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Developmental Biology

Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term

doi: 10.3791/57068 Published: June 12, 2018

Summary

Scioltezza di cromatina sembra essere coinvolto nel potenziale inerente allo sviluppo dei blastomeri. Tuttavia, non è noto se scioltezza della cromatina può essere utilizzato come un indice affidabile per il potenziale di sviluppo per gli embrioni. Qui, è stato descritto un sistema sperimentale in cui zigoti scioltezza-valutata della cromatina possono sviluppare al termine completo.

Abstract

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l'analisi di eventi molecolari durante l'ontogenesi. Recentemente, la scioltezza della cromatina o apertura ha dimostrato di essere coinvolti nel potenziale differenziazione cellulare delle cellule staminali embrionali pluripotenti. Precedentemente è stato segnalato che confrontato con cellule staminali embrionali, zigoti harbor una struttura della cromatina estremamente allentata, suggerendo la sua associazione con la loro totipotenza. Tuttavia, fino ad ora, è non stato affrontato sia la struttura della cromatina estremamente allentata/Apri, è importante per il potenziale dello sviluppo embrionale. Nello studio presente, per esaminare questa ipotesi, è stato sviluppato un sistema sperimentale in cui zigoti che sono stati analizzati tramite fluorescenza recupero dopo lo sbiancamento foto può sviluppare a termine senza alcun danno significativo. D'importanza, questo sistema sperimentale deve solo thermos-piastra di riscaldamento oltre a un microscopio a scansione confocale del laser. I risultati di questo studio suggeriscono che il recupero fluorescenza dopo lo sbiancamento foto analisi (FRAP) analisi può essere utilizzato per studiare se gli eventi molecolari nella cromatina zygotic sono importanti per lo sviluppo di full-term.

Introduction

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Dopo la fecondazione, la struttura della cromatina è alterata in modo dinamico e struttura della cromatina zygotic è poi alla fine stabilito1,2. Durante questo periodo, nel paterni pronuclei, le proteine della cromatina dominante sono trasformata da protamina istone. La cromatina risultante è estremamente diversa da quella di spermatozoi e ovociti femminili in diversi punti (ad es., composizione variante dell'istone, modifica dell'istone). Così, formato della cromatina zygotic è pensata per essere importante per il successivo sviluppo embrionale. Tuttavia, nonostante gli sforzi per rivelare i dettagli della struttura della cromatina zygotic per lunghi periodi, non sono mai stati metodi per valutare la qualità degli zigoti o per predire il loro sviluppo di termine nella fase di un cella analizzando la loro struttura della cromatina stabilito.

Nello studio precedente, si è scoperto che zigoti hanno una struttura della cromatina estremamente allentata3. Attualmente, scioltezza della cromatina o apertura è creduta per essere un fattore importante per la differenziazione cellulare potenziale di cellule staminali embrionali (ES)4. Le cellule ES non esibiscono omogeneità nella natura, ma sono piuttosto eterogenee; nelle colonie di cellule ES, alcuni transitoriamente acquisire un maggiore potenziale di differenziazione paragonabile a blastomeri degli embrioni in fase due-cellula. Durante questa transizione in due-cellula come stato, scioltezza della cromatina in ES cellule si trasforma in che cosa è paragonabile con fase bicellulare embrioni5. Così, scioltezza di cromatina sembra essere importante per potenziale di differenziazione cellulare ed è possibile che ampiamente aperto della cromatina in zigoti è utile per la valutazione del potenziale inerente allo sviluppo zygotic.

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l'analisi di eventi molecolari durante l'ontogenesi in quanto questo metodo permette lo sviluppo successivo e anche pieno-termine sviluppo6. Come uno dei metodi di formazione immagine diretta, FRAP analisi sono stato utilizzato per esaminare la scioltezza della cromatina in embrioni preimpianto ed ES cellule3,4,5. Se scioltezza zygotic cromatina possa essere analizzato senza un effetto negativo sullo sviluppo di pieno-termine di FRAP analisi, può essere un valido strumento per la valutazione della qualità degli embrioni nella fase uno-cella. Tuttavia, non sono stati esaminati gli effetti sullo sviluppo di pieno-termine da questo metodo sperimentale. Recentemente, è stato sviluppato un sistema sperimentale utilizzando FRAP per valutare la scioltezza della cromatina zygotic. Perché questo era un nuovo sistema di osservazione per zigoti, esso è stato chiamato come zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP non ha colpito criticamente termine sviluppo è stato segnalato altrove7. In questo rapporto, il protocollo di questo metodo sperimentale è descritto.

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Protocol

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Questo studio è stato svolto in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Università di Yamanashi. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di esperimenti di animale dell'Università di Yamanashi (permesso numero: A24-50). Tutti gli interventi sono stati eseguiti in anestesia tribromoethanol, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza. Una panoramica illustrata delle procedure e l'orario sono mostrati in Figura 1 e tabella 1, rispettivamente.

1. preparazione di RNA messaggero (In Vitro trascrizione del mRNA di eGFP-H2B)

  1. Linearizzare 5 µ g di DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 modello con 30 U di non ho in 50 µ l a 37 ° C durante la notte.
  2. Raccogliere 1,5 µ l di DNA digerito per conferma se completamente digeriti mediante elettroforesi.
    1. Applicare 1,5 µ l e 3-5 µ l di DNA digerito con caricamento tintura nel pozzetto del gel di agarosio al 2%, rispettivamente e sottoposti ad elettroforesi.
      Nota: Se completamente digerito, si osserva una banda singola (circa 5 kb). DNA non digerito viene utilizzato come un controllo, che viene visualizzato in una posizione diversa.
  3. Aggiungere 151.5 µ l di ddH2O e 200 µ l di fenolo/cloroformio/isoamil alcool (25:24:1) per i restanti digerito il DNA.
    1. Mescolare energicamente dal vortice.
    2. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
  4. Recuperare il surnatante e quindi aggiungere 200 µ l di cloroformio.
    1. Mescolare energicamente dal vortice.
    2. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
  5. Recuperare il surnatante e quindi aggiungere 20 µ l di acetato di sodio 3M e 1,5 µ l di ethachinmate.
    1. Mescolare energicamente dal vortice.
    2. 550 µ l di etanolo al 100% e poi mescolare vigorosamente Vortex.
    3. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
    4. Scartare il surnatante e poi lavare il pellet con etanolo al 70%.
    5. Asciugare il pellet di evaporazione per 5-10 min.
  6. Sciogliere il DNA del plasmide precipitata in 8 µ l di acqua priva di nucleasi.
  7. Valutare la concentrazione di plasmide (concentrazione prevista è di circa 300-500 ng / µ l) con nanodrop seguendo le istruzioni del fabbricante.
  8. Eseguire trascrizione in vitro per mRNA codificante eGFP-H2B con 1 µ g di DNA purificato come un modello in 20 µ l di volume di reazione totale seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Dopo la trascrizione in vitro , aggiungere 36 μL di acqua poi recuperare 1,5 µ l da 56 µ l di mRNA sintetizzato per l'analisi mediante elettroforesi (come senza poli A).
  9. Eseguire tailing A poli per mRNA sintetizzato in un 100 µ l di reazione seguendo le istruzioni del produttore.
  10. Aggiungere 60 µ l di soluzione di precipitazione del cloruro di litio poli un mRNA munito di eGFP-H2B e poi mescolare vigorosamente.
    1. Raffreddare a-30 ° C per 30 min.
    2. Centrifugare a massima velocità per 15 min.
    3. Scartare il surnatante e poi lavare il pellet con etanolo al 70%.
    4. Asciugare il pellet di evaporazione per 5-10 min.
  11. Dissolva la pallina con 20 µ l di acqua priva di nucleasi di riscaldamento a 55 ° C per 30 min.
  12. Valutare la concentrazione del mRNA precipitato con nanodrop. Diluire a 500 ng / µ l con acqua priva di nucleasi e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
  13. Confermare la produzione di mRNA preferito; soggetti 1 µ l di mRNA con/senza (ottenuti in 1.8.1 e 1,12 passaggi, rispettivamente) poli una coda miscelata con 1,5 µ l di 0,1 mg/mL di bromuro di etidio e 3 µ l di colorante di caricamento del campione per l'analisi di elettroforesi. Volume applicata era 5,5 µ l.
    Nota: Se coda di Poly A è stata completata, la band spostata rispetto al mRNA senza poli una coda dovrebbe essere osservata (Figura 2A).

2. preparazione dei topi maschii di vasectomia

  1. Pesare i topi ICR maschii alle 8-12 mesi, utilizzando una scala di peso.
  2. Intraperitonealmente iniettare topi maschi con anestesia di 1.2% tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL.
    Nota: La quantità di anestesia dipende dalle dimensioni del mouse. Ad esempio, un mouse con un peso 40 g viene iniettato con 0,8 mL di anestesia tribromoethanol.
  3. Bagnate la bacca con etanolo al 70%.
  4. Fare un piccolo taglio (3-5 mm) sulla bacca e poi fare un'incisione sulla parete muscolare con l'aiuto di forbici.
    Nota: Forbici e pinze devono essere pulite con etanolo al 70% prima di iniziare l'intervento chirurgico.
  5. Afferrare un rilievo grasso con forcipe ed estrarla delicatamente. Poi, il testicolo ed il dotto deferente appaiono.
    Nota: Vaso deferente è un tubo a forma di U e con un vaso di sangue rosso.
  6. Legare il dotto deferente in due punti con suture chirurgiche e poi tagliare la parte centrale tra i punti vincolati.
  7. Spingere delicatamente indietro il rilievo grasso e testicolo nella bacca.
    1. Ripetere l'intervento chirurgico con il testicolo rimanente.
  8. Cucire la parete muscolare con due punti di sutura con sutura chirurgica.

3. IVF

  1. Iniettare 8 - 10 - settimana-vecchio B6D2F1 femminile (BDF1) topi intraperitonealmente con 7,5 IU gonadotropina corionica equina (eCG) e gonadotropina corionica umana (hCG) all'intervallo h 46-50.
  2. Preparare gocce di 300 µ l umano tubarica (HTF)8 mezzi fluidi per capacitazione e inseminazione 1 giorno prima della fecondazione in vitro in un piatto di 30 mm, coprire queste gocce con l'olio minerale sul banco di laboratorio e poi preincubate in un'incubatrice durante la notte.
  3. Sacrificare i topi ICR maschii stagionati di dislocazione cervicale. Sezionare cauda epididimo con un ago 27 G e raccogliere spermatozoo. Loro cultura per capacitazione a 300 µ l di media HTF per 1-2 h a 38 ° C.
  4. 16 h dopo l'iniezione di hCG, sacrificare super ovulati topi femminili di dislocazione cervicale. Trasferire il ampulla ovidotto in olio minerale accanto supporto HTF e poi tirare fuori cellule del cumulo e ovociti complessi da questa ampolla ovidotto da un ago 30-G nel mezzo preincubato inseminazione-HTF.
    Nota: Alcuni topi femminili non mostrano spesso ovulazione malgrado il trattamento di superovulazione. Ovidotto allargata ampolla è un segno di ovulazione.
  5. Dopo capacitazione, trasferimento 2-3 µ l dello spermatozoo capacitato in media di inseminazione-HTF in cui sono stati raccolti gli ovociti ovulated.
  6. 1 h dopo l'inseminazione, raccogliere gli zigoti fecondati e trattarli con ialuronidasi a 100 µ g/mL per 10 min in media9 CZB.
    Nota: Quando l'inseminazione viene eseguita correttamente, 1 h dopo l'inseminazione, gli zigoti fecondati con il corpo di polar 2nd sono osservati. Se lo sperma viene utilizzato meno o bassa qualità, si osservano solo poco zigoti con il corpo di polar 2nd . Inoltre, se molti spermatozoi vengono utilizzati per l'inseminazione, gamete si verifica. Corretta inseminazione conduce a zigoti con pronuclei maschile e femminile. Utilizzando questi criteri, è possibile trovare se l'inseminazione è fatto bene o no.
    1. Dopo il lavaggio nei media CZB, sottoporre gli zigoti con un secondo corpo polare a microiniezione con eGFP-H2B mRNA.

4. preparazione della camera e microiniezione pipette

  1. Diluire il RNA codifica eGFP-H2B utilizzando acqua priva di nucleasi per ottenere una concentrazione di 250 ng / µ l.
  2. Preparare 2-3 gocce di PVP-HTF eGFP-H2B gocce mRNA e 5-6 gocce di Hepes tamponata CZB (H-CZB) gocce sul piatto da 60 mm. Coprire queste gocce con olio minerale.
    Nota: Queste preparazioni possono essere eseguite sul banco di laboratorio. Non c'è nessun requisito per l'utilizzo mobile di flusso d'aria laminare.
  3. Tirare in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta (ad es., P = 500, calore = 825, pull = 30, vel = 120 e tempo = 200)
  4. Dopo aver rotto la punta della pipetta, piegare la pipetta di microiniezione di vetro tirato vicino alla punta (versione 300 µm indietro) a circa 30 ° utilizzando un microforge.

5. microiniezione

  1. Spegnere la piastra di riscaldamento sul palco del micromanipolatore per evitare l'uccisione degli zigoti con un piezo durante l'iniezione di mRNA.
  2. Lavare e rivestire l'interno di aghi per iniezione in HEPES-tamponata-HTF contenente 10% PVP (PVP-HTF).
  3. Raccogliere gli zigoti fecondati con un corpo di polar 2nd (Figura 2B) e trasferimento di zigoti di 20-25 sulla camera della fase microscopio collegata con un micromanipolatore.
  4. Riempire il mRNA diluita eGFP-H2B nei vasi capillari di vetro borosilicato dalle punte.
  5. Tenere lo zigote con una pipetta di supporto e quindi rompere la zona pellucida e la membrana citosolica con un azionamento piezoelettrico.
  6. Iniettare circa 10 pL di mRNA nel citoplasma degli zigoti. Finitura mRNA-iniezione entro 10 min per evitare danni causati da più coltura gli zigoti all'esterno dell'incubatrice.
    Nota: Il volume di iniezione deve essere grande quanto il corpo polare 2nd . Se la quantità di mRNA iniettato è troppo grande, è possibile causare la frazione libera eGFP-H2B, che può influenzare la frazione mobile.
  7. 10 min dopo microiniezione, lavare in almeno 3 gocce e poi cultura gli zigoti iniettati in CZB a 38 ° C fino all'analisi di zFRAP.

6. zFRAP analisi

  1. 1 h prima dell'analisi zFRAP, accendere il laser e la piastra calda associata alla fase del microscopio confocale. Impostare la temperatura a 38 ° C.
  2. Mettere 6-10 µ l di media tamponata HEPES CZB coperto con olio minerale sul piatto inferiore 60 mm vetro e caldo della stufa fino a collezione zigote.
  3. 8 - 12 h dopo l'inseminazione, raccogliere 5-10 che esprimono eGFP-H2B zigoti e trasferimento in 6-10 µ l di pre-riscaldati goccia media CZB tamponata HEPES.
    Nota: Per evitare la coltura più a lungo all'esterno dell'incubatrice, 5-10 che esprimono eGFP-H2B zigoti sono stati utilizzati a ogni analisi. 5 a 10 zigoti possono essere analizzati entro 1 h.
  4. Impostare le condizioni di formazione immagine e imbianchimento secondo le istruzioni del produttore. Il caso un laser confocale a scansione microscopio (Tabella materiali) è illustrato di seguito:
    1. Uso 60 X lente di olio (60 X 60 X / 1,35 olio).
      Nota: Lenti con maggiore sensibilità Visualizza ingrandimento (maggiore apertura numerica).
    2. Impostare la velocità di scansione come 4,0 µs/Pixel e dimensioni come "512" su "Impostazione di acquisizione" (Supplemental figura 1).
    3. Aumentare lo zoom digitale a "5" (Supplemental figura 1).
      Nota: Un alto livello zoom è necessario per riconoscere se deriva lo stato attivo si verifica o non.
    4. Aprire la lista di tintura (Supplemental figura 1) e scegliere "EGFP". Impostare il tempo di osservazione come 1.6 s (intervallo è impostato come "free run" impostazione) (Supplemental figura 1)
      Nota: Più punti di osservazione possono causare dati più dettagliati, ma esso può anche causare la fototossicità. Nell'analisi zFRAP, un tempo di osservazione s 1,6 sembra essere sufficiente a rilevare l'asimmetria dei genitori di scioltezza della cromatina.
    5. Impostare il numero di immagini come 12 in totale (Supplemental figura 1).
    6. Avviare il pannello di "Impostazione di stimolo" e quindi fare clic su "Main" su UseScanner. Impostare la velocità come 10.0 µs/Pixel di scansione. Fare clic su "Attivazione in serie" e quindi impostare MultiOEM come "3 fotogrammi" e tempo di attivazione come "5 sec" (Supplemental figura 1).
    7. Fare clic su "Focus x 2" e impostare lo stato attivo e quindi "Stop".
    8. Impostare lo sbiancamento e potere del laser di imaging (477 nm) a 110 e 15 µW, rispettivamente, di regolazione "gage potenza del laser" (Supplemental figura 1).
      Nota: Sbianca molto forte può causare una più grande zona sbiancata, che provoca difficoltà di analisi quantitativa. Per misurare la potenza del laser, utilizzare un misuratore di potenza. È importante confermare la potenza del laser per evitare l'effetto di deterioramento temporale della potenza del laser.
    9. Fare clic su "Clip Rect" (Supplemental figura 1) nel pannello di impostazione di stimolo. Impostare l'area di interesse (ROI; rosso; ROI #1B) come 40 x 40 pixel (7,6 µm2). Preparare una regione di riferimento (REF; verde; ROI n. 2) e uno sfondo (BG; blu; ROI n. 3) utilizzando "copia ROI" e "Incolla ROI" (tasto destro del mouse).
      Nota: Dimensione dei Pixel può essere impostato tramite "Gestione ROI", che può essere chiamato cliccando il tasto destro del mouse quando il cursore è sul ROI. ROIs più grandi sono pensati per essere migliore dato che consente di standardizzare la dispersione del Punteggio zFRAP. Tuttavia, troppo grande di un ROI non può essere utilizzato per questa analisi perché rende più difficile evitare il corpo di precursore del nucleolo (NPB). eGFP-H2B in questo comparto è stato pensato per essere liberi dalla cromatina e ha mostrato notevole mobilità superiore3. ROI e REF aree devono essere separati per quanto possibile. Se queste due regioni sono vicini, lo sbiancamento può colpire anche la regione del Rif.
    10. Fare clic su "Live" sulla barra degli strumenti e quindi avviare "Live Plot" (Supplemental figura 1).
      Nota: Live trama indica l'intensità del segnale di fluorescenza all'interno di ogni ROI e viene utilizzato per regolare la potenza del laser utilizzando HV. Nota che se ROI non è selezionata, nessuna intensità verrebbe rilevato sul pannello Live trama.
    11. Determinazione della posizione di ROI
      Nota: ROI può essere spostate trascinandole nella posizione desiderata in pronuclei. (1) essere sicuri di evitare il nucleolo e (2) inserire il ROI intero il nucleoplasma. Non contengono la regione di fuori della zona della membrana nucleare (citoplasma) in ROI. La localizzazione di eGFP-H2B altamente è limitata nel nucleoplasma, in modo che è facile da trovare se ROI contiene citoplasma o non con la fluorescenza di eGFP-H2B. Pronuclei maschili tendono ad essere più grandi di quelli delle femmine, che sono spesso localizzate vicino al corpo di polar 2nd . Durante l'utilizzo di questi criteri, giudicare i pronuclei maschili o femminili.
    12. Fare clic su "Focus x 2" (Supplemental figura 1) e quindi regolare il calibro di potere HV del canale per EGFP in intensità di fluorescenza a circa 2000 (l'intensità di fluorescenza può essere visto nella finestra "stampa diretta").
  5. Fare clic su "Time" e quindi "XY" (Supplemental figura 1) per avviare l'analisi di zFRAP.
    Nota: Se opportunamente è selezionato il pulsante di "Tempo", "t" viene visualizzato sul pulsante di "XY".
    1. Fare clic su "Serie fatto" (Supplemental figura 1), che compare dopo FRAP imaging vicino a pulsante"XY" e quindi ottenere dati analizzati FRAP.
    2. Salvare il file "2D immagine vista XXXXX" come un file denominato preferito (oib. formato di file) di "Salva come" (Ctrl + Maiusc + S può essere anche usato).
    3. Selezionare ROI, REF e BG e quindi fare clic su (Ctrl + A può essere usato anche) "Analisi delle serie" nella finestra "immagine 2D della vista".
    4. Ottenere i dati FRAP riga e quindi fare clic su "Salva" pulsante nella finestra del grafico dal vivo.
      Nota: Riga dati quantitativi FRAP viene salvati come file csv.
  6. Per nessun controllo di zFRAP, mettere alcuni degli zigoti iniettati con mRNA sulla goccia, che è vicino al cerchio i fondo dei piatti di vetro per evitare l'effetto dall'osservazione in fluorescenza.

7. dati calcolo

  1. Durante l'utilizzo i dati quantitativi ottenuti, rendere il grafico della "curva di recupero" e "frazione mobile" di Excel, come illustrato in riferimenti3,7 con alcune modifiche (Vedi qui sotto e supplementari file excel).
  2. Calcolare l'intensità relativa sottraendo il valore di BG da quelli di ROI e REF in 12 immagini per ogni punto di tempo.
  3. Dividere il valore del ROI per che la Ref. Di conseguenza, può essere ottenuto 12 gol di intensità relativa standardizzata in ogni momento.
  4. Calcolare la media del punteggio relativo per il ROI in 3 immagini scattate prima foto lo sbiancamento.
  5. Calcolare il tasso di recupero. Dividere che i 12 ottenuti relativi punteggi per ROI nelle immagini scattate in ogni punto del tempo (ottenuto a 7.1.2.) dalla media del punteggio relativo prima foto dello sbiancamento (ottenuto a 7.1.3.). Disegnare la curva di recupero con l'utilizzo di questi punteggi (Figura 2E).
  6. Calcolare il tasso d'imbianchimento.
    Nota: Lo sbiancamento tasso (%) = 100 - tasso di recupero di immagine 4th .
  7. Calcolare la frazione mobile (MF) utilizzando la formula come segue10,11,12
    MF (%) = 12th tasso di recupero (al punto finale) - Tasso di recupero 4th / candeggio tasso × 100.

8. embriotransfer

  1. Accoppiano femmine ICR stagionate in 8-12 mesi con topi ICR maschii vasectomia la notte prima di trasferire l'embrione consentendo loro di essere nella stessa gabbia durante la notte.
  2. Raccogliere gli embrioni che sono stati analizzati zFRAP e determinata a sviluppare alla fase due-cellula.
  3. Intraperitonealmente iniettare topi femminili con anestesia di 1.2% tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL o con 0,35 - 0,45 mL di 0.75/4/5mg/kg medetomidina/midazolam/butorfanolo mista agenti prima del trasferimento dell'embrione.
    Nota: Il volume dell'anestesia è determinato dal peso del corpo dei topi. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g di peso corporeo; medetomidina/midazolam/butorfanolo miscelati agenti: 0,1 mL/10 g di peso corporeo.
    1. Trasferire questi embrioni in fase due-cellula in ovidotti dei topi ICR femminili pseudopregnant con un plug vaginale al coitum dell'alberino di 0,5 giorni (dpc).
    2. Dopo il trasferimento embrionario, mettere i topi femminili sul riscaldatore impostato a 37 ° C fino a quando si svegliano.
  4. Al 18,5 dpc, sacrificare la madre surrogata di dislocazione cervicale e recuperare i cuccioli derivati da zigoti zFRAP-analizzati dalla sezione cesarean. Alcuni dei cuccioli recuperati sono stati consegnati per la madre adottiva e del loro peso corporeo sono stato valutato ogni settimana.

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Representative Results

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zFRAP analisi con eGFP-H2B

Prodotto correttamente mRNA codificante eGFP-H2B, che è visto come una band spostata causato da poli una coda (Figura 2A), è stato iniettato nel citoplasma degli zigoti con un 2 ° corpo polare a 1-3 h dopo l'inseminazione (Figura 2B). Otto a 12 h dopo l'inseminazione, zigoti con 2 pronuclei mostrando l'espressione di eGFP-H2B sono stati raccolti e sottoposti ad analisi zFRAP (Figura 2). L'analisi FRAP è costituito da passaggi di candeggio e recupero. Nella fase di pre-sbiancamento, il segnale di eGFP-H2B potrebbe essere osservato (Figura 2D-1), ma una volta sbiancato, il segnale è diminuito ad un livello trascurabile (Figura 2D-2). Se lo sbiancamento è stato completato, un buco nero grande quanto il ROI è comparso presto dopo lo sbiancamento. Dopo lo sbiancamento, l'intensità del segnale di fluorescenza di eGFP-H2B recuperato leggermente; il segnale fluorescente, gradualmente aumentata a causa l'afflusso della frazione greggia di eGFP-H2B nella ROI dall'area greggio nel nucleoplasma (Figura 2D-3). Per la conferma del successo di analisi zFRAP di scioltezza della cromatina, è consigliabile utilizzare parentale asimmetria di scioltezza della cromatina; pronuclei maschile ha mostrato una curva di recupero più veloce e più mobile frazioni rispetto a quelli delle femmine (Figura 2E e F). Dopo l'analisi di zFRAP, lavati e colture zigoti in media CZB, potrebbe svilupparsi alla fase blastocisti senza danni significativi (Figura 2 e H). Anche se fortemente sbiancato per un tempo più lungo, gli zigoti potrebbero svilupparsi ancora in allo stadio di blastocisti pure7.

Analisi dello sviluppo degli zigoti analizzati zFRAP termine

Per analizzare lo sviluppo di pieno-termine di embrioni ottenuti da zFRAP-analizzato zigoti, embrioni nella fase due-cellula sono stati trasferiti in ovidotti delle madri pseudopregnant. Come controlli, embrioni intatti e uno iniettato con mRNA ma non zFRAP-analizzati sono stati preparati. Il tasso di natalità degli embrioni zFRAP-analizzati (41,0%) era leggermente ma significativamente inferiore a quello degli embrioni intatti (62,2%), ma era lo stesso di quello di nessun controllo zFRAP (52,6%) (Tabella 2). Così, zFRAP-analisi sembra essere leggermente dannoso per lo sviluppo embrionale di pieno-termine. Tuttavia, d'importanza, i cuccioli derivato da zFRAP-analizzato zigoti sembrati sani e sviluppato completamente (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Un'illustrazione schematica del flusso delle procedure per gli esperimenti. Fecondazione in vitro : appena prelevato metafase II (MII) ovociti sono stati inseminati con spermatozoi capacitati. In vitro trascrizione: RNA messaggero (mRNA) codifica fusi con eGFP istone H2B (eGFP-H2B) sono stati trascritti dal promotore SP6 del pTOPO-eGFP-H2B linearizzato3 con non ho. il mRNA di eGFP-H2B sottoposto purificazione e poi tailing A poli. Il mRNA purificata eGFP-H2B è utilizzato in iniezione di mRNA. iniezione di mRNA: il mRNA di preparati eGFP-H2B è iniettato nel citoplasma degli zigoti con 2nd polar corpo. zFRAP analisi: gli zigoti che esprimono eGFP-H2B sono stati sottoposti ad analisi di zFRAP. La regione di interesse (ROI; rettangolo rosso) era sbiancata con un laser forte e poi il segnale di eGFP-H2B è diminuito ad un livello trascurabile. Dopo lo sbiancamento, l'intensità del segnale eGFP-H2B gradualmente aumentata. In vitro sviluppo: Dopo l'analisi di zFRAP, gli zigoti potrebbero svilupparsi in stadio di blastocisti. Trasferimento dell'embrione: in fase di due celle, gli embrioni zFRAP-analizzati sono stati trasferiti in ovidotti dei topi femminili pseudopregnant. 18 giorni più tardi, sani cuccioli dal vivo potrebbero essere ottenuti da embrioni zFRAP-analizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: analisi zFRAP degli zigoti con eGFP-H2B. (A) immagine rappresentativa del mRNA adeguatamente preparati da in vitro trascrizione e poly A coda. Lane 1: pre-poli una coda; corsia 2: pubblicare la coda di poli A. (B) mRNA codificante eGFP-H2B è stato iniettato nel citoplasma degli zigoti con un'inseminazione di post h 1-3 di 2nd corpo polare (hpi). Barra della scala = 25 µm (C) che esprimono eGFP-H2B zigoti sono stati raccolti a 8-12 hpi. Asterischi bianchi mostrano nucleolo precursore corpi (NPB). Barra della scala = 10 µm (D) espressione di eGFP-H2B è stato rilevato nell'intero nucleoplasma anche in NPB nella fase pre-sbiancamento (D-1), subito dopo lo sbiancamento (D-2) e dopo il recupero (D-3). Sono indicate le membrane nucleari (linee bianche tratteggiate) e NPB (asterischi). Barra della scala = 10 µm. curva di recupero (E, F) e mobile frazioni sono state ottenute da 45 zigoti in 5 esperimenti indipendenti. Blu e rosso indicano maschili e femminili, rispettivamente. Nelle curve di recupero, singoli cerchi indicano il punto di misura. Nei grafici a dispersione, singoli punti indicano il punteggio del mobile frazioni ottenute da pronuclei. (G) immagini rappresentative dello sviluppo preimpianto degli zigoti zFRAP-analizzati sono mostrati. Due celle, 4-8 cellule e blastocisti stadio embrioni a 24, 48 e 96 hpi, rispettivamente. Il cerchio giallo indica la blastocisti ben sviluppata. Il blastocisti sono allargato e mostrato sul pannello di destra. Barra della scala = 100 µm. Bar (H) il grafico dei tassi dello sviluppo degli embrioni zFRAP-analizzati. Le barre indicano embrioni analizzati zFRAP (zFRAP) (bianchi) e controllano (neri) di embrioni iniettati con mRNA ma nessuna analisi di zFRAP (non zFRAP). I dati indicati sono da tre esperimenti indipendenti, esaminare almeno 57 embrioni in totale. Due celle, 4-8 cellule, morula (Mo) e fasi di blastocisti (Bl) sono stati osservati a 24, 48, 72 e 96 hpi, rispettivamente. Questa figura è stata modificata da [Ooga et al 2017]7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: la crescita sana dei cuccioli derivato dagli zigoti FRAP-analizzati. (A) le foto dei cuccioli derivati da zFRAP-analizzato zigoti vengono visualizzate. (B) crescita normale è stata osservata durante l'allattamento dei cuccioli zFRAP-analizzati. (C) il grafico indica che il peso dei cuccioli derivate da embrioni intatti (blu), controllo greggi embrioni (rosso) e zFRAP-analizzati gli embrioni (verde). Corporei di 29 cuccioli derivati da embrioni intatti, 24 da embrioni di n-zFRAP e 15 da embrioni zFRAP-analizzati su un periodo di 8 settimane. Valori indicati da un asterisco sono significativamente differenti dal controllo intatto. Questa figura è stata modificata da [Ooga et al 2017]7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare figura 1: interfaccia utente grafica per l'analisi FRAP. (A) una panoramica dell'interfaccia utente grafica è stata indicata. (B) allargata immagini per ogni finestra sono stati indicati. (1) dell'impostazione della acquisizione finestra viene utilizzata per impostare la condizione di acquisizione immagine. (2) finestra del stimolo impostazione viene utilizzato per impostare la condizione di imbianchimento. Questa finestra possa essere aperti facendo clic sul pulsante nella finestra di acquisizione immagine. (3) il controllo di acquisizione immagine finestra viene utilizzata per l'analisi FRAP. (4) la Live View mostra l'immagine presente (l'immagine presente compare dopo aver cliccato il pulsante XY o Focus x2). I rettangoli blu rossi, verdi e luce mostrano il ROI (regione d'interesse), REF (riferimenti) e BG (sfondo), rispettivamente. (5) la vista 2D mostra l'immagine di FRAP-analizzati e compare dopo aver cliccato il "serie fatto" pulsante. In questo caso, un pronucleo maschile FRAP-analizzato è indicato come un esempio. Tre rettangoli con 8 punti indicano che queste regioni siano selezionate. (6) il complotto di Live Mostra l'intensità della fluorescenza presenti in ogni regione. Gli assi X e Y indicano tempo (ms) e l'intensità di fluorescenza, rispettivamente. (7) la serie analisi mostra le tracce di intensità di fluorescenza in ogni regione e compare dopo aver cliccato il pulsante serie analisi sulla finestra di visualizzazione 2D. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Excel File 1: esempio di dati ed elaborare i dati. (Foglio 1) Viene mostrato un dati di esempio per un pronucleo maschile. Lol indica il numero progressivo dell'immagine. Le intensità di riga per ogni regione (ROI, Ref e BG) sono state indicate. (Foglio 2) È riportato un esempio per il calcolo di dati. Protocollo numero indica i posti corrispondenti nella sezione protocollo. Note di spiegano il significato di ogni punteggio. La formula numerica può essere deferita facendo le cellule. Vengono illustrati esempi di curva di recupero e grafico a barre mobile frazione. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Giorno -3 Giorno -2 Giorno -1 Giorno di FRAP Giorno + 1 Giorno + 3 Giorno + 19
preparazione di mRNA Plasmide modello taglio
(tutta la notte)
1). plasmide modello purificazione
2). la trascrizione In vitro
3). poli In vitro una coda
4). controllo di qualità di mRNA mediante elettroforesi
FRAP 1). preparazione della pipetta di manipolazione e camera
2). iniezione di mRNA
3). analisi di zFRAP
4). calcolo della curva di recupero e mobile frazione* 2
Fecondazione in vitro e analisi dello sviluppo pre-impianto iniezione di eCG 1). iniezione di hCG 1). capacitazione spermatica
2). pre-incubazione dei media (HTF) 2). la fecondazione In vitro
Preparazione dei supporti (HTF, CZB, H-CZB e PVP-CZB) 3). valutazione sviluppo preimpianto
Trasferimento dell'embrione Preparazione di pseudopregnant femmina
(accoppiamento con vasectomia maschio* 1)
Trasferimento di embrioni in fase 2 celle a pseudopregnant donna Valutazione del tasso di natalità
* 1: topo maschio vasectomia deve essere preparata almeno 2 settimane prima dell'accoppiamento
* 2: calcolo può essere prolungata fino al giorno successivo (giorno + 1)

Tabella 1: tabella dei tempi degli esperimenti. Il giorno dell'analisi FRAP è considerato come giorno 0. gli esperimenti che devono essere eseguiti sono indicati nei rispettivi giorni per ogni elemento.

Categorie Lol degli zigoti iniettati Lol degli zigoti recuperati dopo l'iniezione di mRNA (%) * Lol degli zigoti analizzati Lol di trasferito Lol di destinatari Lol Cuccioli (%) * * * Peso dei cuccioli (g) Lol dei cuccioli transgenici
embrioni in fase 2 celle (%) * *
Intatto - - 99 98 (99,0) 9 61 (62,2)un 1.64±0.02 n. d
Nessun FRAP 420 398 (94,8) 82 78 (95,1) 7 41 (52,6)a,b 1.66±0.03 n. d
FRAP 79 78 (98,7) 7 32 (41.0)b 1.69±0.03 0
*: calcolato dividendo con no. degli zigoti iniettati; * *: calcolato dividendo con no. degli zigoti analizzati; : calcolato dividendo con no. di embrioni trasferiti fase 2-cell. a, b: apici indicano differenza significativa (P < 0,05). n. d: non determinato. Questa tabella è stata modificata da [Ooga et al 2017]7.

Tabella 2: il tasso di natalità degli embrioni analizzati: È stato esaminato il potenziale inerente allo sviluppo degli embrioni, che era stato analizzato FRAP, di pieno-termine. Il tasso di natalità ottenuto di questi embrioni è mostrato. Come controlli, intatti e senza embrioni FRAP-analizzato inoltre sono stati esaminati. I pesi dei cuccioli derivati da questi embrioni trasferiti sono mostrati come bene.

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Discussion

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Come rivelato in questo studio, l'analisi di zFRAP non causa danni critici al termine sviluppo, suggerendo che questo metodo è uno strumento molto utile per rivelare l'associazione tra eventi molecolari e il potenziale dello sviluppo embrionale. Durante la riprogrammazione, in due-cellula come stato di cellule ES, da cui il potenziale differenziale di quelle cellule diventa alto quanto quello di embrioni in fase bicellulare, scioltezza di cromatina cambia in quello paragonabile con fase bicellulare embrioni5. Di conseguenza, è possibile che scioltezza di cromatina zygotic è importante per il potenziale dello sviluppo embrionale. I nuclei di cellule somatiche trasferito nel citoplasma degli ovociti ha mostrato inferiore scioltezza di cromatina paragonato non solo pronuclei paterni, ma anche materne pronuclei, suggerendo che la mancanza della cromatina aperta acquisizione in zigoti trasferimento nucleare di cellule somatiche è coinvolti nella loro scarso potenziale di sviluppo. Collettivamente, l'analisi di zFRAP sembra essere utile per il delucidamento genoma meccanismi di riprogrammazione.

Il sistema zFRAP può renderlo possibile selezionare zigoti con alto potenziale di sviluppo. Nello studio preliminare, oltre a SCNT, fu rivelato che turno iniezione spermatid (ROSI)-derivato zigoti harbor cromatina anormale scioltezza. Inoltre, è stato trovato che alcuni di loro hanno mostrato scioltezza di cromatina a livello paragonabile a IVF-derivato zigoti pure, suggerendo che questi zigoti presentano un alto potenziale di sviluppo. D'importanza, zigoti di cui cromatina scioltezza è stata valutata da zFRAP potrebbero svilupparsi a termine. In futuro, pertanto, può essere possibile distinguere gli zigoti SCNT - e ROSI-derivati con più alto potenziale di sviluppo da quelle più basse dalla valutazione di scioltezza della cromatina di zFRAP.

Ad oggi, studi precedenti hanno dimostrato l'utilità del metodo di imaging dal vivo per l'analisi dello stato epigenetico in embrioni preimpianto. Alcuni dei metodi di formazione immagini diretta può rivelare ogni modificazione epigenetica (es. modifica di DNA/istone) in embrioni di preimplantation13,14, ma utilizzando zFRAP, è possibile valutare la scioltezza di cromatina zygotic senza uccidere le cellule. Scioltezza di cromatina sembra essere influenzata da modificazioni epigenetiche. Ad esempio, eterocromatina in cui modificazione epigenetica repressiva come H3K9me3 e H3K27me3 sono arricchiti ha mostrato inferiore dell'istone mobilità di regione euchromatic3,15. Infatti, il trattamento con un residuo chimico, che converte stato epigenetico, ha causato l'alterazione di scioltezza della cromatina in zigoti. Pertanto, utilizzando zFRAP, è possibile rivelare lo stato epigenetico sommativa della struttura della cromatina. Si è pensato che questo sarebbe un vantaggio per valutare il potenziale inerente allo sviluppo degli zigoti.

L'iniezione di mRNA codificante eGFP-H2B per zFRAP ha un demerito, ma aumenta la versatilità del zFRAP. Il demerito dell'iniezione mRNA è il danno causato dal microinjection. Per evitare questo, è molto efficace utilizzare il topo transgenico eGFP-H2B. Se viene utilizzata la linea di topo transgenico eGFP-H2B, il tasso di prole può essere aumentato rispetto al caso di utilizzo di microiniezione di mRNA. Al contrario, è il merito dell'iniezione di mRNA che zFRAP permette l'uso di qualsiasi tipo di ceppo di topi wild-type. I ricercatori che desiderano utilizzare zFRAP con il loro interesse del ceppo del mouse non è necessario preparare il ceppo del mouse desiderato con eGFP-H2B transgene. Questo merito diventa più prominente nell'analisi dei transgenici (ad es. sovraespressione/atterramento) o linea di mouse di knockout. I ricercatori che desiderano utilizzare zFRAP per loro argomenti di ricerca con la linea transgenica/Ko non è necessario preparare la linea transgenico eGFP-H2B da un numero limitato di loro interesse quelli. Questo indica un vantaggio per la progressione della ricerca.

Analisi live imaging con embrioni preimpianto richiede la conoscenza specializzata e molto costosi e finemente sintonizzati dispositivi specializzati. Di conseguenza, un'introduzione di un sistema sperimentale di questo tipo non è una decisione facile. Il sistema sperimentale che si instaura in questo studio ha bisogno solo un termo-riscaldatore a parte un microscopio a scansione confocale del laser. Inoltre, il metodo di apprendimento è facile in modo che un principiante in un laboratorio può imparare il metodo di zFRAP entro 1 mese. Tuttavia, ci sono alcune questioni che devono ancora considerazione. In primo luogo è stato attivo deriva. Durante l'osservazione, è possibile che i pronuclei o gli zigoti discostano dalla posizione dove hanno presentato prima dell'inizio di osservazione. Se si verifica la deriva di messa a fuoco, ROIs benissimo anche nella posizione corretta. Di conseguenza, dati quantitativi diventano inutili. Per evitare questo problema, il ricercatore deve utilizzare il coperchio i fondo dei piatti di vetro per la protezione contro la finestra del condizionatore d'aria e attendere per l'espansione di olio sopra la lente dell'obiettivo. In caso di deriva di messa a fuoco, dati dagli zigoti deviazione devono essere scartati e un'analisi FRAP 2nd con gli zigoti stessi non è raccomandata. In questo studio, accorciando il tempo di osservazione da 150 s3 a circa 25 s7 era molto disponibile. In secondo luogo è più lunga incubazione all'esterno dell'incubatrice. Poiché più lunga esposizione all'ambiente esterno dell'incubatrice è sicuramente nocivo per lo sviluppo embrionale, è stato consigliato di finire la FRAP-analisi entro 1 h per ogni batch. Il numero degli zigoti FRAP-analizzati in un media tamponata HEPES sui piatti di vetro inferiore dovrebbe essere 6-10. In questa condizione sperimentale, il numero massimo è di circa 30 per 4 h, ma se sono necessari più zigoti, 20 zigoti a h possono essere analizzati rinviando la valutazione dell'intensità di fluorescenza nella regione di riferimento e sfondo. In terzo luogo è "temporali deterioramento del laser della microscopia confocale laser". Se il laser sbianca è insufficiente, non è possibile ottenere i dati quantitativi corretti a causa di candeggio insufficiente. Infatti, l'asimmetria dei genitori di scioltezza zygotic cromatina non può essere acquisito con un laser sbianca debole. Per evitare questo problema, si consiglia di controllare se la potenza del laser ha indebolito come si presenterà l'occasione. In questo studio, 110-µW imbianchimento è stato sufficiente per l'acquisizione di asimmetria dei genitori.

analisi di zFRAP possono essere utilizzato per altri tipi di proteine, oltre a istoni di nucleo. Poiché gli istoni nucleo mostrano prominentemente scarsa mobilità, più totale tempo di osservazione (circa 25 s in questo studio) è necessaria l'analisi di zFRAP. Pertanto, per analizzare un numero considerevole di zigoti, coltura media tamponata HEPES sul riscaldatore per lungo tempo è inevitabile. D'altra parte, per l'analisi di zFRAP di proteine high mobility, il tempo totale di osservazione può essere impostato breve, consentendo il tempo di coltura media tamponata HEPES della stufa di essere breve. Pertanto, poiché la più lunga esposizione all'ambiente esterno dell'incubatrice è altamente dannoso per lo sviluppo embrionale, analisi zFRAP per proteine diverse da istoni di nucleo, che hanno un'elevata mobilità per natura, sembrano mostrare tossicità inferiore rispetto gli istoni di nucleo . Si spera che questo sistema sperimentale aiuterà ulteriormente l'indagine delle relazioni tra vari eventi molecolari e lo sviluppo embrionale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida per fornire supporto tecnico e commenti critici. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia programma per promuovere la riforma delle università nazionali al modus operandi; la società giapponese per la promozione della scienza (16h 02593), Asada Science Foundation e la Fondazione di scienza di Takeda a T.W. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

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References

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Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term
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Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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