Kinetic analyse af Vasculogenesis kvantificerer dynamikken i Vasculogenesis og angiogenese In Vitro

Summary

Her præsenterer vi en protokol for time-lapse billedbehandling og analyse af vasculogenesis i vitro bruger fase kontrast mikroskopi kombineret med open source-software, Kinetic analyse af Vasculogenesis. Denne protokol kan anvendes til at vurdere kvantitativt vasculogenic af mange celletyper eller forsøgsbetingelser, at model vaskulær sygdom.

Abstract

Vasculogenesis er en kompleks proces hvorved endotelceller stamceller og stamfader gennemgå de novo fartoej formation. Kvantitativ vurdering af vasculogenesis er blevet en central udlæsning i endothelial stamfader celle funktionalitet, og derfor er sket adskillige forsøg på at forbedre både in vitro- og i vivo vasculogenesis modeller. Dog er standard metoder begrænset i omfang, med statiske målinger ikke at fange mange aspekter af denne yderst dynamisk proces. Derfor, målet om at udvikle denne nye protokol var at vurdere kinetik af in vitro- vasculogenesis for at kvantificere netværk dannelse og stabilisering, samt give indsigt i potentielle mekanismer bag vaskulære dysfunktion. Anvendelse af denne protokol er påvist ved hjælp af føtal endotel kolonidannende celler (ECFCs) udsættes for maternel diabetes mellitus. Fostrets ECFCs var afledt af navlestrengsblod efter fødslen, kulturperler og forgyldt i dias indeholdende basalmembranen matrix, hvor de blev vasculogenesis. Billeder af hele diaset brønde er anskaffet ved hjælp af time-lapse fase kontrast mikroskopi over 15 timer. Billeder blev analyseret for afledning af kvantitative data ved hjælp af en analyse software kaldet Kinetic analyse af Vasculogenesis (KAV). KAV bruger billedsegmentering efterfulgt af skeletonization til at analysere netværkskomponenter fra stakke af multi tid punkt fase kontrast billeder at udlede ti parametre (9 målt, 1 beregnet) af netværk struktur herunder: lukket netværk, netværksområder, noder, grene, samlede filial længde, gennemsnitlige filial længde, triple-forgrenede noder, quad-forgrenede noder, netværksstrukturer, og filialen at node forholdet. Anvendelse af denne protokol, identificeret ændres satserne for vasculogenesis i ECFCs fremstillet af graviditeter kompliceres af diabetes mellitus. Denne teknik har imidlertid bred konsekvenser ud over anvendelsesområdet rapporteret her. Gennemførelsen af denne tilgang vil forbedre mekanistiske vurdering og forbedre funktionelle udlæsninger af vasculogenesis og andre biologisk vigtige forgrenede processer i mange celletyper eller sygdom stater.

Introduction

Evne i endothelial stamceller til at gennemgå vasculogenesis eller de novo fartoej formation, er kritiske i oprettelse af embryonale Vaskulaturen under udvikling¹. Derudover er yderligere fartoej formation og modningen af præ-eksisterende fartøjer, der er kendt som angiogenese, også en vigtig proces i udvikling og postnatal liv at opretholde blodgennemstrømningen og homøostase i hele kroppen². Hvert organ i kroppen er afhængig af det vaskulære system for levering af ilt og næringsstoffer, og fjernelse af affald³. Hvis vaskulære homeostase ikke er opretholdes, således at blodkar dannelse og reparation er enten utilstrækkelige eller overskydende, kan Vaskulære sygdomme medføre⁴. Derfor, vaskulære dannelse og tilpasning er almindeligt studerede, da de er afgørende i vedligeholdelse af organ sundhed og er involveret i udviklingen af talrige patologiske stater.

På grund af en øget forståelse for inddragelsen af det vaskulære system i udvikling og i sygdommen manifestation og progression, er assays blevet udviklet til model vasculogenesis og angiogenese in vitro og i vivo^{5 ,6,7}. Modeling fartoej formation indebærer plating vaskulære celler, såsom endotelceller, i basalmembranen matrix, der fremmer celle organisation og dannelsen af fartøjet netværk^8,9,10. Typisk følgende natten inkubation, billeder af cellen netværk er fanget på et enkelt tidspunkt, hvilket resulterer i et lille antal billeder til analyse^11,12,13. Derfor, analytiske tilgange har i vid udstrækning blevet udviklet og optimeret til enkelt gang punkt vurderinger^10,14. Men statiske analyser er simpelthen ikke tilstrækkelig til at opfange den dynamiske proces af fartoej formation og give begrænset indsigt i potentielle mekanismer involveret. Selvom imaging oftere vil sandsynligvis give de nødvendige data for at identificere dannelse kinetik, ville anvendelse af tidligere udviklet analytics til en multi tid punkt imaging fremgangsmåde være ineffektiv og labor intensiv¹⁴. Desuden, trods udviklingen af kommercielt tilgængelige analyser gør en pay-per-image gebyr denne indstilling cost-uoverkommelige for kinetiske undersøgelser, hvor tusindvis af billeder er genereret¹⁵. Derfor, der er behov for inden for en strømlinet og effektiv tilgang til fange og kvantificere vasculogenesis i vitro, herunder evnen til at analysere store billede sæt genereret af time-lapse levende celle mikroskopi.

For at overvinde disse begrænsninger, blev en ny tilgang udviklet med det formål at udvide enkelt tidspunkt imaging dynamisk vurdering af vasculogenesis med billeder erhvervet hver 15 min.¹⁶. Ved at erobre flere tidspunkter over flere timer, giver denne fremgangsmåde en mere detaljeret skildring af processen med vasculogenesis, samt indsigt i potentielle mekanismer bidrager til dannelsen og vedligeholdelse af fartøjet netværk. Ud over at forbedre hyppigheden og kvaliteten af billedet erhvervelse, omfatter denne tilgang roman software i form af en open-source plug-in¹⁷. Software, omtales som kinetisk analyse af Vasculogenesis (KAV), er en strømlinet program, der indeholder billedbehandling og analyse specielt til stort billede sæt genereret fra multi tid punkt erhvervelser. KAV analyserer fase kontrast billeder gennem billedsegmentering efterfulgt af skeletonization¹⁸. Ti parametre af netværksstruktur er kvantificeret ved KAV herunder: grene, lukkede netværk, noder, netværksområder, netværksstrukturer, triple-forgrenede noder, quad-forgrenede noder, samlede filial længde, gennemsnitlige filial længde og gren til node ratio (Se skematisk i figur 1)¹⁶. Anvendelsen af metoden med KAV omfatter en roman, beregnede Fænotypen af in vitro- vasculogenesis, benævnt filialen at node ratio. Vores seneste arbejde viste, at dette forhold er betegnende for netværksforbindelsen og kan være forbundet med andre cellulære processer involveret i nettet formation, såsom motilitet¹⁶.

Selv om føtal endotel kolonidannende celle (ECFC) vasculogenesis blev vurderet i disse undersøgelser, kan dette billede erhvervelse og analyse tilgang anvendes let for at evaluere alle celletyper, der undergår vasculogenesis eller angiogenese. Denne tilgang kan geometriprogrammet desuden bruges til at identificere ændrede vaskulære funktion som følge af en række patologiske stater, såsom svangerskabsuge diabetes mellitus, som vist i disse undersøgelser. Endvidere kan denne metode tilpasses for at vurdere netværk dannelse og forgrening, som er vigtige for andre biologisk relevante processer. Den potentielle effekt for at anvende denne nye fremgangsmåde for unikke biologiske systemer er således endnu skal fastlægges.

Protocol

1. præparater

1. Kultur endotel kolonidannende celler (ECFCs)
   Bemærk: Føtal ECFC prøver, der indgår i disse eksperimenter var isoleret fra menneskelige navlestrengsblod og kulturperler af Angio BioCore (ABC) på Indiana University School of Medicine som tidligere beskrevet⁶. Rutinemæssig kvalitetskontrol fænotyper blev gennemført inden for ABC at bekræfte udtryk i endothelial antigener som tidligere beskrevet^19,20,21. Prøver, der indgår i forsøg blev passaged minimalt (2 - 3 gange). Alle vævskultur arbejde blev udført i en vævskultur hætte. Alle reagenser, herunder vævskultur plader og løsninger, var sterilt.
   1. To dage før eksperimentet, pels 100 mm runde vævskultur plader med 6 mL 0,05 mg/mL type 1 kollagen, og der inkuberes ved 37 ° C natten over.
      Bemærk: Type 1 kollagen er fortyndet i dobbeltdestilleret vand indeholdende 20 nM eddikesyre til en fungerende koncentration på 0,05 mg/mL.
   2. Dagen før eksperimentet, trypsinize og replate ECFCs på type 1 kollagen overtrukne plader i punkt 1.1.1. (Se Note under punkt 1.1).
   3. For at trypsinize ECFCs, Aspirér medier fra forgyldt celler og vask med 7 mL PBS. Opsug PBS, derefter tilføje 2-3 mL 0,5% trypsin og inkuberes celler for 2-5 min ved 37 ° C.
   4. Umiddelbart efter inkubation med trypsin, tilsættes 3 mL af EGM2 og afpipetteres op og ned at løsne alle vedhængende celler. Overføre cellesuspension til en 15 mL konisk slange.
   5. Der centrifugeres alle prøver på 500 x g i 5 min ved stuetemperatur.
   6. Opsug supernatanten og genopslæmmes celle pellets i 1-2 mL af EGM2. Bland cellesuspension grundigt og fjerne et lille delprøve (20-40 μl) til optælling.
   7. Tilføj lige dele trypan blå til cellen alikvot og tilsæt 10 µL på en hemocytometer. Tæl antallet af celler i de fire primære kvadranter af hemocytometer.
      Bemærk: Brug begge sider af hemocytometer for alle prøven tæller til at øge nøjagtigheden.
   8. Vask kollagen-belagt væv kultur plader, som blev udarbejdet i trin 1.1.1, to gange med 7 mL PBS. Efter sugning den anden PBS vask, der tilsættes 10 mL i endothelial vækstmediet 2 (EGM2) kultur medier suppleret med 10% føtal bovint serum til pladerne.
   9. Brug celle tæller fremstillet i trin 1.1.7, beregne mængden af cellesuspension kræves at pladen 4 x 10⁵ celler. Plade 4 x 10⁵ ECFCs på vævskultur plader forberedt i trin 1.1.8, og der inkuberes ved 37 ° C og 5% kuldioxid (CO₂) natten over.
2. Før forsøget, gemme forsyninger ved 4 °C natten over
   1. Gemme en 3 "x 2" metalplade, slide (holde i pakke indtil open i hætte), en kasse med steril 20 microliter (μL) tips og basalmembranen matrix (matrix).
      Bemærk: Matrix opbevares ved-80 ° C til langtidsopbevaring; altid tø det ved 4 ° C natten over eller i flere timer før anvendelsen.
3. Bekræfte tilgængelighed af tilstrækkelig plads til billeder på computerens harddiske.
   Bemærk: Ved hjælp af den konfiguration, der er skitseret i denne protokol, var ca. 60 gigabyte (GB) plads kræves pr. eksperiment (4 GB/brønd). Dog plads skøn er baseret på hardwarekonfiguration og skal bestemmes for hvert system.

