Chromatine losheid lijkt te worden betrokken in het ontwikkelings potentieel van blastomeren. Het is echter niet bekend of chromatine losheid kan worden gebruikt als een betrouwbare index voor de ontwikkelings potentieel voor embryo’s. Hier, is een experimenteel systeem waarin chromatine losheid-geëvalueerd zygoten tot volledige termijn ontwikkelen kunnen beschreven.
Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben. Onlangs, chromatine losheid of openheid is aangetoond te worden betrokken in het potentieel van de celdifferentiatie van pluripotente embryonale stamcellen. Eerder werd gemeld dat in vergelijking met embryonale stamcellen, zygoten haven een uiterst losgedraaide chromatine-structuur, die haar relatie met hun totipotent duiden. Echter, tot nu toe, het niet is beantwoord of de structuur van deze uiterst losgemaakt/open chromatine belangrijk voor de embryonale ontwikkelings potentieel is. In de huidige studie, om te onderzoeken van deze hypothese, werd een experimenteel systeem welke zygoten die werden geanalyseerd door fluorescentie herstel na foto-bleken zich tot termijn zonder significante schade ontwikkelen kan ontwikkeld. Nog belangrijker is, moet dit experimenteel systeem alleen een kachel van thermos-plaat naast een confocale laser scanning microscoop. De bevindingen van deze studie suggereren dat herstel van de fluorescentie na foto-bleken analyse (FRAP) analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken of de moleculaire gebeurtenissen in zygotic chromatine belangrijk voor de ontwikkeling van de voldragen zijn.
Na de bevruchting, de structuur van de chromatine is dynamisch gewijzigd en zygotic chromatine structuur is dan uiteindelijk gevestigde1,2. Tijdens deze periode, in de vaderlijke pronuclei, is de dominante chromatine proteïne veranderde van tijdje in Histon. De resulterende chromatine is zeer verschillend van die van sperma en eicellen van de vrouw in verschillende punten (bijvoorbeeld, histone variant samenstelling, histone wijziging). Aldus wordt gevormde zygotic chromatine gezien als belangrijk voor de latere ontwikkeling van het embryo. Echter, ondanks pogingen om de details van de structuur van de chromatine zygotic onthullen over lange periodes, methoden voor de beoordeling van de kwaliteit van zygoten of te voorspellen hun voldragen ontwikkeling in het stadium van een cel door het analyseren van de structuur van de chromatine nooit geweest opgericht.
In de vorige studie, is het ontdekt dat zygoten een uiterst losgedraaide chromatine structuur3 hebben. Op dit moment de losheid van de chromatine of openheid wordt verondersteld te zijn een belangrijke factor voor celdifferentiatie potentieel in embryonale stamcellen (ES) cellen4. ES-cellen homogeniteit in de natuur geen vertonen, maar zijn nogal heterogene; in de kolonies van de cel van de ES verwerven sommige Transient een hogere differentiatie mogelijkheden vergelijkbaar met blastomeren van twee cellen fase embryo’s. Tijdens deze overgang in de twee-cel als staat cellen chromatine losheid in ES verandert in wat vergelijkbaar met twee-cel fase embryo’s5 is. Zo lijkt de chromatine losheid van belang voor celdifferentiatie potentieel en het is mogelijk dat uitgebreid open chromatine in zygoten is handig voor de evaluatie van zygotic ontwikkelings potentieel.
Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben omdat deze methode geschikt is voor verdere ontwikkeling en zelfs voldragen ontwikkeling6. Als een van de levende imaging methoden, is FRAP analyse gebruikt om te onderzoeken van de chromatine losheid in voor inplanting embryo’s en ES cellen3,4,5. Als zygotic chromatine losheid kan worden geanalyseerd zonder een schadelijk effect op voldragen ontwikkeling door FRAP analyse, kan het zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de kwaliteit van de embryo’s in het stadium van de één-cel. Echter zijn de effecten op voldragen ontwikkeling door deze experimentele methode niet onderzocht. Onlangs, een experimenteel systeem met behulp van FRAP te evalueren zygotic chromatine losheid werd ontwikkeld. Omdat dit een nieuwe waarnemingssysteem voor zygoten was, werd het genoemd als zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP beïnvloedde niet kritisch voldragen ontwikkeling en is elders7gemeld. In dit verslag, wordt het protocol voor deze experimentele methode beschreven.
Zoals geopenbaard in deze studie, veroorzaakt de analyse van de zFRAP geen kritische schade aan voldragen ontwikkeling, suggereert dat deze methode is een zeer nuttig instrument om te onthullen van de associatie tussen moleculaire gebeurtenissen en het embryonale ontwikkelings potentieel. Tijdens de herprogrammering, in de twee-cel als staat van ES-cellen, waardoor de differentiële potentieel van deze cellen zo hoog als die van twee cellen fase embryo’s wordt, verandert chromatine losheid in die vergelijkbaar zijn met t…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura en Kana Kishida voor kritische opmerkingen en technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het programma van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie voor het bevorderen van de hervorming van nationale universiteiten M.O.; de Society van Japan voor de bevordering van de wetenschap (16H 02593), Asada Science Foundation en de Stichting van de wetenschap van de Takeda aan T.W. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.
Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
Microforge | Narishige | MF-900 | |
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |