Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה בצילום מואץ והשלב ניתוח של vasculogenesis במבחנה באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת יחד עם התוכנה בקוד פתוח, ניתוח קינטי של Vasculogenesis. פרוטוקול זה ניתן ליישם באופן כמותי להעריך את הפוטנציאל vasculogenic של סוגי תאים רבים או תנאים ניסיוני דגם מחלת כלי דם.
Abstract
Vasculogenesis הוא תהליך מורכב שבו עוברים גזע אנדותל ותאי קדמון היווצרות כלי דה נובו . הערכה כמותית של vasculogenesis הפך הבדיקה המרכזי של פונקציונליות תא אנדותל קדמון, לכן, נעשו מספר נסיונות לשפר גם במבחנה וגם ויוו מודלים vasculogenesis. עם זאת, בשיטות הרגילות מוגבלים היקף, עם מדידות סטטי נכשל ללכוד היבטים רבים של תהליך דינמי מאוד. לפיכך, היעד של פיתוח פרוטוקול הרומן זה היה כדי להעריך את קינטיקה של במבחנה vasculogenesis על מנת quantitate המחירים של היווצרות רשת וייצוב, כמו גם לספק תובנות פוטנציאליים המנגנונים שבבסיס כלי דם תפקוד לקוי. יישום של פרוטוקול זה הוכח באמצעות עוברית המושבה אנדותל ויוצרים תאים (ECFCs) נחשפים סוכרת אימהית. ECFCs עוברי היו נגזר דם חבל הטבור לאחר הלידה, תרבותי, מצופה בשקופיות המכיל מטריצה קרום המרתף, בה שעברו vasculogenesis. תמונות מן הבארות השקופית כולה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב זמן לשגות מעל 15 שעות. תמונות נותחו עבור נגזרת של נתונים כמותיים באמצעות ניתוח של תוכנה בשם קינטי ניתוח של Vasculogenesis (קו). קו משתמש סגמנטציה ואחריו skeletonization כדי לנתח את רכיבי הרשת הערימות של נקודת זמן רב שלב תמונות חדות להפיק עשרה פרמטרים (נמדד 9, 1 מחושב) של רשת מבנה כולל: סגור רשתות, רשת אזורים, צמתי סניפים, סניף סה כ אורך, סניף ממוצע אורך, צמתי קנים משולשת, צמתי קנים עם ארבע ליבות, מבני רשת, את סניף צומת יחס. יישום של פרוטוקול זה מזוהה שינו שערי vasculogenesis ב ECFCs המתקבל הריונות מסובך בגלל סוכרת. עם זאת, טכניקה זו יש השלכות רחבות מעבר להיקף דיווחו כאן. יישום של גישה זו לשפר הערכה מכניסטית ולשפר את המפרט פונקציונלי של vasculogenesis ותהליכים אחרים חשובים מבחינה ביולוגית מסעף אינספור סוגי תאים או מצבי מחלה.
Introduction
היכולת של אנדותל ובתאים לעבור vasculogenesis, או היווצרות כלי דה נובו , חיוני בהקמת להערכת עובריים במהלך פיתוח1. בנוסף, היווצרות כלי נוסף, ההבשלה של כלי הקיימת מראש, המכונה אנגיוגנזה, היא גם תהליך מפתח בהתפתחות וגם בחיים לאחר הלידה כדי לשמור על זרימת הדם הומאוסטזיס ברחבי הגוף2. כל איבר בגוף תלויה במערכת כלי הדם על אספקה של חמצן וחומרים מזינים, ועל סילוק פסולת3. אם כלי הדם הומאוסטזיס לא נשמרות, כך היווצרות כלי דם ותיקון הם מחסור או עודף, מחלות לב וכלי דם יכול לגרום4. לכן, היווצרות כלי דם והתאמה נפוץ נלמדים, כפי שהם חיוניים תוך שמירה על הבריאות איברים הם מעורבים בפיתוח של מדינות רבות פיפטות.
עקב הבנה מוגברת של המעורבות של מערכת כלי הדם פיתוח, וכן ביטוי המחלה והתקדמות, פותחו מבחני דגם vasculogenesis אנגיוגנזה חוץ גופית בתוך ושל ויוו5 6, ,7. היווצרות כלי מידול כרוך ציפוי כלי דם תאים, כמו תאי אנדותל, במטריצת קרום המרתף המקדם תא הארגון ועל היווצרות כלי רשתות8,9,10. בדרך כלל, בעקבות לילה דגירה, תמונות של תא הרשתות נלכדים בנקודת זמן אחת, וכתוצאה מכך מספר קטן של תמונות עבור ניתוח11,12,13. לכן, גישות אנליטיות יש בעיקר פותחה, אופטימיזציה עבור פעם נקודת הערכות10,14. עם זאת, ניתוח סטטי פשוט אינם מספיקים ב לכידת תהליך דינמי של היווצרות כלי ומספקים מוגבל תובנה מעורבים פוטנציאליים מנגנונים. למרות הדמיה בתדירות הולכת וגוברת ככל הנראה תספק את הנתונים הדרושים כדי לזהות היווצרות קינטיקה, יישום של ניתוח בעבר מפותח לנקודת זמן רב הדמיה הגישה יהיה לא יעיל ודיני אינטנסיבית14. בנוסף, למרות הפיתוח של ניתוחים זמינים מסחרית, תשלום שכר-לכל-תמונה מעבד אפשרות זו שאבטחה ללימודי קינטי, שבה אלפי תמונות הם שנוצר15. לכן, יש צורך בשטח גישה מפושטת ויעילה ללכוד ולכמת vasculogenesis במבחנה, כולל את היכולת לנתח תמונה גדולה ערכות שנוצר על ידי מיקרוסקופ תא חי זמן לשגות.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, גישה חדשה פותחה במטרה להרחיב את נקודת הזמן יחיד הדמיה כדי לאפשר הערכת דינמי של vasculogenesis עם תמונות רכשה כל 15 דקות16. על-ידי לכידתו במספר נקודות זמן על פני מספר שעות, גישה זו מספק תיאור מפורט יותר של התהליך של vasculogenesis, כמו גם תובנה מנגנונים פוטנציאל לתרום היווצרות ותחזוקה של רשתות כלי השיט. בנוסף לשיפור את תדירות ואיכות התמונה רכישה, גישה זו משלבת תוכנה חדשניים בצורה של יישום plug-in קוד פתוח17. התוכנה, מכונה בשם קינטי ניתוח של Vasculogenesis (קו), הוא יישום יעיל המשלבת עיבוד וניתוח תמונה במיוחד עבור ערכות תמונה גדולה המופקים רכישות נקודת זמן רב. קו מנתח לשלב תמונות חדות באמצעות סגמנטציה ואחריו skeletonization18. עשרה פרמטרים של מבנה הרשת הם לכמת על ידי קו כולל: סניפים, רשתות סגורות, צמתים, רשת אזורי, מבני רשת, צמתי קנים משולשת, צמתי קנים עם ארבע ליבות, סניף סה כ אורך, סניף ממוצע אורך ואת הענף צומת יחס (ראה מפרטים טכניים באיור1)16. היישום של הגישה עמותת קו כולל הפנוטיפ הרומן, מחושבת של במבחנה vasculogenesis, המכונה את סניף צומת יחס. העבודה האחרונה שלנו הוכיח כי יחס זה מרמז על קישוריות רשת, עשויה להיות קשורה אחרים תהליכים תאיים המעורבים היווצרות רשת, כגון תנועתיות16.
למרות העובר המושבה אנדותל ויוצרים תאים (ECFC) vasculogenesis נאמד במחקרים אלה, ניתוח של רכישת גישה זו התמונה ניתן להחיל בקלות כדי להעריך את כל סוגי תאים עוברים vasculogenesis או אנגיוגנזה. בנוסף, גישה זו ניתן לזהות שינו תפקוד כלי דם כתוצאה ממגוון רחב של מדינות פיפטות, כגון סוכרת הריונית, כפי שמוצג במחקרים אלה. יתר על כן, שיטה זו יכולה להתאים להעריך היווצרות רשת הסתעפות, אשר חשובים עבור תהליכים ביולוגית רלוונטיים אחרים. לכן, ההשפעה הפוטנציאלית של החלת גישה חדשנית זו ייחודית מערכות ביולוגיות הוא עדיין נקבע.
Protocol
1. תכשירים
-
המושבה אנדותל תרבות ויוצרים תאים (ECFCs)
הערה: ECFC עוברי דגימות המשמשות בניסויים אלה היו מבודד דם טבורי אנושי, תרבותי על ידי אנגיוגרפיה BioCore (ABC)-אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת כפי שתואר לעיל6. Phenotyping בקרת איכות שגרתית נערכה בתחום ABC לאשר ביטוי אנטיגנים אנדותל כפי שתואר לעיל19,20,21. דגימות המשמשות בניסויים היו passaged מינימלית (2 - 3 פעמים). כל תרביות רקמה העבודה בוצעה בשכונה תרביות רקמה. כל ריאגנטים, כולל לוחות תרביות רקמה ופתרונות, היו סטריליים- יומיים לפני הניסוי, מעיל 100 מ מ מסביב תרביות רקמה צלחות עם 6 מ של קולגן מסוג 1 0.05 מ"ג/מ"ל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: קולגן מסוג 1 הוא מדולל במים מזוקק פעמיים המכיל חומצה אצטית nM 20 ריכוז העבודה של 0.05 מ"ג/מ"ל. - היום לפני הניסוי, trypsinize, replate ECFCs על סוג הקולגן 1 מצופה הלוחות ב 1.1.1. (ראה הערה מתחת 1.1).
- כדי trypsinize ECFCs, תשאף מדיה מתאי מצופים, לשטוף עם 7 מ של PBS. האחות PBS, ואז להוסיף 2-3 מ"ל של 0.5% טריפסין דגירה תאים למשך 2-5 דקות ב 37 º C.
- מיד לאחר דגירה עם טריפסין, להוסיף 3 מ"ל של EGM2 ושל pipet למעלה ולמטה מכך כל תאים חסיד. להעביר תא ההשעיה צינור חרוטי 15-mL.
- Centrifuge כל דוגמאות ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות תגובת שיקוע, מחדש להשעות תא כדורי ב- 1-2 מ ל EGM2. לערבב התליה תא ביסודיות ולהסיר aliquot קטנה (20-40 μL) עבור ספירה.
- להוסיף חלקים שווים trypan blue תא aliquot, פיפטה 10 µL אל hemocytometer. לספור את מספר התאים ארבעת הרביעים הראשי hemocytometer.
הערה: השתמש בשני צידי hemocytometer בכל הסעיפים לדוגמה כדי להעלות את רמת הדיוק. - לשטוף את הצלחות תרביות רקמה מצופים קולגן, אשר הוכנו בשלב 1.1.1, פעמיים עם 7 מ של PBS. לאחר כ רפה בעברית לשטוף את השני PBS, להוסיף 10 מ"ל של מדיום הגידול אנדותל 2 (EGM2) תרבות המדיה בתוספת 10% סרום שור העובר אל צלחות.
- באמצעות הסעיפים תא שהושג בשלב 1.1.7, לחשב את הנפח של תא ההשעיה הנדרש לתאים5 צלחת 4 x 10. צלחת 4 x 105 ECFCs על לוחות תרביות רקמה מוכנה בשלב 1.1.8, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2) בן לילה.
- יומיים לפני הניסוי, מעיל 100 מ מ מסביב תרביות רקמה צלחות עם 6 מ של קולגן מסוג 1 0.05 מ"ג/מ"ל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
-
לפני הניסוי, לאחסן ציוד 4 °C בלילה אחד
- חנות 3 "x 2" פלטת מתכת, שקופיות (זכור כי החבילה עד פתח בהוד), קופסת סטרילי 20 טיפים microliter (μL), קרום המרתף מטריקס (matrix).
הערה: המטריקס נשמרת ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך; תמיד להפשיר אותו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או במשך מספר שעות לפני השימוש.
- חנות 3 "x 2" פלטת מתכת, שקופיות (זכור כי החבילה עד פתח בהוד), קופסת סטרילי 20 טיפים microliter (μL), קרום המרתף מטריקס (matrix).
- אשר זמינות של מרחב מספיק לתמונות על כוננים קשיחים של המחשב.
הערה: באמצעות התצורה המתוארות ב פרוטוקול זה, כ- 60 ג'יגה-בתים (GB) של שטח נדרשו לכל ניסוי (4 ג'יגה-בתים/טוב). אולם, שטח אומדנים מבוססים על תצורת החומרה, יהיה צורך לקבוע עבור כל מערכת.
2. פרוטוקול 1: הגדרת הניסוי: הכנת השקופית
-
לאסוף ולהכין אספקה
- היום של הניסוי, לאסוף חומרים עבור ציפוי תאים בשקופית, כולל דלי של קרח, מיכל קטן של קרח יבש, זוג מספריים פיפטה 20 μL. לרסס כל הפריטים עם 70% אתנול, לנגב היבש עם מגבות נייר, למקם פריטים ברדס תרביות רקמה סטרילי.
- לאסוף את כל ציוד המאוחסן ב 4 ° C (ראה שלב 1.2) כולל את לוחית המתכת, קופסה של טיפים, שקופיות, מטריקס. לרסס את קופסת טיפים עם אתנול 70% ולמקם את תיבת המכולה של הקרח היבש.
הערה: הסר מטריקס מהמקרר 4 ° C בלבד כאשר אתה מוכן להשתמש ולשמור תמיד המטריקס על קרח. - לרסס את לוחית המתכת עם 70% אתנול ולהכניס אותו לתוך הקרח בדלי הקרח. לפתוח את החבילה המכילה את השקופית, ולמקם את השקופית בצלחת מתכת כדי לשמור אותה בקירור.
-
מטריקס טען אותן לשקופית
- מוגדר פיפטה של 10 μL ולהסיר את הטיפ מתיבת עצה קר עם פיפטה. חותכים כ 1 ס מ לבטל הקצה של הקצה עם המספריים.
הערה: חיתוך בניצב קצה כדי להפחית את בועות במטריקס. פיפטה ניתן להגדיר אמצעי אחסון מעט גדול יותר μL 10 עבור מטריצה נדבקות הפנימי של הקצה. - לאט לאט לצייר המטריקס לתוך קצה פיפטה. מיד במקום, הטיפ פיפטה על המרכז של הבאר. בעדינות לגעת בקצה פיפטה לתחתית הבאר, לאט לדחוף את המטריקס.
הערה: לעשות לא על פיפטה, כמו זה יגרום בועות לטופס. אם צורות בועה, פופ אותו באופן מיידי באמצעות טיפ קטן. - השקופית מכילה 15 בארות בודדים. חזור על השלב הקודם עבור כל טוב. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב כדי לשמור על עקביות ולהפחית את מטריקס שהשרף מתהווה בתוך הטיפ.
- ברגע השקופית היא עמוסה כל בארות המכיל מטריקס, לדחוף את המכסה כל הדרך אל השקופית, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות עד עפור המטריקס.
הערה: אל תתנו המטריקס להתייבש. להוסיף אמצעי אחסון קטנים (2-3 מ ל) ל- PBS הכיפה של צינור חרוטי 50-mL ליד השקופית בחממה כדי להפחית את הסיכון של מטריקס ייבוש.
- מוגדר פיפטה של 10 μL ולהסיר את הטיפ מתיבת עצה קר עם פיפטה. חותכים כ 1 ס מ לבטל הקצה של הקצה עם המספריים.
3. פרוטוקול 2: ציפוי ECFCs על המטריקס
-
הסר מחסידי ECFCs של תרביות רקמה צלחות ולאסוף את ההשעיה
- לקבל תרביות רקמה צלחות המכיל את ECFCs מצופה ביום הקודם (ראו סעיף 1.1.9). האחות EGM2 מדיה ותרחץ מחסידי ECFCs פעם אחת עם 7 מ של PBS.
- האחות PBS, להוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין, דגירה תאים חסיד למשך 2-5 דקות ב 37 º C.
- מיד לאחר דגירה, להוסיף 3 מ"ל של EGM2 ושל pipet למעלה ולמטה מכך כל תאים חסיד. להעביר תא ההשעיה צינור חרוטי 15-mL.
- חזור על צעדים 3.1.1-3.1.3 על הדגימות ECFC שלושת הנותרים עד כל תא ארבע דוגמאות נאספים ההשעיה.
-
הכנת תערובות מאסטר
- Centrifuge כל דוגמאות ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות תגובת שיקוע, מחדש להשעות תא כדורי ב- 1-2 מ ל EGM2.
- לערבב התליה תא ביסודיות ולהסיר aliquot קטנה (20-40 μL) עבור ספירה.
- להוסיף חלקים שווים trypan blue תא aliquot, פיפטה 10 μL אל hemocytometer. לספור את מספר התאים ארבעת הרביעים הראשי hemocytometer.
הערה: השתמש בשני צידי hemocytometer בכל הסעיפים לדוגמה כדי להעלות את רמת הדיוק. - שימוש בתא נחשב מלמעלה, לחשב את הנפח של כל מדגם התא המכיל 1.4x104 תאים. לערבב ביסודיות כל המתלים תא aliquot 1.4 ובחצי 104 תאים לתוך צינור טריים להכין תערובת הבסיס עבור כל תנאי הניסוי. הוסף מדיה EGM2 כך הנפח הסופי של כל מיקס מאסטר הוא 175 μL.
- לערבב כל מיקס מאסטר על ידי בעדינות pipetting ו aliquot μL 50 של מיקס מאסטר לתוך בארות בודדים בשקופית.
הערה: כל הדוגמאות הן מצופה שהפקידים, mixes אב מחושב עבור 3.5 בארות להבטיח נפח מספיק עבור 3 בארות.
-
דגירה השקופית
- דגירה השקופית ב 37 ° C עד ניתן להזיז אל החדר מיקרוסקופ עבור הדמיה.
הערה: הזמן בין ציפוי הדמיה צריך להיות מהר ככל האפשר כדי להגביל את אובדן נתונים במהלך השלבים הראשונים של vasculogenesis.
- דגירה השקופית ב 37 ° C עד ניתן להזיז אל החדר מיקרוסקופ עבור הדמיה.
4. פרוטוקול 3: מיקרוסקופ וההתקנה ייבוא תמונות
הערה: עבור הלימודים שלנו, פרוטוקולים 2 ו- 3 נערכו בו זמנית על ידי אנשים נפרדים. אם פרוטוקולים 2 ו- 3 צריך להתבצע על ידי אותו אדם, פרוטוקול 3 שלבים 4.1 ו- 4.2 להלן אמור להסתיים לפני ייזום פרוטוקול 2 לעיל.
-
הפעל את המיקרוסקופ ואת המחשב
- כ- 1-2 שעות לפני הפעלת הניסוי, להפעיל, מחממים בשלב החממה העליון עד 37 ° C, להגדיר את CO2 כדי 5%, והגדר הלחות 85%. למלא לאגירת הלחות של החממה, אם ריק.
- הכנס אחד של שתי העמדות פתוח של שקופיות chambered ריק, למלא מים מזוקקים. אבטח את המדחום משוב עבור בקרת טמפרטורה קאמרית, אם הם זמינים.
הערה: אם המדחום משוב זמין, השתמש הזה "טמפרטורה חממה" כדי לוודא כי החדר יש equilibrated. - להפעיל מפוח משני מוגדר כ- 39-42 ° C כדי לחמם את השקופיות מלמטה ולצמצם את התעבות.
- הוסף שקופית השני ריקים עד ניתן להוסיף את השקופית ניסיוני. בשקופית זו משמשת כמציין מיקום עבור תצורת ההגדרות רכישת התמונה עבור בארות בודדים במהלך ההתקנה.
- מוסיפים מים למאגר המים המקיפים את הבארות על השקופית השניה כדי לחקות את התנאים במהלך הניסוי הדמיה. המים המקיפים את הבארות מאפשרת הערכה של לחות במהלך ההתקנה מיקרוסקופ, חימום.
הערה: equilibration מראש של הבמה-העליון חממה, מפוח משני חיוני לשמירה על סביבה culturing יציבה. רוב בקרי קאמרית תא חי לתת משוב בזמן-אמת של טמפרטורה, CO2ו לחות כדי להעריך את המוכנות של המערכת. לפני שתמשיך, בדוק אם יש ההצטברות של לחות בשקופית וייבוש מוגזמת של המאגר כפי שמולאו 4.1.5. לחות ייתכן שתצטרך לכוונן אם ייבוש יתר או עיבוי בבית הבליעה. כדי להגדיל את הלחות, להוסיף מגבונים מורטבים במים מזוקקים. כדי להקטין את עיבוי, להקטין את ההגדרה לחות כמו תוך 4.1.1 או כמו עיבוי יכול להיות סימן של טמפרטורה נמוכה, בדוק את הגדרות טמפרטורת החדר ואת המיקום של מתקשרים משני.
-
קביעת תצורה של הגדרות רכישת התמונה הבסיסית במהלך equilibration.
הערה: התמונה הרכישה מוגדר באמצעות התוכנה המפקחת על הבמה, תריס, מצלמה. כלי רב-ממדי התקנה היא הדרך הקלה ביותר להגדיר את התוכנה. יתר על כן, התוכנה יצטרכו לקיים שגרות פוקוס אוטומטי כדי להבטיח מיקוד שליטה על משך הזמן של הניסוי.- להשתמש בתוכנה כדי להגדיר תפקידים מרובים הבמה במשך כל. עבור פרוטוקול זה, בחר מרכז הבארות.
- להגדיר את רכישת התמונה כך במיקום בכל שלב, כל היטב זה עם תמונה. לדוגמה, השתמש tilescan עם חפיפה תמונה 10-20% ושדות כ 5 x 5, בהתאם המצלמה ואת ההגדלה הסופי.
- להגדיר את זמן לשגות הדמיה כל 15 דקות.
הערה: באמצעות התצורה המתוארות ב פרוטוקול זה, הם צילמו כל 15 בארות של השקופית בתוך מרווח 15 דקות.
-
טעינת השקופית ניסיוני
- בעקבות equilibration של התא חממה, החלף השקופית הריקה השקופית ניסיוני.
הערה: תא equilibrated תהיה טמפרטורה יציבה, CO2ו לחות לפחות 20 דקות. לאחר השקופית ניסיוני הוא מוכן, זה הכרחי כי יושלמו השלבים במהירות כדי למזער את "המת-זמן" בין ציפוי לבין נקודת הזמן הראשוני שנתפסו על ידי המיקרוסקופ. יתר על כן, כדי להקל על ההשוואה בין ניסויים הדמיה, הפעם צריך להיות עקבי. בניסויים אלה, נדרש כל השלבים המתוארים פרוטוקול 3 סעיף 4.3 כ 30 דקות כדי להשלים. - להסיר את המכסה שקופיות ולהוסיף מים למאגר המים המקיפים את הבארות בשקופית.
הערה: המכסה מוסר משך זמן הניסוי הדמיה.
- בעקבות equilibration של התא חממה, החלף השקופית הריקה השקופית ניסיוני.
-
קביעת תצורה של הגדרות רכישת התמונה הסופית
- למקם את המטרה DL עבור חיל הים לתכנן CFI 10 X במיקום ובחר את הטבעת שלב Ph1 על מעבה. עם הבאר הראשונה בפוקוס, להתאים את נתיב האור diascopic לתאורת קוהלר ולקבוע תצורה של שלב אופטיקה על-ידי בדיקת היישור של שלב הטבעת מעבה עם המסכה שלב אובייקטיבית.
- להגדיר את זמן החשיפה ולהתאים את עוצמת המנורה ' ניגוד ' שלב, שהוא בדרך כלל פחות מ 500 ms.
- לעבור בין כל ערכת מיקום הבמה ב 4.2.1 ואשר כי המרכז של הבאר נבחרה, להתאים אותו, במידת הצורך.
- כל מיקום הבמה, דגש על התאים מצופה בבאר ולהגדיר מיקום z של מיקום הבמה המשמש הדמיה בתוכנה.
- בדיקת מנגנון מיקוד אוטומטי המיקרוסקופ. אם פוקוס אוטומטי מבוססת חומרה, ודא על והוא ממוקם בצורה נכונה עבור כל שלב העמדות.
הערה: כפי הדגימה ואת הבמה עלול להיסחף אנכית במהלך הניסוי, חשוב כי התוכנה תבדוק את פוקוס אוטומטי לכל תפקיד הבמה, בכל נקודת זמן כדי להבטיח הדמיה אמין במהלך הזמן-הקורס. במידת האפשר, עמדה פוקוס אוטומטי נקבע בנקודת זמן קודמת אמור לשמש כנקודת ההתחלה עבור השגרה פוקוס אוטומטי עוקבות. בדרך זו, פוסקת להיסחף ניתן להתאים על בקלות. - להפחית או לכבות את האורות בחדר מיקרוסקופ ולהתחיל את הניסוי הדמיה.
5. פרוטוקול 4: תמונה עיבוד וניתוח קינטי של Vasculogenesis (קו)
-
שמור תמונות מנקודות זמן בודדים כמו אוסף תמונות עבור כל טוב
הערה: רוב תוכנות עבור לכידת תמונה ניתן לייצא tiffs מרובה עמודים (ערימות) של סדרת זמן. קו מתוכנן לעבוד על datasets שיכולה לכלול מספר נקודות זמן. לפיכך, ניתוח מתרחשת על המחסנית כל התמונה עבור משרה שלב נתון. במידת הצורך, התמונה בתוכנת עיבוד באפשרותך לייבא תמונות יחיד לכל נקודת זמן לבנייה מחדש של אוסף תמונות. - פתחו את התמונה עיבוד תוכנה במחשב
-
הוספת קו על התמונה בתוכנת עיבוד
- גרור את הקובץ קו מתיקייה לתוך שורת אפור בחלק התחתון של חלון התוכנה. לחץ על 'שמור' כדי להוסיף את התוכנה לרשימה.
-
פתח של אוסף התמונות כדי להיות מנותח
- לחץ על 'קובץ' ולאחר מכן 'לפתוח' דרך התפריט הנפתח תוכנות עיבוד תמונה, או גרור קובץ התמונה לתוך שורת אפור כמו שלב 5.3.1.
- להמיר את התמונות ל- 8 סיביות על-ידי לחיצה על 'תמונה', 'Type', '8 סיביות'.
-
ליצור אזור בעל עניין (ROI)
- פתח את מנהל רועי על ידי לחיצה על 'ניתוח' בסרגל כלי. לאחר מכן בחרו 'כלים' ולאחר מכן על-ידי רועי מנהל ''.
- צור רועי חדש על-ידי לחיצה על כלי הבחירה מעגל או מלבן בסרגל הכלים ציור אזור הבחירה הרצויה על התמונה. לחץ על 'הוסף' בחלון מנהל רועי כדי להציל אותה צורה.
הערה: רועי שנוצרה בעבר ניתן לפתוח על-ידי גרירת הציל ROIs (תיקיה מכווצת) לתוך שורת 'גרור ושחרר' כדי לפתוח את מנהל. - לחץ על התווית רועי רשום במנהל רועי כדי להציג אותה על התמונה.
הערה: אם ההחזר לא יופיעו על התמונה, ליצור רועי שני (בכל גודל/צורה) ולהוסיף אותו המנהל. לאחר שני ROIs מופיעים ברשימה, לחץ על הלוך ושוב בין השני רועי הרצוי יופיע על התמונה. - יישר את רועי במידת הצורך. ברגע רועי הוא במקום על התמונה במיקום הרצוי, עבור אל התפריט ולחץ על 'עריכה' ואז 'ברור בחוץ'. זה ימחק את נתוני התמונה מחוץ רועי (שימושי עבור צורות מלבני) עבור כל תמונה במחסנית.
הערה: באפשרותך גם ללחוץ על 'תמונה', 'חיתוך' אם אתה משתמש של רועי בצורת rectangularly.
-
להפעיל את התוכנה קו
- לחץ על 'Plug-in' בשורת התפריטים.
- בחר את 'לנתח רשת' יישום plug-in. פעולה זו תפתח חלון עם אפשרויות כדי לשנות את הגדרות התוסף.
- לשנות את שיטת קביעת סף באמצעות האיסוף חץ למטה.
- לאחר כל ההגדרות המתאימות נבחרו, לחץ על 'אישור' כדי ליזום תוכנת עיבוד.
הערה: ההגדרות המתאימות נקבעים באמצעות ויזואליזציה של השלד ומסיכת עיבודים שנוצרו על-ידי קו, אשר מעידים על accurary התוכנה כדי לזהות ולהבחין תאים ורשתות מהרקע בתמונה ניגודיות שלב.
-
לשמור את הנתונים שנוצרו על-ידי קו
- ברגע התוסף סיימה את הניתוח, שני חלונות יהיה מוקפץ על המסך כולל טבלת נתונים עם ערכים מספריים, ערימה של תמונות מאוחה המתארים עיבודים שלד ומסיכה.
- שמירת ערכים מספריים על-ידי ניווט אל הפינה השמאלית העליונה של טבלת הנתונים, לחיצה על 'עריכה' ואז 'העתק' או 'לחתוך' כדי להדביק ערכים לתוך גיליון אלקטרוני של excel.
- לחץ על התמונה שלד ומסיכת מאוחה. לשמור בה את מחסנית תמונת שלד מאוחה/מסיכה בתור קובץ Tagged Image File Format (TIFF) על ידי לחיצה על 'קובץ,' 'שמור בשם',' 'טיפ'.
- להציל את הניגוד שלב החתוכה תמונה מחסנית (שנוצרו באמצעות ROI) על ידי לחיצה על 'קובץ', 'שמור בשם',' 'TIFF.'
- לחץ על החלון רועי מנהל ובחר את רועי נהגו לחתוך את התמונות. לחץ על 'עוד' ואחריו 'שמור' כדי לשמור את רועי לשימוש עתידי.
הערה: שימוש באותו רועי תסייע לשמור על עקביות על-פני ניתוחים.
Representative Results
קו מייצר ייצוגים חזותיים של מבנה הרשת
הניגוד בין את ECFCs ואת הרקע מטריצה של תמונות חדות שלב מאפשרת קו לזהות מבנים התא הספציפי. רשתות ECFC המזוהה על-ידי קו מיוצגים בתמונה כמו עיבודים שלד ומסיכת להמחשת מבנים המשמשים את התוכנה על כימות (איור 2א). חשוב, הערכה איכותני העיבודים שלד והמסיכה מאפשר זיהוי מהיר של קו רגישות ודיוק, אשר יכול להיות שימושי לקביעת הגדרות הסף האופטימלי ופרשנות ניתוח התוצאות. כאשר האיכות של התמונות חדות שלב הוא גבוה חדות מספקת מושגת, קו מזהה במדויק ECFC רשתות כמצוין על-ידי הדמיון בין שלב חדות התמונה את הנוצרים על-ידי קו שלד ומסיכת עיבודים (איור 2 A ווידאו 1).
לחלופין, אם אין שלב חדות תמונות חדות גבוהה ו/או חפצים של הדמיה כגון gridding להתרחש, רשת זיהוי רמת הדיוק מופחתת ולהיות תוצאות חד משמעיים (איור 2B). בנוסף, היווצרות בועות אוויר בתוך התקשורת תא מאפילה גם דיוק הזיהוי (איור 2). עם זאת, בעיות עם איכות תמונה ניתן לעיתים קרובות להתגבר באמצעות מבחר שיטות סף שונים הכלולים בתוכנה קו ביותר. לדוגמה, שלב חדות התמונה איור 2B נותחו באמצעות הגדרות עיבוד תמונה זהה למעט שיטת קביעת סף. עיבודים השלד ומסיכה זה ניכר כי סף אוטסו, גרמו זיהוי מדויק יותר של רשתות ECFC שמוצג בתמונה ניגודיות שלב (איור 2B). לכן, איכות התמונה הוא קריטי להשגת תוצאות מדויק ומשמעותי זה וזמינותו. עם זאת, שיטות סף שונים כולל את ממשק המשתמש של קו מאפשרים התאמה של ניתוח תמונות בהתבסס על איכות התמונות קלט.
מיקרוסקופ זמן לשגות מזהה הבדלים כמותיים vasculogenesis ECFC בעקבות חשיפה סוכרת הריון תוך רחמי
לאחרונה, הגישה האנליטית קו הוחל כדי להעריך את הפונקציה ECFC עוברי בעקבות חשיפה אימהית סוג 2 סוכרת (T2DM) בתוך הרחם16. קינטיקה מסולף של vasculogenesis באמצעות קו, אותרו ב- ECFCs העובר חשוף T2DM. עם זאת, בנוסף T2DM חשיפה, אשר מתרחשת לאורך כל ההיריון את כולו, סוכרת הריונית (GDM) או פיתוח סובלנות גלוקוז נפוץ בשליש הראשון של ההריון, פוגע גם פונקציה ECFC13. לכן, קו הוחל כדי לקבוע אם ECFCs החשופים GDM להציג גם קינטיקה שינו היווצרות רשת ECFC. שלב 1 (0-5 h) שלב 2 (5 + h) היו להעריך באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשילוב עם ניתוח קו (איור 3). תמונות חדות שלב נציג רכשה בתחילת ייבוא תמונות (0.50 h), לאורך זמן (5.00 ו 10.00 h) מתארים את היווצרות רשת ECFC הדגימות ארבע נבדק מיום ניסיוני יחיד (איור 3 ו Video 1 ). למרות תא המקביל טעינה, כפי שנצפה של תמונות חדות שלב בשעות 0.50, איכותי הבדלים במבנה הרשת ניכרות בנקודות זמן 5.00 ו 10.00-שעה. ECFCs מן ההריון מסובכת (UC) יוצרים רשת מסובך ומורכב 5 שעות שלאחר יופיצ, הדומה שלנו נתונים שפורסמו בעבר16. לעומת זאת, ECFCs של GDM לטעום 1 טופס (GDM1) מעטים רשת מבנים לא מחוברים. עם זאת, דפוס זה לא משתקפת כל דוגמאות ECFC המתקבל GDM הריונות, מעידה על הטרוגניות בין הדגימות. דוגמאות GDM2 ו- GDM3 להציג היווצרות רשת גדולה יותר בהשוואה GDM1, אף על פי הדפוסים של קישוריות תיראה שונה לעומת הדגימה UC. חשוב לציין, קו מודד מספר רכיבים מבניים של רשתות ECFC לזיהוי פנוטיפים ברור וגם עדין.
בנוסף יצירת עיבודים שלד ומסיכה של מבנה הרשת, קו quantitates עשרה מדדים של מבנה הרשת, כולל מספר מבני רשת בודדים, צמתים, צמתי קנים משולשת, קנים קוואדרופל צמתים, ענפים, סה אורך סניף סניף ממוצע אורך, סניף צומת יחס, הכולל סגור רשתות, רשת אזור16. קו הידור את הנתונים עבור כל דגימה לטבלה יחידה של ערכי של כל התמונות של מסלול הזמן. טבלה 1 כולל נציג נתונים גולמיים של מחקר הדמיה אחד עבור אחד מדגם ECFC. הפרמטרים של מבנה הרשת נמדדת קו מאורגנות עמודות, הנתונים לתמונות רציפים רכשה במשך הזמן מסודרים בשורות. לדוגמה, במחקרים שלנו, תמונה 1 היה מתקבל ציפוי שלאחר 30 דקות עם תמונות עוקבות להיות שנאספו כל 15 דקות Raw ערכים שנוצרו על-ידי אז יכול להיות בגרף קו או שנותחה נוסף באמצעות סטטיסטיים מורכבים יותר מתקרב16.
חמש גרפים המתארים ערכים אכזרי של מבנה הרשת מ 3 ניסויים נפרדים מוצגים עבור דוגמה אחת מסובכת (UC) ודוגמאות של שלושה GDM (איור 4). דגימת ה-UC בניסויים אלה לבצע באופן דומה בעבר ניתחו דגימות UC16. בעבר, היא זוהתה כי ECFC vasculogenesis חוץ גופית בתוך דו-phasic, המורכב של שלב 1 (0 - 5 שעות), שלב 2 (5-10 h)16. דפוס זה הוא עקבי במחקרים עדכניים, כפי שמעידים על הגרף המתאר נתונים ברשת סגורה (איור 4). המדגם UC נוצרו מספר רב יותר של רשתות סגורות לעומת כל שלושת הדגימות GDM. מעניין, שלושה מתוך הארבעה מופיעים יש זמן דומה למספר מקסימלי של רשתות סגורות, אשר מתרחשת בין 2.5 ל 3 שעות. אולם, הדגימה GDM2 היה איטי יותר להגיע מקסימלי רשתות סגורות, אשר התרחשה 5 שעות שלאחר ציפוי. ומתוחזק, למרות GDM2 מדגם רשתות מקסימלי פחות בהשוואה המדגם UC, הרשתות שטפסים היו באופן דומה לדגימת UC לאורך זמן. לעומת זאת, GDM1 ו- GDM3, שבו נוצר רשתות פחות בהשוואה המדגם UC, הועמדה גם על צמצום הכוללת מספר הרשת לאורך זמן. בסך הכל, מן התרשים המתאר מספר ברשת סגורה, זה ברור כי כל דוגמאות ECFC להציג דפוס דו-phasic של היווצרות רשת, אולם קצב היווצרות של המספר המקסימלי של רשתות מושגת להשתנות בין מדגמים.
רשת אזור מייצג את השטח הממוצע בתוך הרשתות סגורות שהקים את ECFCs. לכן, ככל הרשת סגור מספר, קטן יותר האזורים רשת. דפוס זה משתקף בגרפים אזור רשת שבו המדגם UC, שבו נוצר מספר גדול יותר של רשתות סגורות, היו אזורים רשת קטנים לאורך זמן בהשוואה הדגימות GDM שלוש (איור 4). GDM2, אשר הגיעו רשתות סגורות מקסימלי לאט יותר, הציג אזור רשת גבוה בתחילה, אולם האזור התייצב על פני זמן, זה היה דומה ביותר המדגם UC-15 שעות. לאורך זמן, האזור לרשת הממוצע של כל הדגימות גדל דה-מייצב רשת. עם זאת, דגימות, כמו GDM1 ו- GDM3, הציג עלייה מהירה יותר באזור הרשת, אשר סביר מצביע על ירידה יציבות לעומת אחרים דוגמאות המציגות עלייה הדרגתית יותר.
ECFCs החשופים GDM להפגין יציבות רשת מופחת
היחס של ענפים לבלוטות הפנוטיפ הרומן מחושב על ידי קו וזיהה במחקרים קודמים שלנו, זה מעיד על קישוריות רשת16. במחקר הנוכחי, המדגם UC היה יחס נמוך, אשר ייצג רמה גבוהה של קישוריות רשת זה נשמר לאורך זמן (איור 4). לעומת זאת, הדגימות GDM שלוש היה יחס גבוה יותר של ענפים לבלוטות, במיוחד בשלב 2 היווצרות רשת. התבוננות זו ממחישה דה-ייצוב מבני רשת בקישוריות מופחת.
בסך הכל, GDM1 נוצר פחות צמתים וסניפים לעומת הדגימות אחרים, עם הפחתת לתחזק את מהלך הניסוי. GDM2, GDM3 נוצר ומתוחזק על מספר רב יותר של ענפים לעומת הדגימה UC, ובעיקר בין 5-15 h. המספרים של צמתים זוהה הרשתות GDM2 ו- GDM3 היו דומה יותר מספר הצמתים בדוגמת ה-UC, ובעיקר בין 10-15 שעות. מספר רב יותר של ענפים, אך מספר דומה של צמתים, יכול להסביר הענף מוגברת צומת יחס ניכר בנקודות זמן מאוחר יותר הדגימות GDM. חשוב לציין, שינויים שמתבצעים במספר סניף וצומת יכול להיות קשה לפרש בגרפים נפרדים. עם זאת, הענף הרומן צומת יחס מציע דרך להעריך כמה שינויים, כולל שינויים קלים קשה לזהות בגרפים בודדים, מספר סניף והן צומת, לגרום קישוריות רשת מסולף.
איור 1 : מפרטים טכניים חלוקה לרמות 10 פרמטרים לכמת על ידי קינטית ניתוח של Vasculogenesis (קו). קו quantitates עשרה פרמטרים ברורים של מבנה הרשת. כל הפרמטרים הם מקודדים, המתוארים התרשים לפי מספרים (1-10). פרמטרים כוללים מספר סניפים (ירוק, 1), סגור רשתות (2 כחול), צמתים (אדום, 3), ממוצע באזור רשת (כתום, 4), מספר מבני רשת (שחור, 5), צמתים קנים משולשת (צהוב, 6), צמתים קנים עם ארבע ליבות (סגול, 7), כמו גם סה כ (9) (10) סניף ממוצע אורך ו את היחס שבין מספר הסניפים על מספר צמתים (10). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : קינטי ניתוח של Vasculogenesis (קו) quantitates מבנה הרשת. (א) עיבודים שלד ומסיכה של מבני רשת המזוהה על-ידי קו באמצעות שלב תמונות חדות מספקים ייצוג חזותי של מבני רשת מזוהה, לכמת על ידי קו. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) תמונה חדות שלב נציג של ECFC רשתות 10שע שלאחר ציפוי בעל ניגודיות נמוכה, רשת מסמן מן תפרים תמונות בודדות יחד. שיטות סף שונים, כגון או אוטסו, ניתן לבחור ב- קו plug-in כדי לשפר את דיוק כימות, אם שלב חדות תמונות חדות נמוכה או אם מתרחשת gridding. עיבודים שלד ומסיכה של שלב חדות התמונה מוצגים עבור שיטות סף ממוצע והן אוטסו. תמונות חדות שלב נלכדו באמצעות מטרה X 10. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : חשיפה תוך רחמי GDM הפיצולים היווצרות רשת ECFC. תמונות של היווצרות רשת ECFC נלכדו במרווחים של 15 דקות עבור 15 h על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. שלב נציג תמונות חדות ב- 5 h דרגות, החל בזמנו של ציפוי (0.5 h), מוצגים עבור UC ודוגמאות GDM שלוש. תמונות חדות שלב נלכדו באמצעות מטרה X 10. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ECFCs נחשפים תוך רחמי GDM בנספח שונה רשת היווצרות קינטיקה. ECFCs התקבלו היריון מסובכת (UC, שחור), שלושה הריונות מסובך בגלל סוכרת הריונית (GDM 1-3, אדום). תמונות חדות שלב נלכדו ב 15 דקות מרווחי ה 15 תוכנה קינטי ניתוח של Vasculogenesis (קו) quantitated סגורה רשתות רשת אזורים, סניפים, צמתים, היחס של ענפים לבלוטות. הנתונים מאויר מייצגים את שגיאת התקן זאת אומרת ± הממוצע (SEM) של 3 ניסויים נפרדים עבור כל דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1: תוך רחמי GDM חשיפה הפיצולים קינטיקה של היווצרות רשת ECFC. תמונות של היווצרות רשת ECFC נלכדו במרווחים של 15 דקות עבור 15 h על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. תמונות חדות שלב מוצגים עבור UC ו GDM שלוש דוגמאות מעל 15 h החל מ- 0.5 h. סרגל קנה מידה מייצג 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
| התמונה | ענף הכולל רשתות | צמתים | משולשים | Quadruples | סניפים | סניף סה כ אורך * | סניף ממוצע אורך * | סניף צומת יחס | רשתות סגורות | אזור הרשת * * |
| 1 | 382 | 290 | 278 | 11 | 943 | 47210 | 124 | 3.25 | 9 | 480214 |
| 2 | 284 | 345 | 337 | 8 | 940 | 50699 | 179 | 2.72 | 16 | 264469 |
| 3 | 205 | 376 | 366 | 9 | 910 | 55728 | 272 | 2.42 | 27 | 150621 |
| 4 | 162 | 422 | 407 | 15 | 947 | 59692 | 368 | 2.24 | 40 | 98713 |
| 5 | 132 | 454 | 441 | 12 | 967 | 61923 | 469 | 2.13 | 53 | 72951 |
| 6 | 122 | 435 | 419 | 14 | 907 | 62587 | 513 | 2.09 | 68 | 56948 |
| 7 | 88 | 429 | 411 | 17 | 852 | 63983 | 727 | 1.99 | 74 | 51429 |
| 8 | 68 | 451 | 437 | 13 | 874 | 63960 | 941 | 1.94 | 74 | 51780 |
| 9 | 93 | 437 | 417 | 18 | 905 | 60901 | 655 | 2.07 | 49 | 82919 |
| 10 | 126 | 511 | 487 | 24 | 1075 | 61981 | 492 | 2.1 | 37 | 116857 |
| 11 | 49 | 397 | 384 | 12 | 737 | 61823 | 1262 | 1.86 | 79 | 48805 |
| 12 | 81 | 376 | 364 | 10 | 751 | 56817 | 701 | 2 | 63 | 64431 |
| 13 | 98 | 509 | 482 | 26 | 1028 | 60799 | 620 | 2.02 | 44 | 98056 |
| 14 | 93 | 449 | 416 | 31 | 909 | 58282 | 627 | 2.02 | 45 | 94081 |
| מעוגלים כדי מיקרון הקרוב, * * מעוגל מיקרון הקרוב ^ 2 | ||||||||||
טבלה 1: נציג נתונים גולמיים של הדמיה אחד ללמוד עבור אחד מדגם ECFC.
Discussion
קו מאפשר הערכה של ערכות נתונים גדולות עם מספר נקודות זמן
באופן מסורתי, כימות של vasculogenesis במבחנה יש כלל אחד, או כמה זמן מדידות. גישה זו סטטית היא פשוט לא מתאימות עבור לכידת וכימות תהליך דינאמי ומורכב. לכן, בשיטה חדשנית זו פותחה כדי לאפשר ניתוח יעיל של קינטיקה היווצרות רשת כדי לזכות בתובנה פוטנציאליים המנגנונים המולקולריים המעורבים בתהליך דינמי של vasculogenesis. אוטומציה ויעילות הם מרכיבים חשובים בפיתוח של טכניקות הרומן ליצור ולנתח כמויות גדולות של נתונים הדמיה. קו פותחה במיוחד כדי לנתח את אוספי תמונות גדולים בהיקף של מאות תמונות כדי להקטין את הזמן ואת העבודה הנדרש כדי להפיק משמעות ביולוגית מסקנות זמן לשגות ערכות נתונים. חשוב, קו מבצעת עיבוד תמונה, דור נתונים תוך מספר שניות קטן (פחות מ- 100 תמונות) בתמונה ערימות דקות גדול (גדול מ 100 תמונות) תמונה ערימות, והתוצאה היא יעילות ללא תחרות. בנוסף, ארגון נתונים לתוך גליונות אלקטרוניים הפרמטרים הנמדדים וזמן מאפשר יצירה מהירה של מצגת גרפית וניתוח סטטיסטי.
אתגרים ביישום מוצלח של גישה זו
למרות assay זה כולל שיפורים ייבוא תמונות וניתוח, כמה אתגרים עשויים לעכב יישום מוצלח. המכשולים העיקריים ארבע כוללים לחות יציבות, דיוק בתזמון של ציפוי כדי ייבוא תמונות, תוכנה, חומרה אמינות וניהול של ערכות נתונים גדולות שנוצר עבור כל ניסוי. הדמיה תא חי יציבה על פני מספר שעות יכול להיות מאתגר. באופן ספציפי, לחות המתאים ועקבית נדרש עבור התאים הדמיה. שקופיות אנגיוגנזה נמצאים בשימוש זה assay, אשר מיועדים parallelizing מבחני מבוסס-מטריקס אנגיוגנזה. נפח שלהם נמוך, כ- 50 µL, הופך אידוי ועיבוי שיקולים משמעותי עבור תנאים תרבות מורחב. כדי להתמודד עם הבעיה ניסיוני, זה הכרחי באינקובטור המסדירה את הלחות. עם זאת, גם ייתכן נדרש להגדיל את התקנה הזאת אם ייבוש יתר של התא הדמיה מתרחשת לאורך זמן. מצאנו כי הגישה הפשוטה ביותר כדי להגדיל את הלחות כדי להגדיל את שטח המים בבית הבליעה. כדי להשיג מטרה זו, הפרוטוקול שלנו מציע במקורות המים שלוש הבאות: שקופית chambered השני מלא מים, אשר גם בו נמדד הטמפרטורה חממה, מים באזור שמסביב הבארות שקופיות ולאחר שנרטבו נייר סינון או מגבונים לחים. לעומת זאת, עיבוי מתרחש כאשר טמפרטורת האוויר בחדר התחתון של השקופית מתקרר ומתעבה הלחות בתוך החדר על השקופיות ואת הבארות. הסיבוך הזה יכול להוביל לדילול התקשורת תא ואפקט lensing המפריע הניגוד שלב. במחקרים אלה, עיבוי היה ממוזער דרך היישום של אוויר חם (39-42 ° C) על גבי התחתון של השקופית.
אחד מהשיקולים המרכזיים למחקר כל זמן לשגות הוא עקביות בין חניכה ניסוי והדמיה. העיתוי של הפעלת הדמיה חיוני לפרשנויות של אירועים במורד הזרם. כדי להבטיח הדיוק בתזמון הזה assay, הזמן בין ציפוי הראשונית נקודת זמן שבעורך הראשונה צריכה להיות בחוזקה נשלטת. בפועל, ניתן למזער את "זמן מת", אבל יותר חשוב, זה צריך להיות עקבי לאפשר ניסויים בימים שונים לצורך השוואה. למשל, בפרוטוקול זה אנו מצפים זמן מת של 30 דקות. זה ניתן להקל על ידי הקרבה של מתקני הכנת ניסויי והדמיה.
מה שאולי נראה כאילו לפרטים ארציים במבט ראשון חשובים עבור תוכנה, חומרה יציבות וניהול נתונים. תוכנה, מנהלי התקני חומרה המשויך, בסביבת רשת ותוכנות אוטומטיות מעדכן כל השפעה היציבות של התוכנה. . זה שווה בדיקה פרוטוקול זה ב "הרצה" כדי לזהות צווארי בקבוק ואת מקורות פוטנציאליים של בעיות ברכישת תמונה; למשל, בדוק אם הגדרת תא חי לא אמין, הבמה, תריס המצלמה אמינות וצריכת את מדיניות טכנולוגיית המידע המוסדיים על מערכת הפעלה אוטומטית, עדכוני תוכנה.
ניהול נתונים הוא עניין מרכזי של כל ניסוי הדמיה שיוצר מאות עד אלפי תמונות. למרבה המזל, תוכנה מסחרית תדירות בודק עבור שטח זמין לפני הפעלת ניסוי הדמיה. עם זאת, וזמינותו הזה כולל גם תמונת לכידת שלאחר עיבוד וניתוח שניתן להוסיף לי שטח כונן קשיח או להפריע הדמיה ניסויים, אם השטח הפנוי מוגבל. יתרה מזאת, הביטחון והיציבות של המחשב אין אפשרות להבטיח, אפילו עם פתרונות חומרה כמו מערך יתיר של דיסקים זהים. לכן, אסטרטגיה וניהול נתונים כדי להבטיח מקום בכוננים הקשיחים של המחשב עבור ניסויים מתמשכים וארכוב של חזקה מרחוק, למשל עם משאב בארכיון מוסדיים, הכרחי.
אסטרטגיות כדי למקסם את איכות התמונה
למרות היכולת של קו להבחין במדויק ECFCs מהרקע מטריקס חזקים, הרגישות של וזמינותו תלויה באיכות התמונה. לדוגמה, אם התמונה כוללת ניגודיות נמוכה, התוכנה יאתר תא רשתות עם פחות דיוק (איור 2B). האיכות של הניגוד שלב מושפע במספר גורמים, כולל ההגדרות של המיקרוסקופ משמש ייבוא תמונות, טעינה של המטריקס ואמצעי התקשורת התליה תא במהלך ההכנה assay, ותחזוקה של רמות התקשורת בתוך הבארות במהלך דימות. כדי למטב את הניגוד שלב עבור מבחני אלו, נעשו התאמות קלות ליישור טבעת שלב במיקרוסקופ כדי לשפר את הניגודיות. בנוסף, הכנת הדוגמא היה נבדק בקפידה כדי להבטיח טעינת מדיה שווה ועקבית. אם הסכום של מטריקס ו/או מדיה נטען לתוך הבארות או מתחת או מעל הטווח האופטימלי, מניסקוס יכולים ליצור המוביל שלב שינו חדות. בסופו של דבר, עקב כמות נוזלים הבארות קטן, חיוני כדי לשמור על רמות מדיה על-ידי מזעור אידוי ועיבוי, כאמור לעיל. בסך הכל, אופטימיזציה assay חיוני ליצירת תמונות חדות באיכות גבוהה לצורך ניתוח.
בנוסף שלב חדות באיכות, גורמים אחרים יכולים גם להשפיע assay התוצאות כולל זיהום מדיה, פגמים מטריצה, ו חלקיקים או פסולת מטריקס או מדיה. זיהום הוא סיכון assay הזה מאז שהוא כרוך הדמיה תא חי על פני מספר שעות בחדר מיקרוסקופ. כדי להפחית את הסיכון של זיהום, המתלים מטריקס ותא נטענים על גבי השקופית בשכונה סטרילי. בנוסף, כל מדגם הוא בדרך כלל מצופה כפילויות או שהפקידים עבור ניסוי כדי למזער את הסיכון של אובדן נתונים עקב בעיות בלתי צפויות כגון פסולת או חלקיקים משתנה מתערב בניתוח.
לדוגמה הטרוגניות כוננים צריך רגישות מוגברת assay
הטרוגניות נצפתה ודיווח במחקרים קודמים של ECFCs נחשפים GDM13. רמה גבוהה של הטרוגניות בתפקוד התא שנצפתה הדגימות speculated להיות לייחס מספר גורמים, כולל חומרת המחלה אימהית, משך המחלה, ואת סגנון הניהול המשמש לווסת את רמות הגלוקוז בדם. חשוב לציין, גישה אנליטית זו לוכדת את טווח דינמי של ECFC vasculogenesis, שהופך אותו האפשריים כדי לזהות הבדלים פנוטיפי בשל הטרוגניות פונקציונלי בדגימות של GDM הריונות. בסך הכל, השימוש העיקרי דגימות החולה, כגון אלה נעשה שימוש במחקרים אלה, ניתן להציג את השתנות גדולה יותר לעומת קו תא. כפי מושם דגש רב יותר על translational מחקרים שכללו מספר ראשי דגימות בעלי חיים או אדם עם השתנות פונקציונלי, רגישות assay חיוני זיהוי, נגזרת של מדידות משמעות ביולוגית ומסקנות. לפיכך, פיתוח של גישות כמו קו תשפר את כמות ואיכות נתונים שנוצרו על-ידי במבחנה vasculogenesis ואנגיוגנזה מבחני כדי לאפשר עמידים יותר תצפיות ומסקנות. יתר על כן, נתונים אלה יקל בעתיד לפתוח בחקירה של המנגנונים המולקולריים שבבסיס שתורמים שינו vasculogenesis ECFC בעקבות חשיפה GDM תוך רחמי.
יישומים עתידיים של גישה זו
למרות ששיטה זו היה מוחל להערכת העובר ECFC vasculogenesis במבחנה במחקרים אלה, יישומים אפשריים של גישה זו הן רבות. טכניקה זו ניתן ליישם בקלות ללמוד כל התושבים תא המשתתפת בתהליכי vasculogenesis או אנגיוגנזה. באופן ספציפי, זה יכול לשמש כדי לחקור אוכלוסיות תא בודד, כמו הודגם במחקר זה, אבל זה גם יכול להיות מיושם במערכות תרבות משותפת. בעתיד, זה יהיה מועיל להרחיב את גישה זו מעבר מימדי במבחנה הנועד להעריך דגמים תלת ממדיים (3D). למרות שהגירסה הנוכחית של קו יהיה מספיק quantitating 3D הדמיה נתונים, דומה זמן לשגות רב פרמטרית אנליטית גישה במיוחד לדגמי תלת-ממד או ויוו היה להודיע אם תצפיות שני ממדים במבחנה הם נציג של הפונקציה תא באווירה יותר ביולוגית רלוונטית.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר לוסי מילר ליאן הרננדז, ד ר דוד האס, בריטני Yeley (אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת), ד ר קארן Pollok, ג'ולי. Mund, מתיו Repass, אמילי סימס (BioCore אנגיוגרפיה במרכז הסרטן סיימון אוניברסיטת אינדיאנה) עבור מעולה סיוע טכני שתנבע ECFC דגימות. המחברים גם להכיר ד"ר מורין א הרינגטון, אדוארד פ סרור, ריצ'רד ש היום, מרווין ג Yoder ו מתיאס א Clauss (אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת) דיון אקדמי, כמו גם ג'ניס קירות (אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת) תמיכה מנהלתית. הדמיה כל בוצעה במרכז אינדיאנה על מיקרוסקופ ביולוגי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 HL094725, P30 CA82709 ו- U10 HD063094) וקרן של הילדים ריילי. בנוסף, פרסום זה התאפשרה עם תמיכה חלקית מן הלאומי ללב, ריאות, דם המכון של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס # T32 HL007910.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 1495949B | |
| Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
| Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
| EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium. |
| 0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
| Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL. |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM. |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
| Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
| Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
| Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
| Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10X |
| Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
| Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
| Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
| Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
| FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298 (2011).
- Carmeliet, P.
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
- Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
- Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
- Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
- Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
- Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
- Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
- WimTube. , Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
- Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