2. protokol 1: Eksperimenterende Setup: forbereder diasset

1. Indsamle og forberede leverancer
   1. Dag i eksperimentet, samle forsyninger til plating celler på det dias, herunder en spand med is, en lille beholder med tøris, et par af saks og 20 μL pipette. Spray alle elementer med 70% ethanol, tør med papirservietter og placere elementer i en steril vævskultur hætte.
   2. Samle alle forsyninger opbevares ved 4 ° C (Se trin 1.2) herunder metalpladen, kasse med tips, dias og matrix. Spray tips æske med 70% ethanol og Placer boksen i beholder med tøris.
      Bemærk: Fjern matrix fra 4 ° C køleskab kun når du er klar til brug og altid holde matrix på is.
   3. Spray metalpladen med 70% ethanol og integrere det i isen i en isspand. Åbn pakken indeholder diasset, og Anbring diasset på metalpladen at holde det koldt.
2. Belastning matrix i diaset
   1. Angiv pipetten til 10 μL og fjerne spidsen fra kolde tip box med en pipette. Skære ca 1 cm fra slutningen af spidsen med saksen.
      Bemærk: snit vinkelret på spidsen for at reducere bobler i matrixen. Pipetten kan indstilles til en diskenhed lidt større end 10 μL redegøre for matrix stikning til indersiden af spidsen.
   2. Langsomt trække matrixen i pipette tip. Umiddelbart Placer pipette spidsen på midten af brønden. Blidt røre pipette tip til bunden af brønden og langsomt skubbe matrix ud.
      Bemærk: ikke over pipette, da dette vil forårsage bobler til at danne. Hvis en boble former, pop det samme med en lille spids.
   3. Diasset indeholder 15 individuelle brønde. Gentag det forrige trin for hver brønd. Bruge en ny pipette tip til hver brønd til at bevare sammenhængen og reducere matrix solidifying inde i spidsen.
   4. Når diaset er indlæst med alle brønde indeholdende matrix, Skub låget helt i diaset, og der inkuberes ved 37 ° C i 30-60 min, indtil matrixen størkner.
      Bemærk: Lad ikke matrixen tørre ud. Tilføje en lille mængde (2-3 mL) af PBS i fælles landbrugspolitik i en 50 mL konisk slange nær dias i inkubator til at reducere risikoen for matrix tørring.

3. protokol 2: Plating ECFCs på Matrix

1. Fjern tilhænger ECFCs fra vævskultur plader og indsamle i suspension
   1. Få vævskultur plader der indeholder ECFCs beklæde den foregående dag (se punkt 1.1.9). Opsug EGM2 medier og vaske tilhænger ECFCs gang med 7 mL PBS.
   2. Opsug PBS, tilsættes 2-3 mL trypsin og inkuberes vedhængende celler for 2-5 min ved 37 ° C.
   3. Umiddelbart efter inkubation, tilsættes 3 mL af EGM2 og afpipetteres op og ned at løsne alle vedhængende celler. Overføre cellesuspension til en 15 mL konisk slange.
   4. Gentag trin 3.1.1-3.1.3 de resterende tre ECFC prøver, indtil alle fire celle prøverne er indsamlet i suspension.
2. Forberede master mix
   1. Der centrifugeres alle prøver på 500 x g i 5 min ved stuetemperatur.
   2. Opsug supernatanten og genopslæmmes celle pellets i 1-2 mL af EGM2.
   3. Bland cellesuspension grundigt og fjerne et lille delprøve (20-40 μl) til optælling.
   4. Tilføj lige dele trypan blå til cellen alikvot og tilsæt 10 μl på en hemocytometer. Tæl antallet af celler i de fire primære kvadranter af hemocytometer.
      Bemærk: Brug begge sider af hemocytometer for alle prøven tæller til at øge nøjagtigheden.
   5. Ved hjælp af cellen tæller fra oven, beregne mængden af hver celle prøve, der indeholder 1.4x10⁴ celler. Bland alle celle suspensioner grundigt og alikvot 1,4 x 10⁴ celler ind i en frisk rør til at forberede en master mix for hver eksperimentelle betingelse. Tilføj EGM2 medier, så den endelige mængden af hver master mix er 175 μL.
   6. Bland hver master mix af forsigtigt pipettering og alikvot 50 μL af master mix i individuelle brønde på diaset.
      Bemærk: alle prøver er belagt i tre eksemplarer, med master mix beregnet til 3,5 wells at sikre tilstrækkeligt volumen til 3 brønde.
3. Inkuber diaset
   1. Inkuber dias ved 37 ° C, indtil det kan flyttes ind i mikroskop salen for billeddannelse.
      NOTE: Tid mellem plating og imaging bør være så kort som muligt at begrænse tab af data under de tidlige faser af vasculogenesis.

4. protokol 3: Mikroskop Setup og Image erhvervelse

Bemærk: For vores undersøgelser, protokoller 2 og 3 blev gennemført samtidigt af separate individer. Hvis protokoller 2 og 3 skal udfyldes af den samme person, skal protokol 3 trin 4.1 og 4.2 nedenfor udfyldes før indlede protokol 2 ovenfor.

1. Tænde mikroskopet og computer
   1. Ca. en til to timer før du starter eksperimentet, Tænd og Forvarm fase top inkubator til 37 ° C, sæt CO₂ til 5%, og Indstil fugtighed til 85%. Fyld den kuvøse fugtighed reservoir, hvis tom.
   2. Placer en tom chambered dias i en af de to åbne positioner, og fyld med destilleret vand. Sikre feedback termometer for kammer temperaturkontrol, hvis den er tilgængelig.
      Bemærk: Hvis feedback termometer er tilgængelig, bruger denne "inkubator temperatur" til at kontrollere, at salen har ekvilibreres.
   3. Drej på en sekundær blæser sat til 39-42 ° C varme dias fra neden og minimere kondens.
   4. Tilføje et andet dias som en tomme, indtil det eksperimentelle dias kan tilføjes. Dette dias fungerer som en placering pladsholder for konfiguration af indstillingerne billede erhvervelse for individuelle brønde under installationen.
   5. Tilsæt vand til reservoir omkring brøndene på det andet dias til at efterligne betingelserne under imaging eksperimentet. Vandet omkring brøndene muliggør vurdering af fugtighed under mikroskop setup og forvarmning.
      Bemærk: Før ækvilibrering fase-top inkubator og sekundære blæser er afgørende for at opretholde en stabil dyrkningsbaserede miljø. De fleste levende celle kammer controllere giver real-time feedback af temperatur, CO₂og fugt til at vurdere parathed af systemet. Før fortsætter, kontrollere for ophobning af fugt på diaset og overdreven tørring af reservoiret som udfyldt 4.1.5. Luftfugtighed skal muligvis justeres, hvis der er overdreven tørring eller kondens i salen. For at øge luftfugtigheden, tilføje klude chloroformvædet med destilleret vand. For at mindske kondens, enten sænke indstillingen fugtighed, som justeres i 4.1.1, eller som kondens kunne være et tegn på lav temperatur, tjekke kammer temperaturindstillinger og positionering af de sekundære blæser.
2. Konfigurere grundlæggende billede erhvervelse indstillinger under ækvilibrering.
   Bemærk: Image erhvervelse er konfigureret via software, der styrer fase, lukkertid og kamera. En flerdimensional setup værktøj er den letteste måde at konfigurere softwaren. Softwaren skal derudover have autofokus rutiner til at sikre fokus kontrol over varigheden af forsøget.
   1. Bruge softwaren til at indstille flere fase holdninger til hver brønd. For denne protokol, skal du vælge midten af brøndene.
   2. Konfigurere billede erhvervelse, således at hver fase position, godt hele er afbildet. For eksempel bruge en tilescan med 10-20% billede overlapning og ca 5 x 5 felter, afhængig af kameraet og endelige forstørrelse.
   3. Konfigurere tidsforskydning for imaging hver 15 min.
      Bemærk: Ved hjælp af den konfiguration, der er skitseret i denne protokol, er alle 15 brønde af diaset afbildet med en 15 min. interval.
3. Indlæse det eksperimentelle dias
   1. Efter ækvilibrering inkubator kammer, skal du erstatte den tomt dias med det eksperimentelle dias.
      Bemærk: en afbalancerede kammeret vil have stabil temperatur, CO₂og fugtighed i mindst 20 min. Når den eksperimenterende dias er klar, er det bydende nødvendigt, at trin er udført hurtigt for at minimere "dead-tid" mellem plating og det oprindelige tidspunkt fanget af mikroskopet. Desuden, for at lette sammenligningen mellem imaging eksperimenter, denne gang bør stemme overens. I disse eksperimenter kræves alle trinene i protokol 3 afsnit 4.3 ca. 30 min. at udfylde.
   2. Fjern dias låg og tilsæt vand til reservoir omkring brøndene på diaset.
      Bemærk: Låget er fjernet for varigheden af den billeddiagnostiske eksperiment.
4. Konfigurere endelige billede erhvervelse indstillinger
   1. Placer CFI planlægger Fluor DL 10 X mål i holdning og vælg Ph1 fase ring på kondensatoren. Med den første brønd i fokus, justere stien diaskopiske lys for Köhler belysning og konfigurere fase optik ved at kontrollere tilpasningen af fase ring i kondensatoren med objektive fase maske.
   2. Konfigurere eksponeringstiden og justere lampe intensitet for fasekontrast, som er typisk mindre end 500 ms.
   3. Cykle gennem hver fase holdning sæt i 4.2.1 og bekræfte, at midten af brønden er valgt, og justere det, hvis det er nødvendigt.
   4. På hver etape position, fokus på cellerne belagt i brønden og Indstil positionen fase z position anvendes til billedbehandling i softwaren.
   5. Test autofokus mekanisme for mikroskopet. Hvis autofokus er hardwarebaseret, sikre og ligger placeret korrekt for alle positioner, fase.
      Bemærk: modellen og fase kan glide lodret under eksperimentet, er det vigtigt, at softwaren tjekker autofokus på hver fase position og hvert tidspunkt at sikre pålidelige imaging i tid-løbet. Hvis det er muligt, bør en autofokus position bestemmes i den tidligere tidspunkt anvendes som udgangspunkt for den efterfølgende autofokus rutine. Denne måde løbende drift kan justeres nemt.
   6. Reducere eller slukke lysene i mikroskop værelse og starte den billeddiagnostiske eksperiment.

5. protokol 4: Billede forarbejdning og kinetisk analyse af Vasculogenesis (KAV)

1. Gemme billeder fra enkelte tidspunkter som en billedstak til hver brønd
   Bemærk: de fleste software til billedoptagelse kan eksportere flersidet TIFF (stakke) af tidsrækker. KAV er designet til at arbejde på datasæt, der kan omfatte flere tidspunkter. Således opstår analyse på hele billedet stakken for en given scene holdning. Hvis det er påkrævet, kan billedbehandling software importere enkelt billeder fra hvert tidspunkt at rekonstruere en billedstak.
2. Åbn billedbehandling software på computeren
3. Tilføje KAV til billedbehandling software
   1. Træk KAV fil fra en mappe i den grå bjælke i bunden af vinduet software. Klik 'Gem' for at føje programmet til listen.
4. Åbn billedstak skal analyseres
   1. Klik på 'filer' og derefter 'Åbne' gennem dropdown-menuen i billedbehandling software, eller træk billedfilen i den grå bjælke som i trin 5.3.1.
   2. Konvertere billederne til 8 bit ved at klikke på 'Billede', 'Skriv', '8 bit'.
5. Oprette en region af interesse (ROI)
   1. Åbn ROI Manager ved at klikke på 'Analysere' på værktøjslinjen. Vælg derefter 'Funktioner' efterfulgt af ' ROI Manager'.
   2. Opret en ny Investeringsafkast ved at klikke på cirkel eller rektangel markeringsværktøjerne i værktøjslinjen og trække det ønskede markeringsområdet på billedet. Klik på 'Tilføj' i vinduet ROI manager for at gemme denne form.
      Bemærk: En tidligere oprettet ROI kan åbnes ved at trække gemt ROIs (zip-mappe) i 'Træk og slip' bar til at åbne i Manager.
   3. Klik på etiketten ROI opført i ROI Manager til at se det på billedet.
      Bemærk: Hvis ROI ikke vises på billedet, oprette en anden ROI (enhver størrelse/form) og tilføje det til manager. Når begge ROIs vises på listen, klik på frem og tilbage mellem to og det ønskede Investeringsafkast vises på billedet.
   4. Juster ROI, hvis nødvendigt. Når ROI er på plads på billedet i det ønskede sted, gå til menuen og klik på 'Rediger' derefter 'Klar udenfor'. Dette vil slette billeddata uden for ROI (nyttigt for ikke-rektangulære figurer) for hvert billede i stakken.
      Bemærk: Du kan også klikke på 'Image' og 'Crop' Hvis du bruger en rectangularly formet ROI.
6. Kør KAV software
   1. Klik på 'Plug-ins' i menulinjen.
   2. Vælg 'Analysere netværket' Plug-in. Dette vil åbne et vindue med indstillinger til at ændre indstillingerne i plug-in'en.
   3. Ændre metoden tærskel ved hjælp af drop-down pil.
   4. Når alle de nødvendige indstillinger er valgt, skal du klikke på 'OK' for at starte softwarestøtte.
      Bemærk: Passende indstillinger bestemmes gennem visualisering af skelet og maske udleveringer genereret af KAV, er betegnende for accurary af softwaren til at identificere og skelne celler og netværk fra baggrunden i fase kontrast billede.
7. Gemme dataene i KAV-genereret
   1. Når plugin'et er færdig med analysen, vil to Vinduer pop-up på skærmen med en datatabel med numeriske værdier og en stak af sammenvoksede billeder skildrer skelet og maske udleveringer.
   2. Gem de numeriske værdier ved at navigere til det øverste venstre hjørne af datatabellen og klikke på 'Rediger' derefter 'Kopier' eller 'Cut' for at indsætte værdier i et excel-regneark.
   3. Klik på billedet for sammenvoksede skelet og maske. Gemme billedstak sammenvoksede skelet/maske som en Tagged Image File Format (TIFF) ved at klikke på «Fil,' 'Gem som,' «TIFF.»
   4. Gem den beskårne fasekontrast billede stack (oprettet ved hjælp af ROI) ved at klikke på «File,' 'Gem som,' «TIFF.»
   5. Klik på vinduet ROI Manager og vælg ROI bruges til at beskære billeder. Klik på 'Mere' efterfulgt af 'Gem' for at gemme ROI til fremtidig brug.
      Bemærk: Ved hjælp af den samme ROI vil hjælpe bevare konsistens på tværs af analyser.

Representative Results

KAV producerer visuelle repræsentationer af netværksstruktur
Kontrasten mellem ECFCs og matrix baggrunden i fase kontrast billeder giver KAV at identificere celle-specifikke strukturer. ECFC netværk identificeres af KAV er repræsenteret billedligt som skelet og maske udleveringer til at illustrere konstruktioner, der anvendes af softwaren til kvantificering (fig. 2A). Vigtigere, muliggør kvalitativ vurdering af skelet og maske udleveringer hurtig identifikation af KAV følsomhed og nøjagtighed, som kan være nyttige til at fastsætte indstillinger for optimal tærskelværdi og tolkning af analyse resultater. Når kvaliteten af fase kontrast billeder er høj og tilstrækkelig kontrast er opnået, identificerer KAV præcist ECFC netværk, som angivet af ligheden mellem fase kontrast billede og de KAV-genereret skelet og maske udleveringer (figur 2 A og Video 1).

Alternativt, hvis fase kontrast billeder ikke har høj kontrast og/eller artefakter af imaging som klods forekomme, netværk opdagelse nøjagtighed er reduceret og resultater bliver tvetydig (figur 2B). Derudover kan dannelsen af luftbobler i celle medier også skjule opdagelse nøjagtighed (figur 2). Dog kan problemer med billedkvaliteten ofte overvindes gennem valg af forskellige tærskel metoder indgår i KAV-software. For eksempel, blev fase kontrast billedet i figur 2B analyseret ved hjælp af identiske billede behandlingsindstillinger undtagen metoden tærskel. Fra skelet og maske udleveringer er det tydeligt at Otsu tærskel resulterede i en mere præcis registrering af de ECFC netværk vist i fase kontrast billede (fig. 2B). Billedkvaliteten er derfor afgørende for at opnå nøjagtige og meningsfulde resultater i denne analyse. Dog tillader forskellige tærskel metoder indgår i KAV-brugergrænseflade justering af billedanalyse baseret på kvaliteten af de input billeder.

Time-lapse mikroskopi identificerer kvalitative og kvantitative forskelle i ECFC vasculogenesis efter intrauterin svangerskabsuge diabetes mellitus eksponering
For nylig, den KAV analytiske tilgang blev anvendt til at vurdere fosterets ECFC funktion efter udsættelse for maternel type 2 diabetes mellitus (T2DM) i utero¹⁶. Hjælp KAV, ændrede kinetik af vasculogenesis blev identificeret i fostrets ECFCs udsat for T2DM. Men ud over T2DM eksponering, som opstår i hele den hele drægtighedsperioden, svangerskabsuge diabetes mellitus (GDM) eller udvikling af glukose intolerance almindeligt i tredje trimester af graviditeten, også forringer ECFC funktion¹³. Derfor, KAV blev anvendt til at bestemme, hvis GDM-eksponerede ECFCs også vise ændrede kinetik af ECFC netværk dannelse. Fase 1 (0-5 h) og fase 2 (5 + h) blev vurderet ved hjælp af tid bortfalder mikroskopi kombineret med KAV analyse (figur 3). Repræsentative fase kontrast billeder erhvervet ved starten af image erhvervelse (0,50 h) og hele tidsforløb (5,00 og 10.00 h) skildrer ECFC netværk dannelse i fire prøverne testet fra en enkelt eksperimenterende dag (figur 3 og Video 1 ). Trods tilsvarende celle lastning, som observeres i fase kontrast billeder på 0,50 timer, er kvalitative forskelle i netværksstruktur indlysende på 5,00 og 10,00-time tid point. ECFCs fra den ukomplicerede graviditet (UC) udgør en kompleks og indviklet netværk 5 timer efter forkromning, svarende til vores tidligere offentliggjorte data¹⁶. Derimod prøve ECFCs fra GDM 1 (GDM1) form meget få netværk strukturer ikke forbundne. Dette mønster er imidlertid ikke afspejles i alle ECFC prøver fra GDM graviditeter, vejledende af heterogenitet mellem prøver. Prøver GDM2 og pakken GDM3 vise større netværk dannelse i forhold til GDM1, selv om mønstre af tilslutningsmuligheder vises ændret i forhold til UC prøven. Vigtigere, måler KAV flere strukturelle komponenter af ECFC net til at identificere både indlysende og subtile fænotyper.

Ud over at generere skelet og maske udleveringer af netværksstruktur, quantitates KAV ti målinger af netværksstruktur, herunder antallet af individuelle netværksstrukturer, noder, triple-forgrenede noder, firedobbelt-forgrenede noder, grene, samlede filial længde, gennemsnitlige filial længde, gren til node ratio, total lukket netværk og netværk område¹⁶. KAV kompilerer dataene for hver enkelt prøve i en enkelt tabel med værdier for alle billeder selvfølgelig tid. Tabel 1 indeholder repræsentative rå data fra en billeddannelse undersøgelse for en ECFC prøve. Parametre af netværksstruktur målt af KAV er organiseret i kolonner, og data for sekventielle billeder erhvervet over tid er organiseret i rækker. For eksempel, i vores studier, billede 1 blev opnået 30 min efter plettering med efterfølgende billeder at være indsamlet hver 15 min. rå værdier dannet af KAV kan derefter grafen eller yderligere analyseres ved hjælp af mere komplekse statistiske nærmer sig¹⁶.

Fem grafer viser middelværdier af netværksstruktur fra tre særskilte forsøg er vist for en enkelt ukompliceret prøve (UC) og de tre GDM prøver (figur 4). UC prøven i disse forsøg udført tilsvarende tidligere analyseret UC prøver¹⁶. Tidligere blev det identificeret, ECFC vasculogenesis in vitro er bi-phasic, bestående af fase 1 (0 - 5 h) og fase 2 (5-10 h)¹⁶. Dette mønster er konsekvent i de aktuelle undersøgelser, som det fremgår af grafen skildrer lukket netværksdata (figur 4). UC prøven dannet et større antal lukkede netværk i forhold til alle tre af GDM prøver. Interessant, synes tre af de fire prøver at have en lignende tid til maksimal antallet af lukkede netværk, som opstår mellem 2,5 og 3 timer. GDM2 prøven var dog langsommere til at nå maksimal lukkede netværk, som opstod under 5 timer efter plating. Og trods den GDM2 prøve danner færre maksimal netværk i forhold til UC prøven, netværk det danner blev opretholdt på samme måde til UC prøven over tid. Omvendt, GDM1 og pakken GDM3, som dannes færre netværk i forhold til UC prøven, også udstillet en samlet reduktion i netværksnummer over tid. Samlet set fra grafen skildrer lukkede netværksnummer, det er indlysende, at alle ECFC prøver vises en bi-phasic mønster af netværk dannelse, men den dannelse og den maksimal antal net opnåede varierer på tværs af prøver.

Netværksområde repræsenterer den gennemsnitlige område inden for de lukkede net, dannet af ECFCs. Derfor, jo større det lukkede net nummer, jo mindre netværksområder. Dette mønster er afspejlet i de netværk områdediagrammer hvor UC-prøven, som dannede et større antal lukkede netværk, havde mindre netværksområder over tid i forhold til de tre GDM prøver (figur 4). GDM2, som nås maksimal lukkede netværk mere langsomt, udstillet høj netværksområde i første omgang, men området stabiliseret over tid, og dette var mest ligner UC prøven på 15 timer. Over tid øget området gennemsnitlige netværk i alle prøver på grund af netværk nedtrapning stabilisering. Men, nogle prøver, som GDM1 og pakken GDM3, udstillet en hurtigere stigning i netværksområde, hvilket er sandsynligt vejledende nedsat stabilitet i forhold til andre prøver, udstiller en mere gradvis stigning.

GDM-eksponerede ECFCs udviser reduceret netværk stabilitet
Forholdet mellem grene til noder er en roman fænotype beregnet af KAV og identificeret i vores tidligere undersøgelser, og dette er betegnende for netværk connectivity¹⁶. I den aktuelle undersøgelse havde UC prøven en lave gældskvote, der udgjorde et højt niveau af netværksforbindelse, der blev opretholdt over tid (figur 4). Omvendt, de tre GDM prøver havde en højere ratio af grene til noder, især i fase 2 med netværks dannelse. Denne observation viser reduceret connectivity og nedtrapning stabilisering af netværksstrukturer.

Samlet set dannes GDM1 færre noder og grene i forhold til de andre prøver, med den reduktion af vedligeholdes i løbet af eksperimentet. GDM2 og pakken GDM3 dannes og vedligeholdes et større antal grene i forhold til UC prøven, især mellem 5-15 h. Antallet af knudepunkter opdaget i GDM2 og pakken GDM3 netværkene var mere svarende til antallet af noder i UC stikprøven, især mellem 10-15 h. Et større antal grene, men et tilsvarende antal noder, kunne tegne sig for den øgede gren til node forholdet tydeligt i de senere tidspunkter i prøverne, GDM. Vigtigere, kan samtidige ændringer i gren og node antallet være vanskelige at fortolke i separate grafer. Men grenen roman til node forholdet tilbyder en måde at vurdere, hvordan ændringer, herunder ændringer vanskeligt at påvise i de enkelte grafer, i det både filial og node, resulterer i ændrede netværksforbindelsen.

Figur 1 : Skematisk skitserer 10 parametre kvantificeret af Kinetic analyse af Vasculogenesis (KAV). KAV quantitates ti særskilte parametre af netværksstruktur. Alle parametre er farvekodede og skitseret i skematiske numerisk (1-10). Parametre omfatter antallet af filialer (grøn, 1), lukket netværk (blå, 2), og noder (rød, 3), den gennemsnitlige netværksområde (orange, 4), antallet af netværksstrukturer (sort, 5), triple-forgrenede noder (gul, 6) og quad-forgrenede noder (lilla, 7), samt total (9) og (10) gren Gennemsnitslængde og forholdet mellem antallet af filialer til antallet af knudepunkter (10). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Kinetic analyse af Vasculogenesis (KAV) quantitates netværksstruktur. (A) skelet og maske udleveringer af netværksstrukturer identificeres af KAV ved hjælp af fase kontrast billeder giver visuel repræsentation af netværksstrukturer identificeres og kvantificeres ved KAV. Skalalinjen = 500 µm. (B) en repræsentativ fase kontrast billede af ECFC netværk 10 h efter plating, der har lav kontrast og gitter markerer fra sammenstrikke individuelle billeder. Forskellige tærskel metoder, som betyder eller Otsu, kan vælges i KAV plug-in til at forbedre kvantitering nøjagtighed, hvis fase kontrast billeder har lav kontrast eller hvis klods opstår. Skelet og maske udleveringer af fase kontrast billede er vist for både Mean og Otsu tærskel metoder. Fase kontrast billeder blev fanget ved hjælp af en 10 X mål. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Intrauterin GDM eksponering ændrer ECFC netværk dannelse. Billeder af ECFC netværk dannelse blev erobret med 15 min. intervaller for 15 h af fase kontrast mikroskopi. Repræsentative fase kontrast billeder på 5 h trin, begyndende på tidspunktet for plating (0,5 h), er vist for UC og tre prøver, GDM. Fase kontrast billeder blev fanget ved hjælp af en 10 X mål. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : ECFCs udsat for intrauterin GDM udstille ændret netværk dannelse kinetik. ECFCs blev fremstillet af en ukompliceret graviditet (UC, sort) og tre graviditeter kompliceres af gestationsalder diabetes mellitus (GDM 1-3, red). Fase kontrast billeder blev fanget på 15 min. intervaller for 15 h. Kinetic analyse af Vasculogenesis (KAV) software quantitated lukket netværk, netværksområder, grene, noder og forholdet mellem grene til noder. De data, der er illustreret repræsenterer gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM) af tre separate eksperimenter for hver prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Intrauterin GDM eksponering ændrer kinetik af ECFC netværk dannelse. Billeder af ECFC netværk dannelse blev erobret med 15 min. intervaller for 15 h af fase kontrast mikroskopi. Fase kontrast billeder er vist for UC og tre GDM prøver over 15 h starter ved 0,5 h. Skalalinjen repræsenterer 500 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Billede	Samlede filial netværk	Noder	Tredobler	Firedobler	Grene	Samlede filial længde *	AVG filial længde *	Gren til Node forholdet	Lukket netværk	Netværk område **
1	382	290	278	11	943	47210	124	3.25	9	480214
2	284	345	337	8	940	50699	179	2,72	16	264469
3	205	376	366	9	910	55728	272	2,42	27	150621
4	162	422	407	15	947	59692	368	2.24	40	98713
5	132	454	441	12	967	61923	469	2.13	53	72951
6	122	435	419	14	907	62587	513	2,09	68	56948
7	88	429	411	17	852	63983	727	1.99	74	51429
8	68	451	437	13	874	63960	941	1,94	74	51780
9	93	437	417	18	905	60901	655	2,07	49	82919
10	126	511	487	24	1075	61981	492	2.1	37	116857
11	49	397	384	12	737	61823	1262	1,86	79	48805
12	81	376	364	10	751	56817	701	2	63	64431
13	98	509	482	26	1028	60799	620	2.02	44	98056
14	93	449	416	31	909	58282	627	2.02	45	94081
* afrundes til nærmeste micron, ** afrundet til nærmeste micron ^ 2

Tabel 1: Repræsentative rå data fra en billeddannelse undersøgelse for et ECFC eksemplar.

Discussion

KAV muliggør evaluering af store datasæt med flere tidspunkter
Traditionelt har kvantitering af vasculogenesis in vitro- bestod af en enkelt eller et par gang punkt målinger. Denne statiske tilgang er simpelthen utilstrækkelige til at opfange og kvantificere en dynamisk og kompleks proces. Derfor, denne nye metode blev udviklet for at aktivere effektiv analyser af netværk dannelse kinetik at få indsigt i potentielle molekylære mekanismer involveret i den dynamiske proces med vasculogenesis. Effektivitet og automatisering er vigtige elementer i udviklingen af nye teknikker til at generere og analysere store mængder af billeddiagnostiske data. KAV blev udviklet specielt til at analysere store billedstakke består af hundredvis af billeder til at formindske den tid og arbejdskraft skal udlede biologisk meningsfulde konklusioner fra time-lapse datasæt. Vigtigere, KAV gennemfører billedbehandling og data generation i løbet af sekunder for lille (mindre end 100 billeder) billede stakke og minutter for større (mere end 100 billeder) billede stakke, hvilket resulterer i enestående effektivitet. Derudover muliggør data organisation i regneark af tid og parametre måles hurtige generation af grafisk præsentation og statistisk analyse.

Udfordringer i vellykket anvendelse af denne tilgang
Selv om dette assay indeholder forbedringer både image erhvervelse og analyse, kan nogle udfordringer hindre en vellykket gennemførelse. De fire vigtigste hindringer omfatter fugtighed stabilitet, timing præcision fra plating billede erhvervelse, software og hardware pålidelighed og forvaltning af store datasæt genereret for hvert forsøg. Stabil levende celle imaging over flere timer kan være udfordrende. Specifikt, kræves relevant og konsekvent befugtning for billeddiagnostiske afdelinger. Angiogenese dias er brugt i denne analyse, som er designet til parallelizing matrix-baserede angiogenese assays. Deres lav volumen, ca 50 µL, gør fordampning og kondensering betydelige overvejelser for udvidet kultur betingelser. For at bekæmpe denne eksperimentelle problem, er det nødvendigt at anvende en rugemaskine, der regulerer fugtighed. Det kan dog også være forpligtet til at forøge denne forordning, hvis overdreven tørring af imaging salen opstår over tid. Vi fandt, at det enkleste at øge luftfugtigheden er at øge vand areal i salen. For at opnå dette mål, vores protokol foreslår følgende tre vandkilder: et andet chambered dias fyldt med vand, som er også hvor inkubator temperaturen måles, vand i området omkring brøndene på dias, og fugtede filtrerpapir eller klude. Omvendt, kondens opstår når lufttemperaturen på værelset køler bunden af diaset og luftfugtighed inde i kammeret kondenserer på dias og brøndene. Denne komplikation kan føre til en udvanding af celle medier og en lensing effekt, der forstyrrer fasekontrast. I disse undersøgelser, blev kondens minimeret gennem anvendelse af opvarmet luft (39-42 ° C) på bunden af diaset.

En afgørende overvejelse for enhver time-lapse undersøgelse er sammenhængen mellem eksperiment indledning og billedbehandling. Tidspunktet for Hvornår imaging starter er kritisk fortolkning af downstream begivenheder. For at sikre timing præcisionen af denne analyse, bør tid mellem indledende plating og den første afbildet tidspunkt styres stramt. Denne "døde tid" kan minimeres i praksis, men endnu vigtigere, det skal være konsekvent at tillade eksperimenter på forskellige dage skal sammenlignes. For eksempel, i denne protokol forventer vi en døde tid på ca. 30 min.. Dette kan fremmes af nærhed af eksperimentelle forberedelse og imaging faciliteter.

Hvad kan synes som verdslige detaljer ved første øjekast er vigtige for software, hardware stabilitet og datastyring. Software og tilhørende hardware-drivere, netværksmiljø og automatiseret software opdateringer alle påvirker stabiliteten af softwaren. Det er værd at teste denne protokol i en "dry run" til at identificere flaskehalse og potentielle kilder til problemer i den billede erhvervelse for eksempel, kontrollere for upålidelige levende celle setup, fase, lukkertid og kamera pålidelighed og institutionelle information teknologi politikker på automatiseret operativsystem og programopdateringer.

Data management er en fortsat bekymring af enhver tænkelig eksperiment, der genererer hundreder til tusinder af billeder. Heldigvis, kommerciel software ofte kontrollerer for ledig plads før du starter en billeddannelse eksperiment. Denne analyse omfatter imidlertid også efter opsamling billedbehandling og analyse, der kan tilføje til skrap drive plads byrde og forstyrre imaging eksperimenter, hvis pladsen er begrænset. Yderligere, sikkerheden og stabiliteten i computeren kan ikke garanteres, selv med hardwareløsninger som en redundant array af identiske diske. Således er er et data management strategi for at sikre plads på computerens harddiske til igangværende forsøg og en robust remote arkivering, for eksempel med en institutionel arkivering ressource, nødvendige.

Strategier til at maksimere billedkvaliteten
Selv om KAV evne til præcist skelne ECFCs fra matrix baggrunden er robust, er følsomheden af analysen afhængig af billedkvaliteten. For eksempel, hvis billedet har lav kontrast, registrerer softwaren celle netværk med mindre nøjagtighed (figur 2B). Kvaliteten af fasekontrast er påvirket af flere faktorer, herunder indstillingerne for mikroskop bruges til billede erhvervelse, indlæsning af matrix og celle suspension medier under assay forberedelse og vedligeholdelse af medier niveauer i brøndene hele billeddannelse. For at optimere fasekontrast for disse assays, blev der foretaget mindre justeringer til fase ring justering i mikroskopet at forbedre kontrast. Derudover blev prøveforberedelse grundigt testet for at sikre lige og konsekvent medier lastning. Hvis mængden af matrix og/eller medie indlæses i brøndene er enten under eller over den optimale sortiment, kan en menisken danne fører til ændrede fasekontrast. Endelig, på grund af den lille mængde af flydende i brøndene, det er afgørende at opretholde medier ved at minimere fordampning og kondensering, som nævnt ovenfor. Samlet set er assay optimering afgørende for at skabe høj kvalitet kontrast billeder til analyse.

Ud over fase kontrast kvalitet, kan andre faktorer også indflydelse assay resultater herunder medier forurening, mangler i matrix, og partikler eller vragrester i matrix eller medier. Forurening er en fare i denne analyse, da det drejer sig om levende celle imaging over flere timer i en mikroskopi kammer. For at mindske risikoen for kontaminering, indlæses de matrix og celle suspensioner i diaset i en steril hætte. Derudover er hver prøve typisk forgyldt i to eller tre eksemplarer til et eksperiment at minimere risikoen for datatab på grund af uforudsete problemer som snavs eller partikler confounding analysen.

Prøven heterogenitet drev har brug for øget assay følsomhed
Heterogenitet er blevet observeret og rapporteret i tidligere undersøgelser af ECFCs udsat for GDM¹³. Et højt niveau af heterogenitet i cellefunktion observeret i disse prøver er spekuleret for at henføres til flere faktorer, herunder sværhedsgraden af moderens sygdom, varigheden af sygdom og ledelsesstil, der bruges til at regulere blodsukkerniveauet. Vigtigst, indfanger denne analytiske tilgang den dynamiske rækkevidde af ECFC vasculogenesis, hvilket gør det muligt at identificere fænotypiske forskelle på grund af funktionelle heterogenitet i prøver fra GDM graviditeter. Samlet set kan brug af primære patientprøver, som dem der bruges i disse undersøgelser, indføre større variation i forhold til en cellelinje. Som lægger større vægt på translationel undersøgelser der involverer flere primære dyrs eller menneskers prøver med funktionelle variabilitet, er assay følsomhed afgørende for registrering og afledning af biologisk meningsfuld målinger og konklusioner. Derfor, udvikling af metoder som KAV vil forbedre mængden og kvaliteten af data genereret af in vitro- vasculogenesis og angiogenese assays for at aktivere mere robust bemærkninger og konklusioner. Disse data vil desuden lette fremtidige undersøgelsen af underliggende molekylære mekanismer, der bidrager til ændrede ECFC vasculogenesis efter intrauterin GDM eksponering.

Fremtidige ansøgninger af denne tilgang
Selvom denne metode blev anvendt til at vurdere fosterets ECFC vasculogenesis in vitro- i disse undersøgelser, er de potentielle anvendelser af denne tilgang talrige. Denne teknik kan gennemføres let for at undersøge enhver celle befolkning, der deltager i processerne af vasculogenesis eller angiogenese. Specifikt, det kan bruges til at studere individuelle cellepopulationer, som blev demonstreret i denne undersøgelse, men det kunne også anvendes til fælles kultur systemer. I fremtiden vil det være gavnligt at udvide denne fremgangsmåde ud over todimensional i vitro assay at vurdere tredimensionale (3D) modeller. Selvom den aktuelle version af KAV ville være utilstrækkelig til quantitating 3D imaging data, ville en ligeledes designet time-lapse, multi parametrisk analytiske tilgang specifikt for 3D eller i vivo modeller informere hvis observationer foretaget i to-dimensioner in vitro- er repræsentant for cellefunktion i en mere biologisk relevante indstilling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Fisher	353003
15 mL conical tubes	Fisher	1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides	Ibidi	81506
Matrigel	Fisher (Corning)	354234
EGM2 Medium	Lonza	CC3162
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic	Fisher	MT30004C1	Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS	Fisher (Corning)	MT25052CI
Type 1 Collagen	Fisher (Corning)	354226	100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL.
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-212	Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM.
Kim Wipes	Fisher	06-666
Chambered slide	Ibidi	80296	This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher (Gibco)	20012027	1x solution, pH 7.2
Microscope	Nikon Instruments	MEA53100 and MEF55030	Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage	Prior Instruments	ProScan II	Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective	Nikon Instruments	93178	CFI Plan Fluor DL 10X
Camera	Hamamatsu	C11440-42U	ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower	Precision Controls	N/A	This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator	OKOLabs	H301	BoldLine including a two position slide holder
Computer	Hewlett-Packard	Z620 or equivalent	4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	AR v 4.20	ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis