L’analyse cinétique de vasculogénèse quantifie dynamique de vasculogénèse et angiogenèse In Vitro

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour l’imagerie Time-lapse et analyse de vasculogénèse in vitro à l’aide couplé avec le logiciel open source, analyse cinétique de vasculogénèse au microscope à contraste de phase. Ce protocole peut être appliqué pour évaluer quantitativement le potentiel vasculogenic de nombreux types de cellules ou des conditions expérimentales qui modélisent les maladies vasculaires.

Abstract

Vasculogénèse est un processus complexe par lequel les cellules souches et progénitrices endothéliales subissent la formation de vaisseaux de novo . Évaluation quantitative de la vasculogénèse est devenu un affichage central des fonctionnalités de cellules progénitrices endothéliales, et par conséquent, plusieurs tentatives ont été faites pour améliorer les modèles vasculogénèse fois in vitro et in vivo . Toutefois, des méthodes standard sont une portée limitées, avec les mesures statiques de la capture de nombreux aspects de ce processus hautement dynamique. Par conséquent, l’objectif de développement de ce nouveau protocole était d’évaluer la cinétique de in vitro vasculogénèse afin de quantifier le taux de formation de réseau et de stabilisation, ainsi que donnent un aperçu des éventuels mécanismes vasculaires dysfonction. Application du présent protocole est démontrée à l’aide de foetus colonie endothélial formant des cellules (ECFCs) exposées au diabète maternel. ECFCs foetales ont été dérivés du sang de cordon ombilical après la naissance, cultivées et plaqués dans les diapositives contenant la matrice de la membrane basale, où ils ont subi vasculogénèse. Images des puits diapositive entière ont été obtenues en utilisant la microscopie à contraste de phase Time-lapse plus de 15 heures. Des images ont été analysées pour la dérivation des données quantitatives, à l’aide d’un logiciel d’analyse appelé analyse cinétique de vasculogénèse (KAV). KAV utilise la segmentation d’image suivie de squelettisation d’analyser les composants de réseau de piles d’images de contraste de phase point plusieurs fois pour obtenir dix paramètres (9 mesuré 1 calculé) de structure de réseau, y compris : les réseaux, les domaines réseau, fermés nœuds, branches, la longueur des branches total, longueur des branches, ramifiés en triple nœuds, nœuds ramifiés en quad, structures de réseau et la direction à rapport de nœud. Application du présent protocole identifié modifiée taux de vasculogénèse dans ECFCs provenant de grossesses compliquées de diabète sucré. Cependant, cette technique a des implications larges au-delà de la portée rapportée ici. Mise en œuvre de cette approche améliorera l’évaluation mécaniste et améliorer les affichages fonctionnels de vasculogénèse et d’autres processus de ramifications biologiquement importants dans nombreux types de cellules ou états pathologiques.

Introduction

L’aptitude des cellules endothéliales progénitrices vasculogénèse, ou la formation de vaisseaux de novo , est critique en établissant le système vasculaire embryonnaire au cours du développement¹. En outre, autre formation de vaisseaux et la maturation des vaisseaux préexistants, qui est appelée angiogenèse, est également un processus clé dans le développement et dans la vie postnatale pour maintenir la circulation sanguine et l’homéostasie dans tout le corps². Chaque organe du corps est dépendant du système vasculaire pour la livraison de l’oxygène et des nutriments et pour l’élimination des déchets³. Si l’homéostasie vasculaire n’est pas maintenu, tel que la réparation et la formation de vaisseaux sanguins sont insuffisants ou en excès, les maladies vasculaires peuvent provoquer⁴. Par conséquent, d’adaptation et de formation vasculaire sont couramment étudiés, car ils sont essentiels au maintien de la santé de l’orgue et sont impliqués dans le développement de nombreux états pathologiques.

En raison d’une meilleure compréhension de l’implication du système vasculaire dans le développement, ainsi que dans la progression et la manifestation de la maladie, les essais ont été développés pour modèle vasculogénèse et angiogenèse in vitro et in vivo^{5 ,6,7}. Formation de vaisseaux de modélisation consiste à placage des cellules vasculaires, telles que les cellules endothéliales, dans la matrice de la membrane basale qui favorise l’organisation cellulaire et la formation de navire réseaux^8,9,10. En général, qui suit la nuit d’incubation, images de cellule réseaux sont capturés à un moment unique, résultant en un petit nombre d’images pour analyse^11,12,13. Par conséquent, les approches analytiques largement développées et optimisés pour la seule fois point de quotes-parts^10,14. Cependant, les analyses statiques sont tout simplement insuffisantes pour capturer le processus dynamique de la formation de vaisseaux et donnent un aperçu limité de possibles mécanismes impliqués. Bien que l’augmentation de la fréquence d’imagerie fourniraient probablement les données nécessaires pour identifier la cinétique de la formation, application d’analytique précédemment développés jusqu'à un point plusieurs fois d’imagerie approche serait inefficace et main d’oeuvre intensive¹⁴. En outre, malgré le développement d’analyses disponibles dans le commerce, une taxe de payer-par-image restitue cette option coût prohibitif pour les études cinétiques dans laquelle des milliers d’images sont généré¹⁵. Par conséquent, il est nécessaire dans le domaine pour une approche simple et efficace capturer et quantifier vasculogénèse in vitro, y compris la capacité d’analyser des ensembles d’images grand générés par microscopie des cellules vivantes Time-lapse.

Pour surmonter ces limites, une nouvelle approche a été développée dans le but d’élargir le moment unique imagerie pour permettre l’évaluation dynamique des vasculogénèse avec des images acquises chaque 15 min¹⁶. En capturant plusieurs points dans le temps sur plusieurs heures, cette approche fournit une description plus détaillée du processus de vasculogénèse, mais aussi de mieux comprendre les mécanismes potentiels contribuant à la formation et la maintenance de réseaux de navire. En plus d’améliorer la fréquence et la qualité d’acquisition d’images, cette approche intègre de nouveaux logiciels sous la forme d’un plug-in open source¹⁷. Le logiciel, dénommé comme analyse cinétique de vasculogénèse (KAV), est une application simplifiée qui incorpore le traitement de l’image et l’analyse spécifiquement pour des ensembles d’images grand produit des acquisitions point plusieurs fois. KAV analyse les images de contraste de phase par l’intermédiaire de segmentation d’image suivie de squelettisation¹⁸. Dix paramètres de structure de réseau sont quantifiés par KAV dont : branches, réseaux fermés, nœuds, domaines réseau, structures de réseau, ramifiés en triple nœuds, nœuds ramifiés en quad, la longueur des branches total, longueur des branches et la direction à rapport de nœud (voir schéma de la Figure 1)¹⁶. Application de l’approche KAV comprend un phénotype calculé, roman de in vitro vasculogénèse, dénommé la branche ratio de nœud. Nos travaux récents ont démontré que ce ratio est révélateur de la connectivité réseau et peut-être être associé à d’autres processus cellulaires impliqués dans la formation du réseau, par exemple la motilité¹⁶.

Bien que le foetus colonie endothélial formant vasculogénèse cellulaire (ECFC) a été évalué dans ces études, cette approche d’acquisition et d’analyse des images peut être facilement appliquée afin d’évaluer les types de cellules qui subissent une vasculogénèse ou angiogenèse. En outre, cette approche peut servir à identifier la fonction vasculaire altérée résultant de divers états pathologiques, comme le diabète gestationnel, comme illustré dans ces études. En outre, cette méthode pourrait être adaptée afin d’évaluer la formation de réseau et des ramifications, qui sont importants pour d’autres processus biologiquement pertinentes. Ainsi, l’impact potentiel de l’application de cette approche novatrice aux systèmes biologiques uniques est encore à déterminer.

Protocol

1. les préparatifs

1. La culture colonie endothélial formant des cellules (ECFCs)
   NOTE : Échantillons ECFC foetal utilisés dans ces expériences ont été isolés du sang de cordon ombilical humain et cultivés par l’Angio BioCore (ABC) à l’Indiana University School of Medicine comme décrit précédemment⁶. Phénotypage de contrôle régulier de la qualité a été menée au sein de l’ABC pour confirmer l’expression des antigènes endothéliales comme décrit précédemment^19,20,21. Les échantillons utilisés dans les expériences ont été repiquées minimalement (2 - 3 fois). Tous les travaux de culture de tissus a été effectuée sous une hotte de culture de tissus. Tous les réactifs, y compris les plaques de culture de tissus et de la solutions, sont stériles.
   1. Deux jours avant l’expérience, manteau 100 mm rond plaques de culture de tissus avec 6 mL de collagène de type 1 de 0,05 mg/mL et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
      NOTE : Collagène de Type 1 est dilué dans de l’eau bidistillée contenant de l’acide acétique 20 nM pour une travail de concentration de 0,05 mg/mL.
   2. Le jour avant l’expérience, trypsinize et replate ECFCs sur les plaques de collagène 1 enduit type en 1.1.1. (Voir la Note point 1.1).
   3. Pour trypsinize ECFCs, aspirer les médias de cellules plaqués et laver avec 7 mL de PBS. Aspirer les PBS, puis ajouter 2 à 3 mL de trypsine de 0,5 % et incuber les cellules pendant 2-5 min à 37 ° C.
   4. Immédiatement après l’incubation avec la trypsine, ajouter 3 mL d’EGM2 et pipette de haut en bas pour déloger toutes les cellules adhérentes. Transfert en suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL.
   5. Centrifuger les échantillons à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
   6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension pastilles de cellule dans 1 à 2 mL de EGM2. Bien mélanger la suspension cellulaire et enlever une petite aliquote (20-40 μL) pour le comptage.
   7. Ajouter le bleu de trypan parts égales à la cellule aliquote et déposer 10µl sur un hémocytomètre. Compter le nombre de cellules dans les quatre quadrants primaires de l’hémocytomètre.
      Remarque : Utilisez les deux côtés de l’hémocytomètre pour tous les comptages de l’échantillon pour augmenter la précision.
   8. Laver les plaques de culture de tissu enduit de collagène, qui ont été établis à l’étape 1.1.1, deux fois avec 7 mL de PBS. Après aspiration du deuxième lavage PBS, ajouter 10 mL de milieu de croissance endothéliale 2 (EGM2) culture médias additionné de sérum de veau fœtal de 10 % pour les plaques.
   9. En utilisant le nombre de cellules obtenu à l’étape 1.1.7, calculer le volume de suspension cellulaire pour cellules⁵ plaque 4 x 10. Plaque 4 x 10⁵ ECFCs sur les plaques de culture de tissus préparés à l’étape 1.1.8 et incuber à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) pendant la nuit.
2. Avant l’expérience, stocker des fournitures à 4 °C la nuit
   1. Stocker une plaque de métal de 3 "x 2", slide (Gardez en paquet jusqu'à l’ouverture dans le capot), une boîte de stériles 20 conseils de microlitre (μL) et matrix (matrice) de la membrane basale.
      Remarque : La matrice est conservée à-80 ° C pour le stockage à long terme ; toujours décongeler à 4 ° C pendant la nuit ou pendant plusieurs heures avant de les utiliser.
3. Confirmer la disponibilité d’un espace suffisant pour les images sur des disques durs de l’ordinateur.
   Remarque : L’utilisation de la configuration décrite dans le présent protocole, environ 60 gigaoctets (Go) d’espace étaient tenus par expérience (4 GB/puits). Cependant, les estimations de l’espace sont basées sur la configuration matérielle et devront être déterminée pour chaque système.

2. Protocole 1 : Montage expérimental : préparation de la diapositive

1. Rassembler et préparer les fournitures
   1. Le jour de l’expérience, rassemblez les fournitures pour les cellules dans la diapositive, y compris un seau de glace, un petit récipient de glace sèche, une paire de ciseaux et une pipette 20 μL de placage. Tous les éléments de pulvérisation avec l’éthanol à 70 %, essuyez avec du papier absorbant et placer des éléments dans une hotte de vitroplants stérile.
   2. Rassemblez toutes les fournitures stockés à 4 ° C (Voir l’étape 1.2) y compris la plaque de métal, boîte de conseils, diapositive et matrice. La boîte de conseils de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et placer la boîte dans le bac de glace sèche.
      Remarque : supprimer la matrice dans le frigo de 4 ° C seulement lorsque vous êtes prêt à utiliser et toujours garder la matrice sur la glace.
   3. La plaque métallique de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et incorporez-le dans la glace dans le bac à glaçons. Ouvrez le package qui contient la diapositive et placer la lame sur la plaque métallique pour le maintenir froid.
2. Matrice de charge sur le toboggan
   1. Affectez à la pipette 10 μL et sortir l’embout du boîte de pointe froide avec la pipette. Couper environ 1 cm de l’extrémité de la pointe avec des ciseaux.
      Remarque : coupe perpendiculaire à la pointe pour réduire les bulles dans la matrice. La pipette peut être sur un volume légèrement supérieure à 10 μL pour tenir compte de la matrice s’en tenir à l’intérieur de la pointe.
   2. Tirer lentement la matrice dans l’embout de la pipette. Placer immédiatement l’embout de la pipette sur le centre du puits. Toucher doucement l’embout de la pipette au fond du puits et retirer lentement la matrice.
      Remarque : ne pas sur la pipette, car cela causera bulles au formulaire. Si une forme de bulle, pop immédiatement à l’aide d’une petite astuce.
   3. La diapositive contient 15 puits individuels. Répétez l’étape précédente pour chaque puits. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits pour maintenir l’uniformité et réduire la solidification de la matrice à l’intérieur de la pointe.
   4. Une fois que la diapositive est dotée de tous les puits contenant la matrice, poussez le couvercle complètement sur la diapositive et incuber à 37 ° C pendant 30 à 60 min, jusqu'à ce que la matrice se solidifie.
      Remarque : Ne laissez pas la matrice dessécher. Ajouter un petit volume (2 à 3 mL) de PBS dans le bouchon d’un tube conique de 50 mL près de la lame dans l’incubateur pour réduire le risque de séchage de la matrice.

3. Protocole 2 : Placage ECFCs sur la matrice

1. Retirer adherent ECFCs de plaques de culture de tissus et récupérer en suspension
   1. Obtenir les plaques contenant les ECFCs plaqués la veille (voir la section 1.1.9) de culture de tissus. Aspirer EGM2 médias et laver adherent ECFCs une fois avec 7 mL de PBS.
   2. Aspirer les PBS, ajouter 2 à 3 mL de trypsine et incuber les cellules adhérentes pour 2 à 5 min à 37 ° C.
   3. Immédiatement après l’incubation, ajouter 3 mL d’EGM2 et pipette de haut en bas pour déloger toutes les cellules adhérentes. Transfert en suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL.
   4. Répétez les étapes 3.1.1-3.1.3 pour trois autres échantillons ECFC jusqu'à ce que tous les échantillons de quatre cellules sont recueillies en suspension.
2. Préparer des mélanges maîtres
   1. Centrifuger les échantillons à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
   2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension pastilles de cellule dans 1 à 2 mL de EGM2.
   3. Bien mélanger la suspension cellulaire et enlever une petite aliquote (20-40 μL) pour le comptage.
   4. Ajouter le bleu de trypan parts égales à la cellule aliquote et distribuer 10 μL sur un hémocytomètre. Compter le nombre de cellules dans les quatre quadrants primaires de l’hémocytomètre.
      Remarque : Utilisez les deux côtés de l’hémocytomètre pour tous les comptages de l’échantillon pour augmenter la précision.
   5. À l’aide de la cellule compte d’en haut, calculer le volume de chaque échantillon de cellules qui contient les cellules de⁴ 1.4x10. Bien mélanger tous les suspensions cellulaires et aliquote 1.4 x 10⁴ cellules dans un nouveau tube pour préparer un mélange maître pour chaque condition expérimentale. Ajouter des éléments multimédias EGM2 pour que le volume final de chaque mélange maître soit 175 μL.
   6. Mélanger chaque maître de pipetage et aliquote doucement 50 μL de mélange maître dans les puits individuels sur la diapositive.
      Échantillons NOTE : toutes sont plaqués en triple exemplaire, mélanges maîtres calculés pour 3,5 puits afin d’assurer un volume suffisant pour 3 puits.
3. Incuber la lame
   1. Incuber la lame à 37 ° C jusqu'à ce qu’il peut être amené dans l’enceinte de microscope pour l’imagerie.
      Remarque : Le temps entre l’électrodéposition et l’imagerie doit être aussi bref que possible limiter la perte de données durant les premiers stades de la vasculogénèse.

4. le protocole 3 : Configuration de Microscope et Acquisition d’images

NOTE : Pour nos études, protocoles 2 et 3 ont été menées simultanément par des individus distincts. Si les protocoles 2 et 3 doit être remplie par la personne même, protocole 3 étapes 4.1 et 4.2 ci-dessous doivent être remplis avant d’instaurer le Protocole N° 2 ci-dessus.

