 대 한 3 중에서 일반적으로 도금 된다.
샘플이 드라이브 증가 시험 감도 위한 필요
이 관찰 되었고 GDM13에 노출 하는 ECFCs의 이전 연구에서 보고. 이 샘플에서 관찰 된 세포 기능에이 질 높은 수준의 모성 질환의 심각도, 질병, 및 혈액 포도 당 수치를 조절 하는 데 사용 하는 경영 스타일의 기간 등 여러 가지 요인에 기인 될 추측 이다. 중요 한 것은,이 분석 방법은 GDM 임신에서 샘플에 기능적인이 성분으로 인해 phenotypic 차이 식별 가능한 만드는 동적 범위 ECFC vasculogenesis를 캡처합니다. 전반적으로,이 연구에 사용 되는 것 같은 기본 환자 샘플의 사용 셀 라인에 비해 큰 변화를 발생할 수 있습니다. 기능 다양성으로 여러 기본 동물이 나 인간의 샘플을 포함 하는 변환 연구에 큰 중점을 배치로 분석 결과 감도 검색 및 생물학적으로 의미 있는 측정 및 결론의 파생 위해 필수적 이다. 따라서, KAV 데이터의 품질과 수량 향상 됩니다 같은 방식의 개발 보다 강력한 관찰과 결론을 수 있도록 분석 생체 외에서 vasculogenesis 및 신생에 의해 생성. 또한, 이러한 데이터는 자궁내 GDM 노출 다음 변경 된 ECFC vasculogenesis을 기본 분자 메커니즘의 미래 조사를 촉진 한다.
이 방법의 미래 응용 프로그램
이 방법은 태아 ECFC vasculogenesis에서 체 외에 이러한 연구 평가에 적용 되었다, 하지만이 방법의 잠재적인 응용 프로그램 많다. 이 기술은 vasculogenesis 또는 신생의 프로세스에 참여 하는 모든 세포 인구를 공부를 쉽게 구현할 수 있습니다. 특히,이 연구에서 입증 되었다로 개별 세포 인구를 공부 하 사용할 수 있지만 공동 문화 시스템에도 적용 될 수 있습니다. 미래에, 그것은 3 차원 (3D) 모델을 평가 하기 위해 2 차원 생체 외에서 분석 결과 넘어이 이렇게 확장에 도움이 것입니다. KAV의 현재 버전 3D 이미징 데이터를 quantitating에 대 한 충분 한 것, 특히 3D 또는 vivo에서 모델에 대 한 유사 하 게 설계 시간 경과, 다중 변수 분석 접근 연락 것 관찰 2 차원에서 만든 체 외에서 세포 기능 더 생물학적으로 관련 설정에서의 대표 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 루시 밀러, Leanne 에르난데스, 박사 데이비드 하 스, 브리트니 Yeley (인디애나 대학의과 대학), 닥터 카 렌 Pollok, 줄리 Mund, 매튜 Repass와 에밀리 심즈 (인디애나 대학 사이먼 암 센터에 Angio BioCore)에 대 한 인정 ECFC 예제를 파생에서 우수한 기술 지원입니다. 저자 또한 인정 박사 모 린 A. 해 링 턴, 에드워드 F. Srour, 리처드 북 아 일, Mervin C. 요더, 마 티아 스 A. Clauss (인디애나 대학의과 대학) 학술 토론 뿐만 아니라에 대 한 제 니스 벽 (인디애나 대학의과 대학) 관리 지원입니다. 모든 이미지는 생물 현미경, 인디애나 대학의과 대학에 대 한 인디애나 센터에서 수행 되었다. 이 작품은 국립 보건원 (R01 HL094725 P30 CA82709, U10 HD063094)와 Riley 어린이 재단에 의해 지원 되었다. 또한,이 게시가 되었습니다 부분 지원 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소의는 국립 보건원에서 수상 # T32 HL007910에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 1495949B | |
| Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
| Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
| EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium. |
| 0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
| Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL. |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM. |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
| Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
| Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
| Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
| Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10X |
| Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
| Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
| Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
| Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
| FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298 (2011).
- Carmeliet, P.
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
- Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
- Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
- Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
- Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
- Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
- Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
- WimTube. , Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
- Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
