Summary

Fluorescenza zygotic recupero dopo lo sbiancamento foto analisi per scioltezza di cromatina che permette lo sviluppo di Full-term

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

Scioltezza di cromatina sembra essere coinvolto nel potenziale inerente allo sviluppo dei blastomeri. Tuttavia, non è noto se scioltezza della cromatina può essere utilizzato come un indice affidabile per il potenziale di sviluppo per gli embrioni. Qui, è stato descritto un sistema sperimentale in cui zigoti scioltezza-valutata della cromatina possono sviluppare al termine completo.

Abstract

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l’analisi di eventi molecolari durante l’ontogenesi. Recentemente, la scioltezza della cromatina o apertura ha dimostrato di essere coinvolti nel potenziale differenziazione cellulare delle cellule staminali embrionali pluripotenti. Precedentemente è stato segnalato che confrontato con cellule staminali embrionali, zigoti harbor una struttura della cromatina estremamente allentata, suggerendo la sua associazione con la loro totipotenza. Tuttavia, fino ad ora, è non stato affrontato sia la struttura della cromatina estremamente allentata/Apri, è importante per il potenziale dello sviluppo embrionale. Nello studio presente, per esaminare questa ipotesi, è stato sviluppato un sistema sperimentale in cui zigoti che sono stati analizzati tramite fluorescenza recupero dopo lo sbiancamento foto può sviluppare a termine senza alcun danno significativo. D’importanza, questo sistema sperimentale deve solo thermos-piastra di riscaldamento oltre a un microscopio a scansione confocale del laser. I risultati di questo studio suggeriscono che il recupero fluorescenza dopo lo sbiancamento foto analisi (FRAP) analisi può essere utilizzato per studiare se gli eventi molecolari nella cromatina zygotic sono importanti per lo sviluppo di full-term.

Introduction

Dopo la fecondazione, la struttura della cromatina è alterata in modo dinamico e struttura della cromatina zygotic è poi alla fine stabilito1,2. Durante questo periodo, nel paterni pronuclei, le proteine della cromatina dominante sono trasformata da protamina istone. La cromatina risultante è estremamente diversa da quella di spermatozoi e ovociti femminili in diversi punti (ad es., composizione variante dell’istone, modifica dell’istone). Così, formato della cromatina zygotic è pensata per essere importante per il successivo sviluppo embrionale. Tuttavia, nonostante gli sforzi per rivelare i dettagli della struttura della cromatina zygotic per lunghi periodi, non sono mai stati metodi per valutare la qualità degli zigoti o per predire il loro sviluppo di termine nella fase di un cella analizzando la loro struttura della cromatina stabilito.

Nello studio precedente, si è scoperto che zigoti hanno una struttura della cromatina estremamente allentata3. Attualmente, scioltezza della cromatina o apertura è creduta per essere un fattore importante per la differenziazione cellulare potenziale di cellule staminali embrionali (ES)4. Le cellule ES non esibiscono omogeneità nella natura, ma sono piuttosto eterogenee; nelle colonie di cellule ES, alcuni transitoriamente acquisire un maggiore potenziale di differenziazione paragonabile a blastomeri degli embrioni in fase due-cellula. Durante questa transizione in due-cellula come stato, scioltezza della cromatina in ES cellule si trasforma in che cosa è paragonabile con fase bicellulare embrioni5. Così, scioltezza di cromatina sembra essere importante per potenziale di differenziazione cellulare ed è possibile che ampiamente aperto della cromatina in zigoti è utile per la valutazione del potenziale inerente allo sviluppo zygotic.

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento che permette l’analisi di eventi molecolari durante l’ontogenesi in quanto questo metodo permette lo sviluppo successivo e anche pieno-termine sviluppo6. Come uno dei metodi di formazione immagine diretta, FRAP analisi sono stato utilizzato per esaminare la scioltezza della cromatina in embrioni preimpianto ed ES cellule3,4,5. Se scioltezza zygotic cromatina possa essere analizzato senza un effetto negativo sullo sviluppo di pieno-termine di FRAP analisi, può essere un valido strumento per la valutazione della qualità degli embrioni nella fase uno-cella. Tuttavia, non sono stati esaminati gli effetti sullo sviluppo di pieno-termine da questo metodo sperimentale. Recentemente, è stato sviluppato un sistema sperimentale utilizzando FRAP per valutare la scioltezza della cromatina zygotic. Perché questo era un nuovo sistema di osservazione per zigoti, esso è stato chiamato come zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP non ha colpito criticamente termine sviluppo è stato segnalato altrove7. In questo rapporto, il protocollo di questo metodo sperimentale è descritto.

Protocol

Questo studio è stato svolto in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio dell’Università di Yamanashi. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di esperimenti di animale dell’Università di Yamanashi (permesso numero: A24-50). Tutti gli interventi sono stati eseguiti in anestesia tribromoethanol, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza. Una panoramica illustrata delle procedure e l’orario sono mostrati in <strong clas…

Representative Results

zFRAP analisi con eGFP-H2B Prodotto correttamente mRNA codificante eGFP-H2B, che è visto come una band spostata causato da poli una coda (Figura 2A), è stato iniettato nel citoplasma degli zigoti con un 2 ° corpo polare a 1-3 h dopo l’inseminazione (Figura 2B). Otto a 12 h dopo l’inseminazione, zigoti con 2 pronuclei mostrando l’espressione di eGFP-H2B sono stati raccol…

Discussion

Come rivelato in questo studio, l’analisi di zFRAP non causa danni critici al termine sviluppo, suggerendo che questo metodo è uno strumento molto utile per rivelare l’associazione tra eventi molecolari e il potenziale dello sviluppo embrionale. Durante la riprogrammazione, in due-cellula come stato di cellule ES, da cui il potenziale differenziale di quelle cellule diventa alto quanto quello di embrioni in fase bicellulare, scioltezza di cromatina cambia in quello paragonabile con fase bicellulare embrioni<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida per fornire supporto tecnico e commenti critici. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia programma per promuovere la riforma delle università nazionali al modus operandi; la società giapponese per la promozione della scienza (16h 02593), Asada Science Foundation e la Fondazione di scienza di Takeda a T.W. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Materials

Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

References

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Cite This Article
Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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