1. Allumez le microscope et l’ordinateur
   1. Environ une à deux heures avant de commencer l’expérience, allumez et préchauffer l’incubateur de stade supérieur à 37 ° C, régler le CO₂ à 5 % et définir le taux d’humidité à 85 %. Remplissez le réservoir d’humidité de l’incubateur, si elle est vide.
   2. Placez une diapositive vide chambrée dans l’un des deux postes ouverts et remplissez-le d’eau distillée. Fixez le thermomètre de rétroaction pour contrôler la température chambre, si elle est disponible.
      Remarque : Si le thermomètre de rétroaction est disponible, utilisez cette « température de l’incubateur » pour vérifier que la chambre a équilibrée.
   3. Allumez un ventilateur secondaire la valeur 39-42 ° C pour chauffer les lames par en dessous et réduire la condensation.
   4. Ajouter une deuxième diapositive comme blanc jusqu'à ce que la diapositive expérimentale peut être ajoutée. Cette diapositive sert d’espace réservé emplacement pour la configuration des paramètres image acquisition pour puits individuels lors de l’installation.
   5. Ajouter de l’eau dans le réservoir qui entourent les puits sur la deuxième diapositive pour imiter les conditions lors de l’expérience d’imagerie. L’eau entourant les puits permet d’évaluation de l’humidité au cours de la configuration de microscope et préchauffage.
      NOTE : Avant l’équilibration de la scène-haut incubateur et ventilateur secondaire est essentielle pour maintenir un environnement stable de la culture. Plupart des contrôleurs chambre de cellules vivantes donnent une rétroaction en temps réel de la température, CO₂et l’humidité pour évaluer l’état de préparation du système. Avant de continuer, vérifiez l’accumulation d’humidité dans la diapositive et un séchage excessif du réservoir comme renseigné 4.1.5. Humidité peut devoir être ajustée s’il y a séchage excessif ou la condensation dans la chambre. Pour augmenter l’humidité, ajouter lingettes imbibés d’eau distillée. Pour réduire la condensation, soit diminuer le réglage de l’humidité tels que rajustés en 4.1.1 ou condensation peut être un signe de basse température, vérifier les réglages de température de la chambre et le positionnement du ventilateur secondaire.
2. Configurer les paramètres de base image acquisition au cours de l’équilibration.
   NOTE : l’acquisition est configurée via le logiciel qui contrôle le stade, obturateur et la caméra. Un outil d’installation multidimensionnelle est la meilleure façon de configurer le logiciel. En outre, le logiciel devra avoir des routines de mise au point automatique pour assurer le contrôle de la mise au point au cours de la durée de l’expérience.
   1. Le logiciel permet de paramétrer plusieurs postes de scène pour chaque puits. Pour ce protocole, sélectionnez le Centre des puits.
   2. Configurer l’acquisition d’image telle que dans chaque position de l’étape, l’ensemble est bien imagé. Par exemple, utiliser un tilescan avec chevauchement image 10-20 % et environ 5 x 5 champs, dépendant de la caméra et grossissement final.
   3. Configurer le laps de temps d’imagerie toutes les 15 min.
      Remarque : L’utilisation de la configuration décrite dans le présent protocole, toutes les 15 puits de la diapositive sont imagés dans un intervalle de 15 minutes.
3. Charger la diapositive expérimentale
   1. Après équilibration de la chambre de l’incubateur, remplacez la diapositive vierge par la diapositive expérimentale.
      NOTE : une chambre équilibrée aura une température stable, CO₂et l’humidité pendant au moins 20 min. Une fois que la diapositive expérimentale est prête, il est impératif que les étapes sont effectuées rapidement afin de minimiser le « temps morts » entre le placage et le point de temps initial capturé par le microscope. En outre, pour faciliter la comparaison entre les expériences d’imagerie, ce temps doit correspondre. Dans ces expériences, toutes les étapes décrites dans le protocole 3 Section 4.3 requis environ 30 min pour terminer.
   2. Retirez le couvercle de la diapositive et ajouter de l’eau dans le réservoir qui entourent les puits sur la diapositive.
      Remarque : Le couvercle est retiré pendant la durée de l’expérience d’imagerie.
4. Configurer les paramètres d’acquisition image finale
   1. Placer l’objectif de la FCI Plan Fluor DL 10 X en position et sélectionner l’anneau de phase Ph1 sur le condensateur. Avec le premier puits en bref, régler le parcours lumineux de diascopic pour l’éclairage de Köhler et configurer optique de phase de vérification de l’alignement de l’anneau de phase dans le condensateur avec le masque de phase objective.
   2. Configurer le temps d’exposition et régler l’intensité de la lampe pour contraste de phase, qui est généralement inférieure à 500 ms.
   3. Faire défiler chaque étape position prévue au point 4.2.1 et confirme que le centre du puits est sélectionné et adapter, si nécessaire.
   4. Dans chaque position de l’étape, se concentrer sur les cellules plaqué dans le puits et définir position z de la position stade utilisée pour l’imagerie dans le logiciel.
   5. Tester le mécanisme de mise au point automatique pour le microscope. Si l’autofocus est matériel, s’assurer que c’est sur et bien positionné pour tous les postes de la scène.
      Remarque : comme le modèle et la scène peuvent dériver verticalement pendant l’expérience, il est important que le logiciel vérifie l’autofocus à la position de chaque étape et chaque point de temps pour s’assurer de l’imagerie fiable au cours de l’évolution temporelle. Si possible, une position de mise au point automatique déterminée dans le point précédent de temps devrait servir comme point de départ pour la routine de l’autofocus ultérieures. De cette façon, dérive en cours peut être ajusté facilement pour.
   6. Réduire ou éteindre les lumières dans la salle de microscope et lancer le test d’imagerie.

5. protocole 4 : Image Processing and Kinetic Analysis of vasculogénèse (KAV)

1. Enregistrer des images de moments individuels comme une pile d’image pour chaque puits
   Remarque : plupart des logiciels de capture d’image peuvent exporter des TIFF multipage (cheminées) des séries chronologiques. KAV est conçu pour fonctionner sur des ensembles de données qui peut inclure plusieurs points dans le temps. Ainsi, l’analyse se produit sur la pile de l’image entière pour une position de l’étape donnée. Si nécessaire, logiciel de traitement d’image peut importer des images individuelles de chaque instant pour reconstruire une pile d’image.
2. Ouvrez le logiciel sur l’ordinateur de traitement d’image
3. Ajouter KAV au logiciel de traitement d’image
   1. Faites glisser le fichier KAV d’un dossier dans la barre grise en bas de la fenêtre du logiciel. Cliquez sur « Enregistrer » pour ajouter le logiciel à la liste.
4. Ouvrez la pile d’image à analyser
   1. Cliquez sur « fichier » puis « Ouvrir » dans le menu déroulant dans le logiciel de traitement d’image, ou faites glisser le fichier image dans la barre grise comme au point 5.3.1.
   2. Convertir les images 8 bits en cliquant sur « Image », « Type », '8 bit ».
5. Créer une région d’intérêt (ROI)
   1. Ouvrez le gestionnaire de ROI en cliquant sur « Analyze » dans la barre d’outils. Puis sélectionnez « Outils » suivis par "ROI Manager".
   2. Créer un nouveau ROI en cliquant sur les outils de sélection de cercle ou rectangle dans la barre d’outils et de la zone de sélection désirée de dessin sur l’image. Cliquez sur « Ajouter » dans la fenêtre Gestionnaire de ROI pour sauver cette forme.
      NOTE : Un retour sur investissement créé précédemment peut être ouvertes en faisant glisser sauvé des ROIs (dossier zippé) dans la barre de « Drag and Drop » d’ouvrir dans le gestionnaire.
   3. Cliquez sur l’étiquette de retour sur investissement répertorié dans le gestionnaire de ROI pour la voir sur l’image.
      Remarque : Si le ROI n’apparaîtra pas sur l’image, créez un second retour sur investissement (n’importe quelle taille/forme) et ajoutez-le au gestionnaire. Une fois que les deux ROIs apparaissent dans la liste, cliquez sur en arrière entre les deux et le retour sur investissement souhaité apparaît sur l’image.
   4. Aligner le ROI si nécessaire. Une fois que le ROI est en place sur l’image à l’endroit désiré, allez dans le Menu et cliquez sur « Modifier » puis « Clair à l’extérieur ». Ceci effacera les données d’image à l’extérieur le retour sur investissement (utile pour les formes non rectangulaires) pour chaque image dans la pile.
      Remarque : Vous pouvez également cliquer sur « Image » et « Culture » si vous utilisez un ROI réctangulaire en forme.
6. Lancez le logiciel KAV
   1. Cliquez sur « Plug-ins » dans la barre de menus.
   2. Sélectionnez le réseau « analyser » plug-in. Cela ouvrira une fenêtre avec des options pour modifier les paramètres dans le plug-in.
   3. Changer la méthode de seuillage à l’aide de la flèche déroulante.
   4. Une fois que tous les paramètres appropriés sont sélectionnés, cliquez sur « OK » pour lancer les logiciels de traitement.
      Remarque : Les paramètres appropriés sont déterminés par la visualisation des restitutions squelette et masque généré par KAV, qui témoignent de la précision du logiciel afin d’identifier et de discerner les cellules et les réseaux de fond à l’image de contraste de phase.
7. Enregistrer les données générées par KAV
   1. Une fois le plug-in a terminé l’analyse, deux fenêtres seront affiche à l’écran, y compris une table de données avec des valeurs numériques et une pile d’images fusionnées représentant le squelette et le masque de « restitutions ».
   2. Enregistrez les valeurs numériques en naviguant vers le coin supérieur gauche de la table de données et en cliquant sur « modifier » puis « copier » ou « Cut » pour coller des valeurs dans une feuille de calcul excel.
   3. Cliquez sur l’image de squelette et masque de fusion. Économiser la pile d’image fondu squelette/masque au format TIFF Tagged Image File Format () en cliquant sur « Fichier », « Enregistrer sous » « TIFF ».
   4. Sauver le contraste de phase cropped image pile (créé à l’aide de ROI) en cliquant sur « File, » « Enregistrer sous » « TIFF. »
   5. Cliquez sur la fenêtre Gestionnaire de ROI et sélectionnez le ROI utilisé pour recadrer les images. Cliquez sur « Plus » suivi de « Enregistrer » pour enregistrer le retour sur investissement pour une utilisation future.
      Remarque : En utilisant le même retour sur investissement aidera à maintenir la cohérence dans l’ensemble des analyses.

Representative Results

KAV produit des représentations visuelles de la structure du réseau
Le contraste entre les ECFCs et le fond de la matrice dans les images de contraste de phase permet de KAV identifier les structures cellulaires spécifiques. Réseaux ECFC identifiés par KAV sont représentés visuellement dans le squelette et le masque de « restitutions » pour illustrer les structures utilisées par le logiciel pour la quantification (Figure 2A). Ce qui est important, une évaluation qualitative concernant les restitutions squelette et masque permet l’identification rapide de KAV sensibilité et de précision, qui peut être utile pour déterminer les paramètres de seuil optimal et interpréter les résultats de l’analyse. Lorsque la qualité de l’images de contraste de phase est élevée et un contraste suffisant est atteint, KAV identifie avec précision les réseaux ECFC comme indiqué par la similitude entre l’image de contraste de phase et les restitutions de squelette et masque axé KAV généré (Figure 2 A et vidéo 1).

Alternativement, si les images de contraste de phase n’ont pas de contraste élevé et/ou objets d’imagerie telles que maillage se produisent, la précision de détection réseau est réduite et résultats deviennent ambiguës (Figure 2B). En outre, la formation de bulles d’air dans les milieux cellulaires peut également obnubiler précision de détection (Figure 2). Cependant, des problèmes avec une qualité d’image souvent peuvent être surmontés que par le biais de sélection des méthodes différentes de seuillage inclus dans le logiciel KAV. Par exemple, l’image de contraste de phase dans la Figure 2B a été analysé à l’aide des paramètres de traitement d’image identique à l’exception de la méthode de seuillage. Depuis le squelette et le masque « restitutions », il est évident que le seuillage Otsu donné lieu à une détection plus précise des réseaux ECFC montré dans l’image de contraste de phase (Figure 2B). Par conséquent, la qualité d’image est essentielle à la réalisation des résultats exacts et utiles dans ce test. Toutefois, des méthodes différentes de seuillage incluses dans l’interface utilisateur KAV permettent l’ajustement d’analyse d’images basée sur la qualité des images d’entrée.

Time-lapse microscopie identifie les différences qualitatives et quantitatives dans ECFC vasculogénèse après l’exposition intra-utérine du diabète gestationnel
Récemment, l’approche analytique de KAV a été appliquée pour évaluer la fonction ECFC foetale après une exposition à la maternelle type 2 mellitus de diabète (T2DM) dans l’utérus¹⁶. À l’aide de KAV, cinétique altérée de vasculogénèse ont été identifiées dans ECFCs foetus exposés à T2DM. Cependant, outre le T2DM exposition, qui se produit tout au long de l’ensemble de la gestation, diabète gestationnel (DG) ou le développement de l’intolérance au glucose communément dans le troisième trimestre de la grossesse, altère aussi ECFC fonction¹³. Par conséquent, KAV a été appliqué pour déterminer si exposés au GDM ECFCs affichent également altéré cinétique de formation de réseau ECFC. La phase 1 (0-5 h) et Phase 2 (5 + h) ont été évalués à l’aide de temps microscopie déchéance couplée à l’analyse KAV (Figure 3). Images de contraste de phase représentative acquis au début de l’acquisition d’images (0,50 h) et tout au long de l’évolution temporelle (5.00 et 10.00 h) dépeignent formation réseau ECFC dans les quatre échantillons testés d’une seule journée expérimentale (Figure 3 et vidéo 1 ). Malgré la cellule équivalente de chargement, tel qu’observé dans les images de contraste de phase à 0,50 h, des différences qualitatives dans la structure du réseau sont évidents aux points 5,00 et 10,00 heures de temps. ECFCs de la grossesse sans complication (UC) forment un réseau complexe post-électrodéposition, semblable à nos données publiées antérieurement à¹⁶heures. À l’inverse, ECFCs de GDM échantillon 1 formulaire (GDM1) très peu de réseau des structures qui ne sont pas interconnectées. Toutefois, ce modèle n’est pas reflété dans tous les échantillons ECFC provenant de grossesses GDM, indicatives de l’hétérogénéité entre les échantillons. Échantillons GDM2 et GDM3 affichent une plus grande formation de réseau par rapport à GDM1, bien que les profils de connectivité semblent altérées par rapport à l’échantillon de l’UC. Ce qui est important, KAV mesure plusieurs composantes structurelles des réseaux ECFC pour identifier des phénotypes évidents et subtiles.

En plus de générer le squelette et le masque de « restitutions » de la structure du réseau, KAV quantitates dix mesures de structure de réseau, y compris le nombre de structures de réseau individuel, nœuds, nœuds ramifiés en triple, quadruple ramifiés nœuds, branches, totales la longueur des branches, la longueur des branches, réseaux de succursales au ratio de nœud, total fermé et réseau zone¹⁶. KAV compile les données pour chaque échantillon dans une seule table de valeurs pour toutes les images de l’évolution temporelle. Tableau 1 inclut les données brutes représentatives d’une étude d’imagerie pour un échantillon ECFC. Paramètres de structure de réseau mesurée par KAV sont organisées en colonnes et les données de séquence d’images acquises au fil du temps sont organisées en lignes. D’exemple, dans nos études, image 1 a été obtenu le placage après 30 min avec les images suivantes étant recueillies chaque 15 min. des valeurs brutes générées par KAV peut alors être représenté graphiquement ou encore analysées à l’aide de statistiques plus complexes des approches¹⁶.

Cinq graphiques représentant les valeurs moyennes de la structure du réseau de trois expériences distinctes sont indiqués pour un seul échantillon non compliqué (UC) et les trois échantillons GDM (Figure 4). L’échantillon de l’UC dans ces expériences réalisées de la même façon à précédemment analysé UC échantillons¹⁶. Auparavant, il a été identifié que ECFC vasculogénèse in vitro est biphasée, consistant en Phase 1 (0 - 5 h) et Phase 2 (5-10 h)¹⁶. Ce modèle est compatible dans les études actuelles, comme en témoigne le graphique représentant les données réseau fermé (Figure 4). L’exemple de l’UC forme un plus grand nombre de réseaux fermés par rapport à tous les trois des échantillons GDM. Fait intéressant, trois des quatre échantillons semblent avoir un temps similaire au nombre maximal des réseaux fermés, qui se produit entre 2,5 et 3 heures. Toutefois, l’échantillon de GDM2 était plus lent atteindre maximales réseaux fermés, qui a eu lieu 5 heures après ensemencement. Et, malgré l’exemple de GDM2 formant moins réseaux maximales par rapport à l’échantillon de l’UC, les réseaux qu'il forme ont été maintenues de même à l’échantillon de l’UC au fil du temps. À l’inverse, GDM1 et GDM3, qui forment des réseaux moins par rapport à l’échantillon de l’UC, également exposé une réduction globale de numéro de réseau au fil du temps. Dans l’ensemble, partir du graphe représentant le numéro de réseau interne, il est évident que tous les échantillons ECFC affichent un motif biphasée de formation du réseau, mais le taux de formation et le nombre maximal de réseaux obtenus varient selon les échantillons.

La zone du réseau représente la superficie moyenne au sein des réseaux fermés, formée par les ECFCs. Par conséquent, plus le réseau fermé est élevé, plus le réseau espaces. Cette tendance se reflète dans les graphiques de zone de réseau où l’échantillon de l’UC, qui a formé un grand nombre de réseaux fermés, avait des petites zones de réseau au fil du temps par rapport aux trois échantillons de GDM (Figure 4). GDM2, qui atteint les réseaux fermés maximales plus lentement, présentaient la zone du réseau haute initialement, cependant la zone stabilisée dans le temps et c’était plus semblable à l’exemple de l’UC à 15 heures. Au fil du temps, la zone du réseau moyenne dans tous les échantillons ont augmenté en raison de la déstabilisation du réseau. Cependant, certains échantillons, tels que GDM1 et GDM3, présentaient une augmentation plus rapide dans la zone du réseau, qui indique probablement une diminution stabilité par rapport aux autres échantillons présentant une augmentation plus graduelle.

GDM-exposés ECFCs présentent une stabilité de réseau réduite
Le rapport entre les branches aux nœuds est un nouveau phénotype calculé par KAV et identifiés dans nos études précédentes, et c’est révélateur de la connectivité de réseau¹⁶. Dans la présente étude, l’échantillon de l’UC avait un faible ratio, qui représentait un haut niveau de connectivité réseau qui s’est maintenue au fil du temps (Figure 4). Inversement, les trois échantillons GDM ont un ratio plus élevé de branches aux nœuds, surtout dans la Phase 2 de formation réseau. Cette observation montre une connectivité réduite et déstabilisation des structures de réseau.

Dans l’ensemble, GDM1 formé moins de nœuds et de succursales par rapport aux autres échantillons, avec la réduction maintenue au cours de l’expérience. GDM2 et GDM3 forment et maintient un plus grand nombre de branches par rapport à l’échantillon de l’UC, en particulier entre 5 à 15 h. Le nombre de nœuds dans les réseaux GDM2 et GDM3 ressemblaient davantage au nombre de nœuds dans l’échantillon de l’UC, surtout entre 10 à 15 h. Un plus grand nombre de branches, mais le même nombre de nœuds, pourrait expliquer la branche accrue au ratio de nœud évident aux points de temps plus tard dans les échantillons GDM. Ce qui est important, changements simultanés dans le numéro de succursale et nœud peuvent être difficiles à interpréter dans les graphes distincts. Toutefois, la nouvelle branche ratio nœud propose un moyen d’évaluer comment les changements, y compris légèrement difficile à déceler dans les graphiques individuels, dans le numéro de succursale et de nœud, aboutir à une connectivité réseau altérée.

Figure 1 : Schéma décrivant 10 paramètres quantifiés par analyse cinétique de vasculogénèse (KAV). KAV quantitates dix paramètres distincts de la structure du réseau. Tous les paramètres sont à codes de couleur et décrites dans le schéma numérique (1-10). Les paramètres incluent le nombre de réseaux de succursales (vert, 1), fermés (bleu, 2), et nœuds (rouge, 3), en moyenne zone du réseau (orange, 4), le nombre de structures de réseau (noir, 5), ramifiés en triple nœuds (jaune, 6) et ramifiés en quad-nœuds ("purple", 7), ainsi que le montant total (9) et moyenne longueur de branche (10) et le rapport entre le nombre de branches au nombre de nœuds (10). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse cinétique de vasculogénèse (KAV) quantitates structure réseau. (A) squelette et masque « restitutions » des structures de réseau identifiés par KAV utilisant une phase images contrastées offrent une représentation visuelle des structures de réseau identifiés et quantifiés par KAV. Echelle = 500 µm. (B) une image de contraste de phase représentative du ECFC réseaux 10 h après cadmiage disposant de faible contraste et grille de marques résultant d’assembler des images individuelles. Seuillage différentes méthodes, telles que la moyenne ou Otsu, peuvent être combinées dans le plug-in de KAV pour améliorer la précision de dosage, si les images de contraste de phase ont faible contraste ou en cas de maillage. Restitutions squelette et le masque de l’image de contraste de phase sont indiquées pour les méthodes de seuillage moyenne tant Otsu. Images de contraste de phase ont été capturées à l’aide d’un objectif 10 X. Echelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : L’exposition intra-utérine GDM altère la formation réseau ECFC. Images de formation réseau ECFC furent capturés à intervalles de 15 min pour 15 h par microscopie à contraste de phase. Images de contraste phase représentative par tranches de 5 h, départ au moment de l’ensemencement (0,5 h), sont indiqués pour l’UC et trois exemples GDM. Images de contraste de phase ont été capturées à l’aide d’un objectif 10 X. Echelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : ECFCs exposés à intra-utérine GDM pièce altérée réseau formation cinétique. ECFCs ont été extraites d’une grossesse sans complication (UC, noir) et trois grossesses compliquées de diabète gestationnel (GDM 1-3, rouge). Images de contraste de phase ont été capturés à 15 min intervalles pendant 15 h. analyse cinétique de vasculogénèse (KAV) logiciel dosé fermés réseaux, réseau, branches, nœuds et le rapport entre les branches aux nœuds. Les données illustrées représentent la moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM) des trois expériences distinctes pour chaque échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : L’exposition intra-utérine GDM modifie la cinétique de formation réseau ECFC. Images de formation réseau ECFC furent capturés à intervalles de 15 min pour 15 h par microscopie à contraste de phase. Images de contraste de phase sont indiqués pour l’UC et de trois échantillons de GDM sur une période de 15 h à partir de 0,5 h. La barre d’échelle représente 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Image	Réseaux de succursales total	Nœuds	Triples	Quadruples	Branches	Longueur totale branche *	Longueur de branche de AVG *	Crée une branche vers le nœud Ratio	Réseaux fermés	Réseau secteur **
1	382	290	278	11	943	47210	124	3.25	9	480214
2	284	345	337	8	940	50699	179	2.72	16	264469
3	205	376	366	9	910	55728	272	2.42	27	150621
4	162	422	407	15	947	59692	368	2.24	40	98713
5	132	454	441	12	967	61923	469	2.13	53	72951
6	122	435	419	14	907	62587	513	2.09	68	56948
7	88	429	411	17	852	63983	727	1.99	74	51429
8	68	451	437	13	874	63960	941	1,94	74	51780
9	93	437	417	18	905	60901	655	2.07	49	82919
10	126	511	487	24	1075	61981	492	2.1	37	116857
11	49	397	384	12	737	61823	1262	1,86	79	48805
12	81	376	364	10	751	56817	701	2	63	64431
13	98	509	482	26	1028	60799	620	2.02	44	98056
14	93	449	416	31	909	58282	627	2.02	45	94081
* arrondi au plus proche micron, ** arrondi au plus proche micron ^ 2

Tableau 1 : Des données brutes représentatives d’une imagerie étudient pour un échantillon ECFC.

Discussion

KAV permet l’évaluation de grands ensembles de données avec plusieurs points dans le temps
Traditionnellement, quantification de la vasculogénèse in vitro a consisté à un seul ou quelques mesures ponctuelles de temps. Cette approche statique est tout simplement insuffisante pour la capture et de quantifier un processus dynamique et complexe. Par conséquent, cette nouvelle méthode a été développée pour permettre une analyse efficace de la cinétique de formation du réseau pour avoir un aperçu des éventuels mécanismes moléculaires impliqués dans le processus dynamique de vasculogénèse. L’efficacité et l’automatisation sont des éléments importants dans le développement de nouvelles techniques pour générer et analyser de grandes quantités de données d’imagerie. KAV a été développé spécifiquement pour analyser les piles d’image grand consistant en des centaines d’images pour diminuer le temps et la main-d'oeuvre requise pour tirer des conclusions significatives sur le plan biologique d’ensembles de données time-lapse. Important, KAV effectue le traitement de l’image et la génération de données en quelques secondes pour les petits (moins de 100 images) image piles et minutes pour plus grand (plus de 100 images) image de piles, ce qui entraîne une efficacité inégalée. En outre, Organisation des données dans des tableurs par le temps et les paramètres mesurés permet la génération rapide de présentation graphique et l’analyse statistique.

Difficultés dans l’application réussie de cette approche
Bien que ce test inclut des améliorations pour l’acquisition d’images et l’analyse, certains obstacles susceptibles d’entraver mise en œuvre réussie. Les quatre principaux obstacles comprennent la stabilité de l’humidité, précision de chronométrage de placage à acquisition d’images, logiciels et matériel fiabilité et gestion de grands ensembles de données généré pour chaque expérience. L’imagerie de cellules vivantes stable pendant plusieurs heures peut être difficile. Plus précisément, humidification appropriée et compatible est requise pour les chambres d’imagerie. Angiogenèse diapositives sont utilisés dans ce test, qui sont conçus pour la parallélisation des dosages de l’angiogenèse axée sur la matrice. Leur faible volume, environ 50 µL, rend l’évaporation et condensation des considérations importantes pour les conditions de culture prolongée. Pour lutter contre ce problème expérimental, il est nécessaire d’utiliser un incubateur qui régule l’humidité. Toutefois, il peut être également nécessaire d’augmenter ce règlement si un séchage excessif de la chambre d’imagerie se produit au fil du temps. Nous avons trouvé que l’approche la plus simple pour augmenter l’humidité est d’augmenter la surface de l’eau dans la chambre. Pour atteindre cet objectif, notre protocole suggère les trois sources d’eau suivantes : une deuxième diapositive chambrée rempli d’eau, qui est également où la température de l’incubateur est mesurée, l’eau dans la zone entourant les puits sur les diapositives et humidifié papier-filtre ou les lingettes. À l’inverse, la condensation se produit lorsque la température de l’air dans la pièce refroidit le bas de la lame et de l’humidité à l’intérieur de la chambre se condense sur les diapositives et les puits. Cette complication peut conduire à une dilution des médias cellulaire et un effet de lentilles qui interfère avec le contraste de phase. Dans ces études, condensation était réduite par application d’air chaud (39-42 ° C) sur le fond de la diapositive.

Un facteur important dans toute étude Time-lapse est la cohérence entre l’amorce de l’expérience et l’imagerie. Le moment du démarrage de l’imagerie est essentiel pour l’interprétation des événements en aval. Afin d’assurer la précision de chronométrage de cette épreuve, le temps entre les ensemencements initiaux et le premier point de l’image temps devrait être étroitement contrôlé. Dans la pratique, ce « temps mort » peut être minimisé, mais plus important encore, il doit être cohérent pour permettre des expériences sur des jours différents à comparer. Par exemple, dans le présent protocole, nous prévoyons un temps mort d’environ 30 min. Cela peut être facilité par la proximité de préparation expérimentale et d’établissements d’imagerie.

Ce qui pourrait sembler détails banals à première vue sont importants pour le logiciel, la stabilité du matériel et gestion des données. Logiciel et pilotes matériels connexes, environnement réseau et un logiciel automatisé met à jour tous les affectent la stabilité du logiciel. Il convient de tester ce protocole dans un « dry run » pour identifier les goulets d’étranglement et les sources potentielles de problèmes dans l’acquisition de l’image ; par exemple, vérifier pour l’installation de cellules vivantes non fiable, fiabilité stade, obturateur et appareil photo et les politiques de technologie d’information institutionnelle sur automatisé système d’exploitation et des mises à jour logicielles.

Gestion des données est une préoccupation constante de toute expérience d’imagerie qui génère des centaines de milliers d’images. Heureusement, un logiciel commercial souvent vérifie l’espace disponible avant de commencer une expérience d’imagerie. Toutefois, ce test comprend également des traitement de l’image après capture et d’analyse qui peut ajouter à la charge d’espace de disque dur et interférer avec l’imagerie des expériences, si l’espace disponible est limité. En outre, la sécurité et la stabilité de l’ordinateur ne peuvent être garanties, même avec des solutions de matériel comme une baie redondante de disques identiques. Ainsi, une stratégie de gestion des données pour s’assurer de l’espace sur les disques durs de l’ordinateur pour des expériences en cours et un robuste archivage de distant, par exemple avec une ressource d’archivage institutionnelle, est nécessaire.

Stratégies pour maximiser la qualité d’Image
Bien que la capacité de KAV à discerner avec précision ECFCs de l’arrière-plan de la matrice est robuste, la sensibilité du test est tributaire de la qualité d’image. Par exemple, si l’image a faible contraste, le logiciel détectera les réseaux de cellules avec moins de précision (Figure 2B). La qualité du contraste de phase est influencée par plusieurs facteurs, y compris les réglages du microscope utilisé pour l’acquisition d’images, chargement de la matrice et le support de suspension cellulaire au cours de la préparation de l’essai et maintien des niveaux de médias dans les puits tout au long de l’imagerie. Pour optimiser le contraste de phase de ces tests, des ajustements mineurs à l’alignement d’anneau de phase dans le microscope ont été faites pour améliorer le contraste. En outre, préparation de l’échantillon a été rigoureusement testée pour assurer le chargement des médias égale et uniforme. Si la quantité de matrice et/ou média chargé dans les puits est soit inférieure ou supérieure à l’intervalle optimal, un ménisque peut se former menant à contraste de phase altérée. Enfin, en raison du faible volume de liquide dans les puits, il est essentiel de maintenir des niveaux de médias en minimisant l’évaporation et condensation, comme indiqué plus haut. Dans l’ensemble, optimisation de l’analyse est essentielle pour générer des images de contraste de haute qualité pour l’analyse.

En plus de la qualité de contraste de phase, autres facteurs peuvent également avoir des répercussions résultats test y compris la contamination des médias, des imperfections dans la matrice et les particules ou débris dans la matrice ou les médias. Contamination est un danger de ce test, puisqu’il s’agit de l’imagerie de cellules vivantes pendant plusieurs heures dans une chambre de microscopie. Pour réduire le risque de contamination, les suspensions de la matrice et les cellules sont chargées sur la diapositive dans une hotte stérile. En outre, chaque échantillon est généralement plaquée en double ou triple exemplaire pour une expérience visant à minimiser le risque de perte de données due à des problèmes imprévus tels que des débris ou des particules, l’analyse de la confusion.

Échantillon hétérogénéité lecteurs ont besoin de sensibilité accrue
L’hétérogénéité a été observée et rapportée dans les études précédentes de ECFCs exposés à GDM¹³. Un haut niveau d’hétérogénéité en fonction de la cellule observée dans ces échantillons est supposé pour être attribuable à plusieurs facteurs, y compris la gravité de la maladie maternelle, la durée de la maladie et style de gestion servant à régulariser la glycémie. Ce qui est important, cette approche analytique tient la gamme dynamique de ECFC vasculogénèse, rendant possible d’identifier des différences phénotypiques en raison de l’hétérogénéité fonctionnelle dans les échantillons de grossesses GDM. Dans l’ensemble, l’utilisation d’échantillons de patients primaires, tels que ceux utilisés dans ces études, peut introduire une plus grande variabilité comparée à une lignée de cellules. Comme est davantage l’accent sur des études translationnelles impliquant plusieurs échantillons animaux ou humains primaires avec variabilité fonctionnelle, la sensibilité est essentielle pour la détection et la dérivation des mesures significatives sur le plan biologique et des conclusions. Par conséquent, développement d’approches comme KAV permettra d’améliorer la quantité et la qualité des données généré par angiogenèse et in vitro vasculogénèse essais pour permettre des observations et des conclusions plus robuste. En outre, ces données faciliteront la future enquête sur les mécanismes moléculaires sous-jacents qui contribuent à l’altération ECFC vasculogénèse après une exposition intra-utérine GDM.

Applications futures de cette approche
Bien que cette méthode a été appliquée pour évaluer les foetus ECFC vasculogénèse in vitro dans ces études, les applications potentielles de cette approche sont nombreux. Cette technique peut être facilement implémentée afin d’étudier une population cellulaire qui participe au processus de vasculogénèse ou angiogenèse. Plus précisément, il peut être utilisé pour étudier les populations de cellules individuelles, comme l’a démontré dans cette étude, mais elle pourrait également être appliquée à des systèmes de co-culture. À l’avenir, il serait utile d’étendre cette approche au-delà de l’analyse bidimensionnelle en vitro pour évaluer des modèles tridimensionnels (3D). Bien que la dernière version de KAV ne suffirait pas pour la quantification des données d’imagerie 3D, une approche analytique Time-lapse, multi paramétrique de même conçue spécifiquement pour les modèles 3D ou en vivo informerait si des observations faites en deux dimensions in vitro , sont représentatifs de la fonction des cellules en milieu biologiquement plus pertinente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Fisher	353003
15 mL conical tubes	Fisher	1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides	Ibidi	81506
Matrigel	Fisher (Corning)	354234
EGM2 Medium	Lonza	CC3162
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic	Fisher	MT30004C1	Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS	Fisher (Corning)	MT25052CI
Type 1 Collagen	Fisher (Corning)	354226	100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL.
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-212	Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM.
Kim Wipes	Fisher	06-666
Chambered slide	Ibidi	80296	This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher (Gibco)	20012027	1x solution, pH 7.2
Microscope	Nikon Instruments	MEA53100 and MEF55030	Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage	Prior Instruments	ProScan II	Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective	Nikon Instruments	93178	CFI Plan Fluor DL 10X
Camera	Hamamatsu	C11440-42U	ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower	Precision Controls	N/A	This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator	OKOLabs	H301	BoldLine including a two position slide holder
Computer	Hewlett-Packard	Z620 or equivalent	4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	AR v 4.20	ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis