Her presenterer vi en protokoll for tidsinnstilt bildebehandling og analyse av vasculogenesis i vitro bruker fase kontrast mikroskopi kombinert med åpen kildekode programvare, kinetisk analyse av Vasculogenesis. Denne protokollen kan brukes til å vurdere kvantitativt vasculogenic potensialet i mange celletyper eller eksperimentelle forhold som modell vaskulær sykdom.
Vasculogenesis er en kompleks prosess som stammen og stamfar endotelceller gjennomgå de novo fartøyet formasjon. Kvantitativ vurdering av vasculogenesis har blitt en sentral avlesning endoteliale progenitor celle funksjonalitet, og derfor flere forsøk er gjort for å forbedre både i vitro og vivo vasculogenesis modeller. Men er standard metoder begrenset i omfang, med statisk mål ikke å ta mange aspekter av denne svært dynamisk prosessen. Målet med utvikling av denne romanen protokollen var derfor å vurdere the kinetics av i vitro vasculogenesis for å quantitate nettverk dannelse og stabilisering, i tillegg til å gi innsikt i potensielle mekanismene bak vaskulære dysfunksjon. Anvendelsen av denne protokollen er demonstrert med fosterets endothelial kolonien danne celler (ECFCs) utsatt for mors diabetes mellitus. Føtal ECFCs var avledet fra navlestrengsblod etter fødselen, kultivert og belagt i lysbilder som inneholder kjelleren membran matrise, hvor de gjennomgikk vasculogenesis. Bilder av hele lysbildet ble kjøpt med time-lapse fase kontrast mikroskopi over 15 timer. Bildene ble analysert for avledning av kvantitative data benytter en analyseprogramvare alarmert kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV). KAV bruker bildesegmentering etterfulgt av skeletonization for å analysere nettverkskomponenter fra stabler av multi-tid punkt fase kontrast bilder å utlede ti parametere (9 målt, 1 beregnet) nettverk struktur inkludert: lukket nettverk, nettverksområder, noder, grener, totalt gren lengde, gjennomsnittlige armen lengde, trippel forgrenet noder, quad-forgrenet noder, nettverksstrukturer og avslaget til noden forholdet. Anvendelsen av denne protokollen identifisert endret priser på vasculogenesis i ECFCs fra svangerskap komplisert av diabetes mellitus. Men har denne teknikken brede implikasjoner utenfor omfanget rapporteres her. Gjennomføringen av denne tilnærmingen vil forbedre mekanistisk vurdering og forbedre funksjonelle readouts vasculogenesis og andre biologisk viktig forgrening prosesser i mange celletyper eller sykdom stater.
Evne til endoteliale progenitor celler å gjennomgå vasculogenesis eller de novo fartøyet formasjon, er viktig å etablere embryonale blodkar under utvikling1. Dessuten er ytterligere fartøyet dannelse og modning av eksisterende fartøyer, som er kjent som angiogenese, også en viktig prosess i utvikling og i postnatal liv opprettholde blodstrøm og homeostase hele kroppen2. Alle organer i kroppen er avhengig av det vaskulære systemet for levering av oksygen og næringsstoffer, og fjerning av avfall3. Hvis vaskulær homeostase ikke opprettholdes, slik at blod fartøy dannelse og reparasjon er utilstrekkelig eller i overkant, kan vascular sykdommer føre til4. Derfor er vaskulær dannelse og tilpasning vanligvis studert, som de er avgjørende for vedlikehold av orgel helse og er involvert i utviklingen av mange patologisk stater.
På grunn av en økt forståelse av involvering av vaskulære system i utvikling og i sykdom manifestasjon og fremdrift, er analyser utviklet modellen vasculogenesis og angiogenese i vitro og i vivo5 ,6,7. Modellering fartøyet formasjon innebærer plating vaskulære celler, for eksempel endotelceller, i kjelleren membran matrise som fremmer celle organisasjon og dannelse av fartøyet nettverk8,9,10. Vanligvis følgende overnatting inkubasjon bilder av cellen nettverk er fanget på et enkelt punkt, som resulterer i et lite antall bilder for analyse11,12,13. Derfor er analytiske metoder i stor grad utviklet og optimalisert for eneste gang punkt vurderinger10,14. Men statisk analyser er bare ikke nok på å fange dynamisk prosess av fartøyet formasjon og gi begrenset innsikt i potensielle mekanismene som er involvert. Selv om økende tenkelig frekvens ville trolig gi de nødvendige dataene for å identifisere formasjon kinetikk, ville anvendelse av tidligere utviklet analytics til et multi-tid punkt imaging tilnærming være ineffektiv og arbeidskraft intensiv14. I tillegg til tross for utviklingen av kommersielt tilgjengelig analyser gjengir en betal-per-image avgift dette alternativet kostnadseffektive uoverkommelige for kinetic studier der tusenvis av bilder er generert15. Derfor er det behov innen en strømlinjeformet og effektiv tilnærming til fange og kvantifisere vasculogenesis i vitro, inkludert muligheten til å analysere store bildet sett generert av time-lapse levende celle mikroskopi.
For å overvinne disse begrensningene, utviklet en ny tilnærming å utvide enkelt punkt imaging aktivere dynamiske vurdering av vasculogenesis med bilder kjøpt hver 15 min16. Ved å fange flere tidspunkt over adskillige timene, gir denne tilnærmingen en mer detaljert beskrivelse av prosessen med vasculogenesis, i tillegg til innsikt i potensielle mekanismer bidrar til dannelsen og vedlikeholdet av fartøyet nettverk. I tillegg til å forbedre frekvens og kvaliteten på bildeopptak, har denne romanen programvare i form av en åpen kildekode plugin17. Programvaren, referert til som kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV), er et strømlinjeformet program som inkorporerer bildebehandling og analyse for stort bilde sett fra multi-tid punkt oppkjøp. KAV analyserer fase kontrast bilder gjennom bildesegmentering etterfulgt av skeletonization18. Ti parametere av nettverkets struktur er kvantifisert ved KAV inkludert: grener, lukkede nettverk, noder, nettverksområder, nettverksstrukturer, trippel forgrenet noder, quad-forgrenet noder, totalt gren lengde, gjennomsnittlige armen lengde og avslaget til noden forholdet (se skjematisk i figur 1)16. Anvendelse av KAV tilnærmingen omfatter en roman, beregnede fenotypen av i vitro vasculogenesis, kalles avslaget til noden forholdet. Våre siste arbeid vist at dette forholdet antyder nettverkstilkobling og kan knyttes til andre cellulære prosesser i nettverket formasjonen, som motilitet16.
Selv om fosterets endothelial kolonien danne celle (ECFC) vasculogenesis ble vurdert i disse studiene, kan dette bilde oppkjøpet og analyse tilnærming lett brukes for å evaluere alle celletyper som gjennomgå vasculogenesis eller angiogenese. Denne tilnærmingen kan i tillegg brukes til å identifisere endret vaskulær funksjon som følge av en rekke patologisk stater, som gestational diabetes mellitus, som vist i disse studiene. Videre er kan denne metoden tilpasses for å vurdere nettverk dannelse og forgrening, som er viktige for andre biologisk relevante prosesser. Dermed er den potensielle virkningen av denne romanen gjelder unike biologiske systemer ennå skal fastsettes.
KAV gjør evaluering av store datasett med flere tidspunkt
Tradisjonelt har kvantifisering av vasculogenesis i vitro besto av ett eller få tid punktet mål. Denne statiske tilnærmingen er rett og slett utilstrekkelig for opptak og kvantifisere en dynamisk og kompleks prosess. Derfor ble denne romanen metoden utviklet for å muliggjøre effektiv analyser av nettverket formasjon kinetics å få innsikt i potensielle molekylære mekanismer involvert i dynamiske prosessen med vasculogenesis. Effektivitet og automatisering er viktige komponenter i utviklingen av nye teknikker for å generere og analysere store mengder bildebehandling data. KAV ble utviklet spesielt for å analysere store bildestakker bestående av hundrevis av avbildninger for å redusere tid og arbeid må utlede biologisk meningsfull konklusjoner fra time-lapse datasett. Viktigst, KAV gjennomfører bildebehandling og data generasjon i løpet av sekunder for små (mindre enn 100 bilder) image stabler og minutter for større (større enn 100 bilder) bildestakker, noe som resulterer i uovertruffen effektivitet. I tillegg kan organisering av data i regneark ved tid og målte parametere rask generasjon av grafisk fremstilling og statistisk analyse.
Utfordringer i bruk av denne tilnærmingen
Selv om denne analysen inkluderer forbedringer både bildeopptak og analyse, kan noen utfordringer hindre vellykket implementering. De fire viktigste hindringene inkluderer fuktighet stabilitet, timing presisjonsnivå plating bildeopptak, programvare og maskinvare pålitelighet og håndtering av store datasett som er generert for hvert eksperiment. Stabil levende celle imaging over flere timer kan være utfordrende. Spesielt kreves passende og konsekvent luftfukting for bildebehandling kamrene. Angiogenese lysbilder brukes i denne analysen, som er utformet for parallelizing matrix-baserte angiogenese analyser. Deres lavt volum, ca 50 µL, gjør fordampning og kondensasjon betydelige hensyn for utvidet kultur forhold. For å bekjempe problemet eksperimentelle, er det nødvendig å bruke en inkubator som regulerer fuktighet. Imidlertid kan det også være nødvendig å utvide denne forskriften hvis overdreven tørking av tenkelig kammeret oppstår over tid. Vi fant at den enkleste måten å øke luftfuktigheten er å øke vann areal i kammeret. For å oppnå dette målet, våre protokollen foreslår følgende tre vannkilder: en andre kamret lysbilde fylt med vann, som er også der inkubator temperaturen er målt, vann i området rundt brønnene på lysbilder og fuktet filter papir eller kluter. Derimot oppstår kondens når temperaturen i rommet kjøler bunnen av lysbildet og fuktighet inne i kammeret kondenserer på lysbildene og brønnene. Denne komplikasjonen kan føre til en fortynning av cellen media og lensing effekt som forstyrrer kontrasten. I disse studiene, var kondens minimert gjennom anvendelse av oppvarmet luft (39-42 ° C) på bunnen av lysbildet.
En viktig vurdering for en time-lapse studier er konsistens mellom eksperiment initiering og bildebehandling. Tidspunktet for når bildebehandling starter er avgjørende for tolkning av nedstrøms hendelser. For å sikre timing presisjonen for denne analysen, bør tiden mellom første plating og første fotografert gang punktet være strengt kontrollert. I praksis, denne “død tid” kan minimeres, men enda viktigere, det må være konsekvent å tillate eksperimenter på ulike dager skal sammenlignes. For eksempel i denne protokollen forventer vi en død tid på ca 30 min. Dette kan ordnes ved nærhet av eksperimentelle forberedelse og tenkelig fasiliteter.
Hva kan virke som detaljer ved første øyekast er viktig for programvare, maskinvare stabilitet og databehandling. Programvare og tilknyttet maskinvaredrivere, nettverk og automatisert programvare oppdaterer alle påvirker stabiliteten i programvaren. Det er verdt å teste denne protokollen i en”tørr” til å identifisere flaskehalser og potensielle kilder til problemer i bildeopptak; for eksempel, sjekk for upålitelige levende celle oppsett, scenen, nedleggelse og kamera pålitelighet og institusjonelle teknologi informasjonsbehandling for automatiserte operativsystemet og programvareoppdateringer.
Behandling er en pågående bekymring for enhver tenkelig eksperiment som genererer hundrevis til tusenvis av bilder. Heldigvis sjekker kommersiell programvare ofte for plass før du starter et tenkelig eksperiment. Denne analysen omfatter imidlertid også etter fangst bildebehandling og analyse kan legge til harddisk plass byrden og forstyrre imaging eksperimenter, hvis plass er begrenset. Videre, sikkerheten og stabiliteten på datamaskinen er ikke garantert, selv med hardware løsninger som redundant array of identiske disker. Dermed er en data management strategi for å sikre plass på datamaskinens harddisker for pågående eksperimenter og en robust ekstern arkivering med en institusjonell arkivering ressurs, nødvendig.
Strategier for å maksimere bildekvaliteten
Selv om muligheten for KAV å skjelne nøyaktig ECFCs fra matrisen bakgrunnen er robust, er følsomheten til analysen avhengig av bildekvalitet. For eksempel hvis bildet har lav kontrast, vil programvaren oppdage cellen nettverk med mindre nøyaktighet (figur 2B). Kvaliteten på kontrasten påvirkes av flere faktorer, inkludert innstillingene for mikroskopet brukes for bildeopptak, lasting av matrix og celle suspensjon media under analysen utarbeidelse og vedlikehold av media nivåer i brønnene gjennom bildebehandling. For å optimalisere kontrast for disse analyser, ble mindre justeringer til fase ring justering i mikroskopet gjort for å forbedre kontrasten. I tillegg ble prøve forberedelse grundig testet for å sikre lik og konsekvent lasting. Hvis mengden av matrix og/eller medier inn i brønnene er under eller over optimal området, kan en menisk danne fører til endrede kontrast. Til slutt, på grunn av liten volumet av væske i brønnene er det avgjørende å opprettholde media nivåer ved å minimere fordampning og kondensasjon, som nevnt ovenfor. Samlet er analysen optimalisering kritisk til å generere bilder med høy kvalitet kontrast for analyse.
I tillegg til fase kontrast kvalitet, kan andre faktorer påvirke analysen resultater inkludert media forurensning, feil i matrise, og partikler eller rusk i matrise eller media. Forurensning er en fare for denne analysen siden det innebærer levende celle imaging over flere timer i en mikroskopi kammer. For å redusere risikoen for forurensing, lastes matrise og celle suspensjoner inn i lysbildet på sterilt hette. I tillegg er hver prøve vanligvis belagt i to og tre eksemplarer for et eksperiment for å minimere risikoen av data forlis på grunn av uforutsette problemer som rusk eller partikler confounding analysen.
Eksempel heterogenitet stasjoner trenger for økt analysen følsomhet
Heterogenitet har blitt observert og rapportert i tidligere studier av ECFCs utsatt for GDM13. Høy heterogene i celle-funksjonen i disse prøvene er spekulert for å skyldes flere faktorer, inkludert alvorlighetsgraden av mors sykdom, varighet av sykdom og lederstil brukes til å regulere blodsukkernivået. Viktigere, fanger denne analytiske tilnærmingen dynamisk utvalg av ECFC vasculogenesis, noe som gjør det mulig å identifisere fenotypiske forskjellene skyldes funksjonelle heterogenitet i prøver fra GDM svangerskap. Generelt kan bruk av primære pasientprøvene, som de som brukes i disse studiene, introdusere større variasjon i forhold til en celle linje. Som legges større vekt på translational studier som involverer flere primære dyr eller human prøvene med funksjonell variasjon, er analysen følsomhet viktig for deteksjon og avledning av biologisk meningsfull målinger og konklusjoner. Derfor generert utviklingen av tilnærminger som KAV vil øke mengden og kvaliteten på data av i vitro vasculogenesis og angiogenese analyser for å aktivere mer robust observasjoner og konklusjoner. Videre vil disse dataene lette fremtidige undersøkelse av underliggende molekylære mekanismer som bidrar til endrede ECFC vasculogenesis etter intrauterine GDM eksponering.
Fremtidige anvendelser av denne tilnærmingen
Selv om denne metoden ble brukt til å vurdere føtal ECFC vasculogenesis i vitro i disse studiene, er den potensielle anvendelser av denne tilnærmingen mange. Denne teknikken kan gjennomføres lett for å studere noen celle befolkningen som deltar i prosessene av vasculogenesis eller angiogenese. Spesielt det kan brukes å studere enkelt celle populasjoner, slik det ble demonstrert i denne studien, men det kan også brukes på co kultur systemer. I fremtiden, ville det være gunstig å utvide denne tilnærmingen utover todimensjonal i vitro analysen å vurdere tredimensjonale (3D) modeller. Selv om gjeldende versjon av KAV ville være utilstrekkelig for quantitating 3D bildeprodukter data, vil en lignende utformet time-lapse, multi parametrisk analytisk tilnærming for 3D eller i vivo modeller informere om observasjoner gjort i to-dimensjoner i vitro er representant for celle-funksjonen i en mer biologisk innstillingen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass og Emily Sims (Angio BioCore ved Indiana University Simon Cancer Center) utmerket kundestøtte i avledet ECFC prøver. Forfatterne også erkjenner Dr. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder og Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) for akademisk debatt som Janice murer (Indiana University School of Medicine) for Administrativ støtte. Alle bilder ble utført på Indiana Center for biologisk mikroskopi, Indiana University School of Medicine. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 og U10 HD063094) og Riley Children’s Foundation. I tillegg ble denne publikasjonen gjort mulig med delvis støtte fra National hjerte, lunge og blod Institute for The National Institutes of Health under prisen # T32 HL007910.
100mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
15ml conical tubes | Fisher | 1495949B | |
Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium. |
0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL. |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM. |
Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10x |
Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |